Formulazione e caratterizzazione di agenti bioattivi contenenti nanodischi

Summary

Qui, descriviamo la produzione e la caratterizzazione di agenti bioattivi contenenti nanodisk. I nanodischi di amfotericina B sono presi come esempio per descrivere il protocollo in modo graduale.

Abstract

Il termine nanodisco si riferisce a un tipo discreto di nanoparticella composto da un lipide che forma un doppio strato, una proteina scaffold e un agente bioattivo integrato. I nanodischi sono organizzati come un doppio strato lipidico a forma di disco il cui perimetro è circoscritto dalla proteina dell'impalcatura, di solito un membro della famiglia delle apolipoproteine scambiabili. Numerosi agenti bioattivi idrofobici sono stati solubilizzati in modo efficiente in nanodischi mediante la loro integrazione nell'ambiente idrofobico del doppio strato lipidico della particella, producendo una popolazione ampiamente omogenea di particelle nell'intervallo di 10-20 nm di diametro. La formulazione di nanodischi richiede un rapporto preciso dei singoli componenti, un'aggiunta sequenziale appropriata di ciascun componente, seguita dalla sonicazione a bagno della miscela di formulazione. La proteina dello scaffold anfipatico contatta spontaneamente e riorganizza il doppio strato disperso formando una miscela di agenti lipidici / bioattivi per formare una popolazione discreta e omogenea di particelle di nanodischi. Durante questo processo, la miscela di reazione passa da un aspetto opaco e torbido a un campione chiarificato che, quando completamente ottimizzato, non produce precipitato dopo la centrifugazione. Gli studi di caratterizzazione riguardano la determinazione dell'efficienza di solubilizzazione dell'agente bioattivo, la microscopia elettronica, la cromatografia a filtrazione su gel, la spettroscopia di assorbanza ultravioletta visibile (UV/Vis) e/o la spettroscopia di fluorescenza. Questo è normalmente seguito da un'indagine sull'attività biologica utilizzando cellule o topi in coltura. Nel caso di nanodischi che ospitano un antibiotico (cioè l'antibiotico macrolide poliene amfotericina B), è possibile misurare la loro capacità di inibire la crescita di lieviti o funghi in funzione della concentrazione o del tempo. La relativa facilità di formulazione, la versatilità rispetto ai componenti, la dimensione delle particelle su scala nanometrica, la stabilità intrinseca e la solubilità acquosa consentono una miriade di applicazioni in vitro e in vivo della tecnologia dei nanodischi. Nel presente articolo, descriviamo una metodologia generale per formulare e caratterizzare i nanodischi contenenti amfotericina B come agente bioattivo idrofobo.

Introduction

Le lipoproteine discoidali nascenti ad alta densità (HDL) sono progenitori naturali delle HDL sferiche molto più abbondanti presenti nel sistema circolatorio umano. Queste particelle nascenti, note anche come pre-ß HDL, possiedono proprietà strutturali uniche e distintive¹. Infatti, piuttosto che esistere come particella sferoidale, le HDL nascenti sono a forma di disco. Studi approfonditi di caratterizzazione strutturale su HDL discoidali naturali e ricostituite hanno rivelato che sono costituiti da un doppio strato fosfolipidico il cui perimetro è circoscritto da un'apolipoproteina anfipatica scambiabile (apo), come l'apoA-I. Nel metabolismo ....

Protocol

1. Trasformazione, espressione e purificazione della componente proteica dello scaffold

1. Trasformazione batterica BL21 con plasmide contenente apoE4-NT
   1. Scongelare un tubo di cellule competenti BL21 (DE3) sul ghiaccio per 10 minuti.
   2. Una volta che tutto il ghiaccio si è sciolto, mescolare delicatamente e accuratamente pipettare 50 μL delle cellule in un tubo di trasformazione su ghiaccio.
   3. Aggiungere 5 μL contenenti 50 ng di DNA plasmidico (per la sequenza, vedere Tabella supplementare 1) alla miscela cellulare. Passare con attenzione il tubo quattro o cinque volte per mescolare. Non vortice.
   ....

