The Serial Anesthesia Array for the High-Throughput Investigation of Volatile Agents Using Drosophila melanogaster

L'esistenza di effetti anestetici collaterali (cioè effetti che non sono immediatamente osservabili ma possono avere conseguenze comportamentali ritardate) è generalmente accettata, ma la comprensione dei loro meccanismi e fattori di rischio rimane rudimentale ^1,2. La loro manifestazione ritardata e la loro sottigliezza limitano il numero di variabili potenzialmente importanti che possono essere studiate nei modelli di mammiferi in tempi ragionevoli e ad un costo accettabile. Il moscerino della frutta (Drosophila melanogaster) offre vantaggi unici nel contesto della malattia neurodegenerativa³ e per lo screening tossicologico⁴ che non sono stati, ad oggi, applicati allo studio degli effetti collaterali anestetici.

Abbiamo sviluppato il serial anesthesia array (SAA) per facilitare l'uso dei moscerini della frutta nello studio della farmacodinamica anestetica e della farmacogenetica. Un vantaggio chiave della SAA è l'esposizione simultanea a condizioni sperimentali identiche di più coorti. Se abbinato alla flessibilità sperimentale dei moscerini della frutta, l'elevata produttività della SAA consente l'esplorazione di variabili biologiche e ambientali su una scala impossibile nei modelli di mammiferi.

In linea di principio, il SAA è semplicemente una serie di luoghi anestetizzanti collegati (camere fatte di fiale da 50 ml) attraverso le quali un gas vettore rilascia agenti volatili. La prima camera del sistema contiene acqua distillata attraverso la quale viene umidificato il gas di trasporto (le mosche sono sensibili alla disidratazione) e termina con un semplice indicatore di flusso che indica il flusso di gas attraverso il sistema. Reti sottili poste sulle aperture dei tubi di collegamento separano le camere per impedire la migrazione delle mosche tra le camere. Il numero di posizioni "in serie" è limitato dalla resistenza al flusso di gas non pressurizzato (tubi, reti).

Abbiamo caratterizzato la cinetica di questo prototipo SAA in una precedente pubblicazione⁵. Sebbene le esatte proprietà farmacocinetiche varino tra i SAA, le basi rilevanti che sono state testate sperimentalmente sono le seguenti: (i) un flusso iniziale di 1,5-2 L/min equilibra tutte le camere (volume totale di ±550 ml) con la concentrazione desiderata di anestetico entro 2 minuti; ii) la concentrazione di vapore anestetico erogato alle camere non cambia sensibilmente tra la prima e l'ultima posizione, poiché la quantità di anestetico contenuta nel volume di gas in una singola camera (50 ml) supera di gran lunga la quantità assorbita da un numero qualsiasi di mosche; e (iii) una volta che le camere si sono equilibrate, il flusso di gas di trasporto può essere ridotto (50-100 ml / min o meno) per evitare sprechi e contaminazione dell'ambiente (gli anestetici volatili hanno proprietà di gas serra). Il flusso minimo necessario per mantenere una concentrazione stazionaria di vapore dipende principalmente dalla perdita del SAA, poiché l'assorbimento di vapore da parte delle mosche è trascurabile. In queste condizioni standard (2% di isoflurano e 1,5 L/min di flusso di gas di trasporto), le mosche sono anestetizzate, cioè immobili) in tutte le posizioni dell'array entro 3-4 minuti, con differenze impercettibili tra le posizioni. I VGA possono essere somministrati per minuti o ore e i nostri paradigmi di esposizione tipici sono compresi tra 15 minuti e 2 ore. Per lavare il sistema, il vaporizzatore viene spento e il flusso viene mantenuto per scambiare circa 10 volumi dell'array (1,5 L / min per 5 minuti). La velocità di eliminazione dell'anestetico varierà con la velocità di flusso impostata.

Gli agenti anestetici volatili interagiscono con numerosi bersagli ancora non identificati, incluso il sistema immuno-infiammatorio⁶. Il contributo dei singoli bersagli molecolari agli esiti primari rispetto a quelli collaterali (lo "stato anestetico" rispetto agli "effetti collaterali" a lungo e breve termine) è poco compreso. Pertanto, un sistema di mosca sensibile e ad alto rendimento è prezioso per informare gli esperimenti negli animali superiori, nonostante le ovvie differenze tra mosche e mammiferi⁷. Alcune differenze possono, infatti, essere vantaggiose; Ad esempio, il sistema immunitario della mosca differisce da quello degli animali superiori in quanto manca del braccio adattativo della risposta⁸. Sebbene questo possa sembrare un limite per la comprensione della malattia negli esseri umani, offre un'opportunità unica per studiare l'interazione dei VGA con la risposta immuno-infiammatoria innata in isolamento dalla risposta adattativa⁹. Ciò consente di studiare gli effetti farmacologici dei VGA sull'infiammazione e la loro modulazione da parte dei vari background genetici presenti in una popolazione.

