Qui, descriviamo un miglioramento del metodo semi-in vitro (SIV) per osservare la guida e la ricezione del tubo pollinico in Arabidopsis thaliana, che aumenta la ricettività degli ovuli. Il metodo SIV cum septum ad alta produttività può essere accoppiato con linee marcatrici di gametofiti e biosensori geneticamente codificati per monitorare il processo dinamico di fecondazione.
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Articolo metodologico
Imaging dal vivo della ricezione del tubo di polline di Arabidopsis e doppia fecondazione utilizzando il metodo semi-in vitro del setto di cum
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nelle piante da fiore, la crescita e la guida del tubo pollinico (gametofito maschile) all'interno del pistillo e la ricezione del tubo pollinico da parte del gametofito femminile sono essenziali per la doppia fecondazione e il successivo sviluppo del seme. Le interazioni tra gametofiti maschili e femminili durante la ricezione del tubo pollinico culminano nella rottura del tubo pollinico e nel rilascio di due spermatozoi per effettuare una doppia fecondazione. Poiché la crescita del tubo pollinico e la doppia fecondazione sono profondamente nascoste all'interno dei tessuti del fiore, questo processo è difficile da osservare in vivo.
Un metodo semi-in vitro (SIV) per l'imaging di cellule vive della fecondazione nella pianta modello Arabidopsis thaliana è stato sviluppato e implementato in diverse indagini. Questi studi hanno contribuito a chiarire le caratteristiche fondamentali di come avviene il processo di fecondazione nelle piante da fiore e quali cambiamenti cellulari e molecolari si verificano durante l'interazione dei gametofiti maschili e femminili. Tuttavia, poiché questi esperimenti di imaging di cellule vive comportano l'escissione di singoli ovuli, sono limitati a un basso numero di osservazioni per sessione di imaging, rendendo questo approccio noioso e molto dispendioso in termini di tempo. Tra le altre difficoltà tecniche, viene spesso segnalata un'incapacità dei tubi pollinici di fertilizzare gli ovuli in vitro, il che confonde gravemente tali analisi.
Qui viene fornito un protocollo video dettagliato per l'imaging della ricezione e della fecondazione del tubo pollinico in modo automatizzato e ad alta produttività, consentendo fino a 40 osservazioni della ricezione e della rottura del tubo pollinico per sessione di imaging. Abbinato all'uso di biosensori e linee di marcatori geneticamente codificati, questo metodo consente la generazione di campioni di grandi dimensioni con un investimento di tempo ridotto. Le sfumature e i punti critici della tecnica, tra cui la messa in scena dei fiori, la dissezione, la preparazione del mezzo e l'imaging, sono chiaramente dettagliati in formato video per facilitare la ricerca futura sulle dinamiche della guida, della ricezione e della doppia fecondazione del tubo pollinico.
Introduzione
La generazione di prole geneticamente unica negli organismi che si riproducono sessualmente dipende dalla fusione riuscita di gameti maschili e femminili. Nelle piante da fiore, l'interazione di due gameti maschili (spermatozoi) con due gameti femminili (cellula uovo e cellula centrale) durante la doppia fecondazione dipende dal rilascio di spermatozoi dal tubo pollinico (il gametofito maschile). Questo processo, chiamato ricezione del tubo pollinico, è in gran parte controllato dalle cellule sinergiche che risiedono all'interno del sacco embrionale (il gametofito femminile)1,2. Poiché la ricezione del tubo po....
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Protocollo
NOTA: Vedere la tabella dei materiali per un elenco dei materiali e delle attrezzature utilizzati in questo protocollo.
1. Considerazioni per la progettazione dell'esperimento di imaging
- Predeterminare la durata dell'imaging e la frequenza di campionamento necessarie per catturare il fenomeno desiderato da osservare. Ad esempio, seguendo il teorema di campionamento di Nyquist, la frequenza di campionamento deve essere maggiore del doppio della frequenza più alta del campione di input. Pertanto, per catturare con precisione le oscillazioni sinergiche [Ca2+]cyt , eseguire l'ima....
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Risultati
Per valutare i tempi della degenerazione nucleare nel sinergide ricettivo rispetto alla rottura del tubo pollinico in Arabidopsis , nonché per osservare se il sinergico sinistro o destro è predestinato a diventare il sinergico ricettivo, il metodo SIV cum septum qui descritto è stato impiegato utilizzando un marcatore nucleare gametofito femminile impilato con un marcatore citosolico sinergico (pFG: roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1) come donatore di setto e marcatore di gametofito maschile (.......
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Discussione
Questo manoscritto introduce un protocollo efficiente per l'imaging della ricezione del tubo pollinico e della doppia fecondazione in Arabidopsis. Il metodo migliorato, SIV cum septum, aumenta notevolmente la percentuale e il numero totale di eventi di ricezione del tubo pollinico osservabili con successo per sessione di imaging. I risultati rappresentativi mostrati qui dimostrano una sessione di imaging con 41 eventi di ricezione del tubo pollinico di successo e 10 ovuli che mostrano difetti di ricezio.......
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Dichiarazioni
Gli autori non segnalano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo Sara Simonini e Stefano Bencivenga per aver donato il costrutto pFG:roGFP2-ORP1-NLS e Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter e Celia Baroux per i loro consigli sulla microscopia. Riconosciamo gentilmente i consigli di Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima e tutti gli altri alla Conferenza internazionale sulla riproduzione sessuale delle piante 2022 che hanno mostrato interesse per un protocollo su SIV cum septum. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Università di Zurigo e da sovvenzioni del Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica a U.G.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vetrino da 1 mm | Epredia | ||
| Piatto con fondo in vetro da 35 mm (pozzetto 14 mm) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Cloruro di calcio | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | donatore stigma | |
| Ambito di dissezione | Olimpo | SZX2-ILLT | |
| Ago per insulina (0,3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | donatore di setto | |
| Solfato di magnesio | Merck | 5886 | |
| Cloruro di potassio | Roth | 6781.1 | |
| Lama di rasoio | Beldura | 7026797 | |
| Nastro biadesivo scozzese | Scotch | 768720 | Meno denso e buono per la dissezione dello stigma |
| Cloruro di sodio | Roth | 3957.1 | |
| Reagenti ITW | saccarosio | A2211,1000 | |
| Nastro biadesivo Tesa | Tesa | 05681-00018 | Molto appiccicoso e buono per la dissezione del setto |
| Agarosio a bassissima temperatura di gelificazione | FMC SeaPrep | 50302 |
Riferimenti
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control ....
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Ristampe e permessi
