Il presente protocollo prepara e valuta le proprietà fisiche, la risposta immunitaria e l'effetto protettivo in vivo di un nuovo vaccino adiuvante nanoemulsione.
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Articolo metodologico
Valutazione della risposta immunitaria di un vaccino adiuvante nanoemulsione contro l'infezione da Staphylococcus aureus resistente alla meticillina (MRSA)
In questo articolo
Sommario
Abstract
I vaccini adiuvanti a nanoemulsione hanno attirato molta attenzione a causa delle loro piccole dimensioni delle particelle, dell'elevata stabilità termica e della capacità di indurre risposte immunitarie valide. Tuttavia, stabilire una serie di protocolli completi per valutare la risposta immunitaria di un nuovo vaccino adiuvante nanoemulsione è vitale. Pertanto, questo articolo presenta una procedura rigorosa per determinare le caratteristiche fisico-chimiche di un vaccino (mediante microscopia elettronica a trasmissione [TEM], microscopia a forza atomica [AFM] e diffusione dinamica della luce [DLS]), la stabilità dell'antigene e del sistema del vaccino (mediante un test di centrifuga ad alta velocità, un test di stabilità termodinamica, SDS-PAGE e western blot) e la risposta immunitaria specifica (IgG1, IgG2a e IgG2b). Utilizzando questo approccio, i ricercatori possono valutare accuratamente l'effetto protettivo di un nuovo vaccino adiuvante nanoemulsione in un modello murino di MRSA252 letale. Con questi protocolli, è possibile identificare l'adiuvante del vaccino nanoemulsione più promettente in termini di potenziale adiuvante efficace. Inoltre, i metodi possono aiutare a ottimizzare nuovi vaccini per lo sviluppo futuro.
Introduzione
Lo Staphylococcus aureus meticillino-resistente (MRSA) è un patogeno opportunista con uno dei più alti tassi di infezione in un'unità di terapia intensiva (ICU) reparti1, reparti di cardiologia e reparti ustionati in tutto il mondo. L'MRSA presenta alti tassi di infezione, mortalità e ampia resistenza ai farmaci, presentando grandi difficoltà nel trattamento clinico2. Nell'elenco delle priorità globali dei batteri resistenti agli antibiotici pubblicato dall'Organizzazione mondiale della sanità (OMS) nel 2017, l'MRSA è stato elencatonella categoria 3 più critica. È quindi urgentemente nece....
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Protocollo
Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti sulla base del manuale sull'uso e la cura degli animali da esperimento e sono stati approvati dal Comitato etico e benessere degli animali da laboratorio della Terza Università medica militare. Topi femmina Balb/c, di 6-8 settimane, sono stati utilizzati per il presente studio. Gli animali sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).
1. Preparazione della proteina dell'antigene MRSA HI
- Ottenere cloni di IsdB e Hla da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali), eseguire l'amplificazione della reazione a....
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Risultati
È stato valutato il protocollo per la preparazione del vaccino adiuvante nanoemulsione e i test in vitro e in vivo di questo vaccino. TEM, AFM e DLS sono stati utilizzati per determinare le importanti caratteristiche del potenziale zeta e della dimensione delle particelle sulla superficie di questo campione (Figura 1). SDS-PAGE e western blotting hanno mostrato che la quantità di antigene nel precipitato e nel surnatante non si è degradata significativamente dopo la centrif.......