NOTA: vedere la tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali utilizzati nel protocollo.

1. Costruzione dell'ASA

1. Realizzate il telaio tagliando il legno e assemblandolo utilizzando le quote indicate nella Figura 1A.
2. Modificare i tappi conici dei tubi da 50 ml.
   1. Praticare due fori in ciascun cappuccio con una punta da 9/32 pollici. Carteggiare i fori per pulire la plastica lacera. Carteggiare la parte superiore del cappuccio per irruvidire la superficie (questo aiuta con l'adesione della colla).
   2. Tagliare 5 mL di pipette sierologiche a misura (3 in per l'afflusso e 1,5 in per il deflusso) incidendo la plastica e quindi rompendola pulita sulla linea segnata. Carteggiare le estremità delle pipette tagliate/rotte.
   3. Incollare la rete ai tubi (consentire il corretto tempo di asciugatura per l'adesivo). Tagliare la rete alle dimensioni del tubo dopo che l'adesivo si asciuga.
   4. Inserire i tubi nei fori dei cappucci conici con entrambi i tubi che si estendono (3/4 in) sopra il tappo; assicurarsi che il tubo di afflusso si estenda più a lungo nel tubo rispetto al deflusso (Figura 1B).
   5. Applicare la colla sulla parte superiore dei tappi attorno ai tubi per fissare le parti insieme (lasciare il tempo di asciugatura adeguato per l'adesivo prima di continuare).
3. Fissate i tappi al telaio e instradate il tubo (Figura 1C).
   1. Fissare i lacci dei cavi adesivi al telaio (3,25 in distanziamento, da centro a centro).
   2. Fissare i tappi al telaio utilizzando fascette zip; Taglia corto il tag della cravatta con zip.
   3. Tagliare e collegare le lunghezze (9 pollici) dei tubi Tygon ai tubi di afflusso/deflusso su ciascun tappo modificato (Figura 1D). A partire dall'estremità a monte, collegare prima all'afflusso e quindi successivamente collegare i tubi dal deflusso all'afflusso della posizione successiva.
   4. Aggiungere un indicatore di flusso al "flusso" più a valle (posizione 10, Figura 1E).
   5. Mettere un tubo conico da 50 mL nella prima posizione e riempirlo con acqua appena sotto il tubo di afflusso (Figura 1F).
4. Preparare l'interfacciamento per il vaporizzatore. Rimuovere gli stantuffi, tagliare le tacche da due siringhe erogatrici da 10 ml (1/2 di profondità x 1/4 di larghezza, Figura 1G) e inserirle nell'afflusso e nel deflusso del vaporizzatore con le tacche rivolte direttamente verso la parte anteriore del vaporizzatore per allinearsi con i fori (Figura 1H). Facoltativo: incollare le siringhe modificate in posizione. Se conveniente, utilizzare un collettore commerciale (vedere la tabella dei materiali per un'opzione).
5. Collega l'intero sistema. Utilizzare i tubi Tygon per collegare i componenti insieme nel seguente ordine: serbatoio del gas di trasporto con regolatore > misuratore di portata specifico per gas > vaporizzatore > SAA (Figura 1C).
6. Riempire le posizioni vuote sull'array con tubi conici vuoti da 50 ml. Accendere il serbatoio del gas, aprire il flussometro a ~ 2 L / min e accendere il vaporizzatore allo 0%. Confermare il flusso di gas attraverso il sistema controllando il flussometro a monte del vaporizzatore e l'indicatore di flusso a valle dell'ultima camera del SAA per il flusso. In alternativa, inserire l'estremità del tubo a valle nell'acqua e cercare le bolle.
   NOTA: Poiché il sistema non è pressurizzato, una colonna d'acqua più alta di un paio di centimetri interromperà il flusso. Se non c'è flusso all'estremità a valle dell'array, controllare quanto segue: il vaporizzatore deve essere acceso per consentire il flusso; controllare che il regolatore del serbatoio e i misuratori di portata consentano il flusso; controllare le posizioni dell'array per assicurarsi che i tubi siano avvitati saldamente; e verificare la presenza di perdite intorno all'adesivo sui tappi modificati.