Results

Processo di formulazione di nanodischi di agenti bioattivi
Nella procedura di formulazione ampB-nanodisk descritta, la reazione è considerata completa quando l'aspetto del campione passa da torbido a chiaro (Figura 1). Questo cambiamento indica che si sono formati nanofloppy e che l'agente bioattivo è stato solubilizzato. Spesso, gli agenti bioattivi assorbono la luce nella regione della lunghezza d'onda visibile (ad esempio, ampB, curcumina, luteina, coenzima Q₁₀

Discussion

La formulazione di un agente bioattivo contenente nanodischi fornisce un metodo conveniente per solubilizzare composti idrofobici altrimenti insolubili. Poiché i nanodischi dell'agente bioattivo prodotto sono completamente solubili in mezzi acquosi, forniscono un utile metodo di rilascio per un'ampia gamma di molecole idrofobiche (Tabella 1). Questi includono piccole molecole, droghe naturali e sintetiche, fitonutrienti, ormoni, ecc. La strategia di formulazione segue solitamente un protocollo standard c.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amfotericina B	Cayman Chemical Company	11636	ND Formulazione & Preparazione standard
Ampicillina	Fisher Scientific	BP17925	Trasformazione & Espansione
ApoE4-NT Plasmide GenScript		N/A	Trasformazione
Baffled Flask	Brunswick Scientific	N/A	Espansione & Espressione
BL21 competente E coli	New England Biolabs	C2527I	Trasformazione
Flaconi per centrifuga	Nalgene	3140-0250	Espressione
Cloroformio	Fisher Scientific	G607-4	Formulazione ND DMSO
	Sigma Aldrich	472301	Standard Prepartation
Dimiristoilfosfatidilcolina	Avanti Lipids	850345P	Formulazione ND
Pallone di Erlenmeyer	Bellco Biotechnology	N/A	Espansione & Expression
Falcon Tubes	Sarstedt Ag & Co	D51588	Test di vitalità del lievito
Provette in borosilicato di vetro	VWR	47729-570	Formulazione ND
GraphPad (Software)	Dotmatics	N/A	Saggio di vitalità del lievito
Bagno di sonicazione riscaldato	VWR	N/A	ND Formulaton
Modulo di riscaldamento e azoto	Thermo Scientific	TS-18822	ND Formulazione
HiTrap Eparina HP (5 mL)	GE Healthcare	17-0407-03	Purificazione
Isopropilico β-D-1-tiogalattopiranoside	Fisher Scientific	BP1755	Espressione
J-25 Centrifuga	Beckman Coulter	J325-IM-2	Espressione
JA-14 Rotore	Beckman Coulter		339247 Espressione
Liofilizzatore	Labconco	7755030	Formulazione ND
Metanolo	Fisher Scientific	A452-4	Formulazione ND
Azoto gassoso	Praxair	UN1066	ND Formulazione
NZCYM media	RPI Research Products	N7200-1000.0	Espansione & Espressione
Pet-22B vettore	GenScript	N/A	Trasformazione
Piastra di Petri	Fisher Scientific	FB0875718	Trasformazione & Cuvette di quarzo di espansione
	Fisher Brand	14385 928A	Analisi spettrale
agitazione incubatore	New Brunswick Scientific	M1344-0004	Trasformazione, espansione & Expression
Slide-A-Lyzer Boe	Thermo Scientific	66430	Purificazione
SnakeSkin Tubi per dialisi	Thermo Scientific	68100
Purificazione SnakeSkin Tubi per dialisi	Thermo Scientific	88243	Purificazione
Cloruro di sodio	Fisher Scientific	S271	Purificazione
Sodio fosfato bibasico	Fisher Scientific	S374-500	Purificazione
Fosfato di sodio monobasico	Fisher Scientific	BP329-500	Spettro di purificazione
POR Chiusure ponderate	Spettro Medical Industries	132736
Spettrofotometro	Shimadzu UV-1800	220-92961-01	Centrifuga
tavolo	Beckman Coulter	366816	Formulazione ND
UVProbe 2.61 (Software)	Shimadzu	N/A	Analisi spettrale
Filtro sottovuoto	Millipore	9004-70-0	Espressione & Pompa per vuoto di purificazione
	GAST Manufacturing Inc	DOA-P704-AA	Espressione & Vortice di purificazione
	Fisher Scientific	12-812	ND Formulazione
Lievito	N/A	BY4741	Saggio di vitalità del lievito
Estratto di lievito-peptone-destrosio	BD	242820	Saggio di vitalità del lievito