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Discussione
IsdB, una proteina di superficie ancorata alla parete cellulare batterica e regolata dal ferro, svolge un ruolo importante nel processo di ottenimento del ferro eme15. Hla, tossina alfa, è tra le tossine batteriche più efficaci conosciute nell'MRSA e può formare pori nelle cellule eucariotiche e interferire con l'adesione e le cellule epiteliali16. Nel nostro studio, una nuova proteina antigene MRSA di ricombinazione (HI) è stata costruita ed espressa con .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse in questo lavoro.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata supportata dal n. 2021YFC2302603 del National Key Research and Development Program of China, No. 32070924 e 32000651 del NSFC e No. 2019jcyjA-msxmx0159 del Natural Science Foundation Project Program di Chongqing.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5424-Piccola centrifuga ad alta velocitàFA-45-24-11 | Eppendorf, Germania | ||
| piastre a 96 pozzetti | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germania | ||
| Lampada ad alcool | Shenzhen Yibaxun Technology Co., Cina | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mouse | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company, Cina | Lettore di micropiastre BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore, Germania | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuga 5810 R | Eppendorf, Germania | ||
| Coomassie blu brillante G-250 soluzione di colorazione | MIKX, Cina | DB236 | |
| Soluzione di decolorazione | BOSTER, Cina | AR0163-2 | |
| Coltivatore a temperatura eretta con elettroriscaldamento HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, Cina | null | |
| Apparecchio per elettroforesi | Beijing Liuyi Instrument Factory, Cina | DYCZ-25D | |
| Immagine del gel | Tanon, USA | nullo | |
| Glutatione-Sefarosio Resina GST | Mei5bio, Cina | resina | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD, Cina | 7664-93-9 | |
| HI proteina ricombinante | Terza Università Medica Militare, Cina | 110-27-0 | |
| HRP - Capra anti-topo IgG | Biodragon, Cina | BF03001 | |
| HRP- Capra anti-topo IgG1 | Biodragon, Cina | BF03002R | |
| HRP- Capra anti-topo IgG2a | Biodragon, Cina | BF03003R | |
| HRP- Capra anti-topo IgG2b | Biodragon, Cina | BF03004R | |
| Ciclo di inoculazione | Haimen Feiyue Co., LTD, Cina | YR-JZH-1UL | |
| Cloni IsdB e Hla | Shanghai Jereh Biotechnology Co, Cina | null | |
| Noce moscata isopropilica (adiuvante farmaceutico) | SEPPIC, Francia | null | |
| isopropil- β-D-1-mercaptogalactopiranoside | fdbio, Cina | FD3278-1 | |
| LB brodo coltura-medium | Pechino AOBOX Biotechnology Co., LTD, Cina | 02-136 | |
| Lampada per fisioterapia a | Guangzhou Runman Medical Equipment Co., Cina | 7600 | |
| Centrifuga refrigerata a bassa temperatura | Eppendorf, Germania... | ||
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., Regno Unito | null | |
| MH (A) medio | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD, Cina | 02-051 | |
| MH (B) medio | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD, Cina | 02-052 | |
| Micro piastra lavatrice 405 LSRS | Bio Tek Instruments, Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | ||
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop spettrofotometro ultravioletto | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Kit gel per elettroforesi proteica | DAKEWE, Cina | 8012011 | |
| PBS | biosharp, Cina | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | plasmide | |
| pGEX-target | Shanghai Jereh Biotechnology Co, Cina | B3528G | |
| Acido fosfotungstico | G-CLONE, Cina | Pipetta CS1231-25g | |
| Eppendorf, Germania | |||
| olio di ricino poliossietilato (adiuvante farmaceutico) | Aladdin, Cina | K400327-1kg | |
| Anticorpo primario | Laboratorio fatto in casa:da topi immunizzati con siero positivo | nullo | Vedere il riferimento 11 per i dettagli |
| glicole propilenico (adiuvante farmaceutico) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Marcatore proteico | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| MEMBRANA DI TRASFERIMENTO PVDF | Invitrogen, USA | 88518 | |
| Microscopio elettronico a scansione | JEOL, Giappone | JSM-IT800 | |
| Pentobarbital di sodio | Merck, Germania | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | TMB nullo | |
| TIAN GEN, Cina | PA107-01 | ||
| Kit tartaruga | Xiamen Bioendo Technology Co., LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, Cina | 9005-64-5 |
Riferimenti
- Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
- Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epide....
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Ristampe e permessi