Figura 1: Costruzione dell'ASA. (A) Schema, con misure, del telaio in legno che sostiene l'ASA. (B) Sezione schematizzata, con misurazioni, di un tappo modificato con tubi di afflusso e deflusso costituiti da pipette sierologiche da 5 ml. (C) SAA assemblato (riprodotto da Olufs et ^al.5) (D) Dettagli di un tappo conico modificato da 50 mL che mostra i tubi di afflusso e di deflusso. (E) Deflusso a valle (posizione 10) con l'indicatore di flusso. (F) Tubo riempito d'acqua a monte (posizione 1) per umidificare il gas di trasporto. La freccia rossa indica il livello dell'acqua. (G) Siringa di erogazione modificata da 10 mL per il collettore di fortuna. Il cerchio rosso evidenzia la tacca di ritaglio situata tra i segni di 8 ml e 10 ml (o 1/2 pollice x 1/4 di pollice). (H) Vista posteriore del vaporizzatore Tec7 che mostra l'inserimento e l'orientamento delle siringhe modificate. In questa vista è presente una sola siringa per mostrare, a sinistra, il foro (freccia rossa) che deve essere allineato con la tacca della siringa modificata. Nota: il disallineamento di questa tacca di taglio e l'apertura di deflusso interromperanno la somministrazione dell'anestetico. Questa parte è un potenziale punto debole in questo sistema personalizzato. Se i fondi sono disponibili, dovrebbe essere utilizzato un collettore commerciale. Abbreviazione: SAA = array di anestesia seriale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

2. Prima dell'esposizione all'anestetico

1. Ventiquattro ore o più prima dell'esposizione all'anestetico, ordinare le coorti di mosche secondo necessità per l'esperimento usando il metodo preferito (ad esempio, CO₂ o etere).

3. Funzionamento dell'ASA

1. Trasferire le mosche dai flaconcini alimentari in tubi conici vuoti da 50 mL (senza CO₂).
   1. Contare e registrare eventuali mosche morte prima dell'esposizione.
2. Sganciare e avvitare tubi conici da 50 mL con mosche sull'SAA.
3. Accendere il gas di trasporto e impostare la portata desiderata.
   NOTA: In genere utilizziamo 1-2 L/min.
4. Impostare il vaporizzatore anestetico sulla concentrazione desiderata.
   NOTA: In genere usiamo il 2% per l'isoflurano e il 3,5% per il sevoflurano, che sono dosi equipotenti nei mammiferi¹⁰.
5. Esporre le mosche per la durata desiderata (min: 15 min).
   NOTA: Si raccomanda un tempo minimo di esposizione di 15 minuti per evitare possibili variazioni nell'equilibrio tra le posizioni dell'ASA. In questo sistema, ci vogliono 2-3 minuti perché gli anestetici si equilibrino in tutte le posizioni.
6. Al termine dell'esposizione, lavare il sistema con un flusso di gas fresco (vaporizzatore impostato allo 0%) a 1,5 L/min per 5 minuti corrispondenti a circa 10x volumi del volume totale SAA.

4. Elenco di controllo prima di iniziare un esperimento

1. Aprire completamente il regolatore ad alta pressione (sulla parte superiore del serbatoio dell'aria), quindi chiuderlo di mezzo giro per garantire il flusso di gas di trasporto.
2. Seguire i tubi per ogni linea per i) misuratori di portata e ii) vaporizzatore (assicurarsi che l'afflusso / deflusso siano collegati correttamente) e iii) controllare il livello di anestetico nei vaporizzatori.
3. Dopo aver caricato le camere con i soggetti, controllare che l'aria/gas scorra con il bubble test o l'indicatore di flusso.
   NOTA: Alcuni vaporizzatori non consentono il flusso d'aria quando il quadrante è in posizione spenta.
4. Quando il gas sta fluendo, verificare che sia il flussometro che l'indicatore di flusso a valle indichino il flusso.
5. Alla fine dell'esperimento, consentire 4-5 minuti di flusso d'aria per lavare l'anestetico.

Un link video SAA è fornito qui: Metodi di ricerca Perouansky - Dipartimento di Anestesiologia - UW-Madison (wisc.edu) (https://anesthesia.wisc.edu/research/researchers/perouansky-laboratory/perouansky-research-methods/) Il nostro laboratorio ha utilizzato il SAA per (i) studiare l'effetto del genotipo sulla sensibilità comportamentale agli anestetici5; (ii) schermare i mutanti mitocondriali per gli effetti collaterali degli anestetici11; e (iii) studiare la farmacodinamica dell'isoflurano e del sevoflurano sugli esiti delle lesioni cerebrali traumatiche (TBI)12,13,14,15,16,17. I risultati pubblicati dimostrano chiaramente che il background genetico influenza la farmacodinamica dei VGA clinicamente utilizzati sia per quanto riguarda il fenotipo convenzionale dell'anestesia che gli effetti collaterali della tossicità anestetica, nonché la protezione dei tessuti 5,11,13,14,15.

