È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Stabilire un dispositivo per la privazione del sonno nei topi

3.2K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/65157

⸱

22 settembre 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, 2Department of Cardiology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo delinea un metodo per la creazione di un dispositivo basato su piattaforma a bilanciere economico utilizzato per indurre la privazione del sonno nei topi. Questo dispositivo si è dimostrato efficace nel causare interruzioni nei modelli di sonno evidenziati dall'elettroencefalogramma (EEG), oltre a indurre cambiamenti metabolici e molecolari associati alla privazione del sonno.

Abstract

L'interruzione del ritmo circadiano si riferisce alla desincronizzazione tra l'ambiente esterno o il comportamento e l'orologio molecolare endogeno, che compromette significativamente la salute. La privazione del sonno è una delle cause più comuni di interruzione del ritmo circadiano. Varie modalità (ad esempio, piattaforme sull'acqua, manipolazione delicata, camere a barre scorrevoli, tamburi rotanti, agitatori orbitali, ecc.) sono state segnalate per indurre la privazione del sonno nei topi per studiarne gli effetti sulla salute. L'attuale studio introduce un metodo alternativo per la privazione del sonno nei topi. È stato progettato un dispositivo automatizzato basato su piattaforma a bilanciere che è conveniente e interrompe in modo efficiente il sonno nei topi alloggiati in gruppo a intervalli di tempo regolabili. Questo dispositivo induce cambiamenti caratteristici della privazione del sonno con una risposta allo stress minima. Di conseguenza, questo metodo può rivelarsi utile per i ricercatori interessati a studiare gli effetti e i meccanismi alla base della privazione del sonno sulla patogenesi di molteplici malattie. Inoltre, offre una soluzione conveniente, in particolare quando è necessario che più dispositivi di privazione del sonno funzionino in parallelo.

Introduzione

L'interruzione del ritmo circadiano si riferisce alla desincronizzazione tra l'ambiente esterno o il comportamento e l'orologio biologico endogeno. Una delle cause più comuni di interruzione del ritmo circadiano è la privazione del sonno1. La privazione del sonno non solo influisce negativamente sulla salute umana, ma aumenta anche significativamente il rischio di molte malattie, tra cui il cancro2 e le malattie cardiovascolari3. Tuttavia, i meccanismi alla base degli effetti dannosi della privazione del sonno rimangono in gran parte sconosciuti e stabilire modelli di privazione del sonno è essenziale per migliorare la nostra comprensione a questo proposito.

Sono stati riportati vari metodi per la privazione del sonno nei topi, come l'uso di piattaforme d'acqua4, manipolazione delicata5, camere a barre scorrevoli6, tamburi rotanti7 e protocolli di agitazione della gabbia 5,8,9. Le camere a barre scorrevoli spazzano automaticamente le barre sul fondo della gabbia, costringendo i topi a camminarci sopra e a rimanere svegli. I protocolli di agitazione delle gabbie prevedono il posizionamento di gabbie su agitatori orbitali da laboratorio, con conseguente efficiente interruzione del sonno. Sebbene questi metodi siano automatici ed efficaci, possono essere costosi quando è necessario che più dispositivi funzionino in parallelo, in particolare per progetti di studio specifici che coinvolgono un gran numero di topi privati del sonno necessari per la profilazione genica circadiana. D'altra parte, le piattaforme d'acqua e i protocolli di manipolazione delicata sono metodi più economici e semplici comunemente usati per indurre la privazione del sonno. Tuttavia, la piattaforma d'acqua non consente il controllo automatico dei cicli di privazione-riposo prespecificati10,11 e la manipolazione delicata richiede una vigilanza continua da parte dei ricercatori per disturbare il sonno. Inoltre, altre modalità, come i tamburi rotanti, possono essere confuse dall'isolamento sociale o dallo stress12.