Esempio rappresentativo 1 (Figura 2):Deriva genetica nella resilienza alla tossicità dell'isoflurano rilevata da condizioni sperimentali riproducibili in modo affidabile
La scoperta di un graduale cambiamento quantitativo nella mortalità indotta da VGA tra moscerini ND2360114 coltivati separatamente è un esempio dell'utilità di confronti affidabili della farmacodinamica anestetica tra gruppi sperimentali che utilizzano la SAA. ND23 è un gene che codifica per una subunità nel nucleo del Complesso I del mETC (analogo a Ndufs8 nei mammiferi)18. Le mutazioni in questa subunità sono una causa della sindrome di Leigh, una malattia mitocondriale letale. Abbiamo osservato un graduale indebolimento del fenotipo di mortalità indotto da isoflurano nel tempo in vari stock omozigoti ND2360114 coltivati simultaneamente in condizioni di laboratorio standard (cioè senza esposizione a VGA). Questo adattamento evolutivo alla tossicità dell'isoflurano si è verificato in assenza di qualsiasi esposizione ai VGA ed è probabilmente un effetto collaterale della "sopravvivenza del più adatto" all'interno degli stock mutanti. Questo graduale cambiamento nella sensibilità all'isoflurano sarebbe rimasto non riconosciuto senza la nostra fiducia che le condizioni sperimentali fossero identiche nei saggi e nel tempo. Concludiamo che la selezione favorisce i modificatori degli effetti di ND2360114, con una maggiore resilienza alla tossicità dell'isoflurano. Poiché l'infiammazione nel sistema nervoso centrale svolge un ruolo importante nella patogenesi della sindrome di Leigh, l'evoluzione osservata della resistenza può essere dovuta a cambiamenti adattativi nella risposta immuno-infiammatoria innata, con la resistenza alla tossicità dell'isoflurano che è un sottoprodotto accidentale.

Figura 2: Variazione della mortalità indotta dalla tossicità dell'isoflurano come risultato della pressione evolutiva nei moscerini ND2360114. Sette linee (A-G) isolate da una singola popolazione attraverso accoppiamenti a coppia singola, espanse e testate per la mortalità di 24 ore (PM24) dopo un'esposizione di 2 ore all'isoflurano al 2% (a 10-13 giorni di età) mostrano variabilità nel fenotipo derivante da una singola popolazione. Dati mostrati come grafici a scatola e baffi. Le caselle rappresentano il secondo e il terzo quartile dei dati, con i baffi che si estendono fino ai punti dati minimo e massimo. La media e la mediana sono indicate rispettivamente da "+" e linee orizzontali. Le percentuali di mortalità delle singole repliche (N) sono mostrate come cerchi. N = 3-4 flaconcini da 20-50 mosche/flaconcino. Valore P per un ANOVA ordinario a senso unico; p = 0,012 indica una differenza significativa tra le medie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Esempio rappresentativo 2 (Figura 3): Illustrazione di un'applicazione ad alto rendimento della SAA per rivelare gli effetti genetici di fondo sulla farmacodinamica dell'isoflurano
Come esempio dell'elevata produttività del sistema, la Figura 3 illustra gli effetti di esposizioni identiche all'isoflurano (15 min di isoflurano al 2%) prima della lesione cerebrale traumatica (TBI)16, un protocollo che testa il precondizionamento anestetico (AP) in questo modello di mosca13,15,19. La lettura è la mortalità 24 ore dopo TBI corretto per attrito naturale (MI24). In questo modello, tutte le mosche hanno riacquistato la mobilità (cioè erano vive) entro 30 minuti dopo il trauma cranico e la mortalità registrata nell'MI24 è stata il risultato di una lesione cerebrale secondaria (sBI). Nelle quattro linee di volo, AP con isoflurano ha ridotto il MI24 a vari gradi, indicando che la reattività all'AP è un tratto quantitativo. Poiché la risposta infiammatoria è un fattore importante nella morbilità da sBI, l'AP può comportare la modulazione del sistema immunitario20.

Figura 3: Influenza del background genetico sulla soppressione della mortalità (MI24) mediante precondizionamento con isoflurano. I moscerini di precondizionamento con 15 minuti di isoflurano al 2% (viola) hanno ridotto l'indice di mortalità a 24 h (MI24) nei ceppi w 1118 e y1w1118 (p < 0,0001 e p = 0,036, rispettivamente). Il MI 24 non era significativamente inferiore nelle linee precondizionate Oregon R (OR) e Canton S (CS) (p = 0,16 e p =0,27, rispettivamente). Dati mostrati come grafici a scatola e baffi. Le caselle rappresentano il secondo e il terzo quartile dei dati, con i baffi che si estendono fino ai punti dati minimo e massimo. La media e la mediana sono indicate rispettivamente da "+" e linee orizzontali. I valori MI24 delle singole repliche (N) sono mostrati come cerchi. N = 15-33 flaconcini da 30-40 moscerini/flaconcino per moscerini trattati con TBI. N = 2-15 flaconcini da 30-40 moscerini/flaconcino per controlli non trattati. Valori P da un test t di Student non accoppiato e a due code. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.