Ispirandoci al metodo basato su shaker orbitale, miriamo a introdurre un protocollo per stabilire un dispositivo basato su piattaforma rocker per la privazione del sonno nei topi. Questo metodo è economico, efficace, minimamente stressante, controllabile e automatizzato. L'attuale protocollo ci consente di creare un dispositivo basato su piattaforma a bilanciere ad un costo circa dieci volte inferiore a quello degli agitatori orbitali, in base alla nostra accessibilità. Questo dispositivo ha interrotto efficacemente il sonno nei topi ospitati in gruppo e ha indotto cambiamenti caratteristici della privazione del sonno con una risposta allo stress minima. Sarà particolarmente utile per i ricercatori interessati a studiare gli effetti e i meccanismi alla base della privazione del sonno sulla patogenesi di più malattie, in particolare quando lo studio coinvolge la privazione del sonno in più gruppi in parallelo.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali sugli animali in questo studio sono stati approvati dal Comitato Etico per il Benessere degli Animali da Laboratorio dell'Ospedale Renji, Facoltà di Medicina, Università Jiao Tong di Shanghai. Nello studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J, di età compresa tra 8 e 10 settimane. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). Le parti principali necessarie per la creazione del dispositivo sono elencate nella Figura 1A.

1. Preparazione del dispositivo di privazione del sonno

  1. Fissare un'estremità di un canale in acciaio scanalato da 50 cm al centro di un canale in acciaio scanalato da 40 cm con viti (vedi Tabella dei materiali) per creare una struttura a forma di T; ripetere il processo e creare due strutture a forma di T (Figura 1B-a).
  2. Posizionare le due strutture a forma di T parallelamente verso l'alto a 30 cm di distanza l'una dall'altra e collegare la parte inferiore delle due strutture a forma di T con un cilindro in acciaio compatibile con viti da 30 cm (vedi Tabella dei materiali) utilizzando le viti (Figura 1B-b).
  3. Posizionare una piattaforma rettangolare in acciaio (20 × 25 cm) (vedi Tabella dei materiali) tra le due strutture a forma di T (Figura 1B-c).
    NOTA: Se non sono disponibili piattaforme rettangolari in acciaio pronte all'uso delle dimensioni specificate, è possibile realizzarne una saldando acciai piatti di 2 mm di spessore.
  4. Fissare ciascuna estremità di un cilindro in acciaio compatibile con viti da 30 cm fissato nella piattaforma a due cuscinetti fissati su ciascuna delle strutture a forma di T a 10 cm dall'alto (Figura 1B-d).
  5. Fissare un supporto motore (vedere la tabella dei materiali) su una delle strutture a forma di T a 25 cm dall'alto utilizzando le viti (Figura 1B-e).
    NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un adesivo da costruzione per fissare il supporto del motore sulla struttura a forma di T al posto degli equipaggi.
  6. Installare un motore (vedere la tabella dei materiali) sul supporto del motore con le viti (Figura 1B-f).
  7. Fissare una ventola di raffreddamento (vedere la tabella dei materiali) con fascette autobloccanti sulla struttura a forma di T sotto il motore (Figura 1B-g).
  8. Fissare l'estremità del cuscinetto di una biella all'angolo della piattaforma rivolto verso il motore utilizzando le viti (Figura 1B-h).
  9. Fissare un'altra estremità della biella all'albero del motore utilizzando le viti (Figura 1B-i).
  10. Praticare due fori da 4 mm a ciascuno dei quattro angoli di un contenitore di plastica o di una gabbia per animali standard (vedere la tabella dei materiali) utilizzando un trapano elettrico e praticare due fori da 4 mm e un foro inferiore da 6 mm sul lato sinistro della gabbia (Figura 1B-j).
  11. Fissare la gabbia sulla piattaforma rettangolare con fascette autobloccanti attraverso i fori angolari (Figura 1B-k).
  12. Praticare un foro di 5 mm nel tappo di una provetta da centrifuga da 50 ml con un trapano elettrico e tappare il foro con un ugello lungo dotato di valvola a sfera per evitare perdite d'acqua.
    NOTA: L'idrogel sarebbe un'opzione alternativa per l'approvvigionamento idrico se la personalizzazione delle bottiglie d'acqua è difficile.
  13. Fissare la borraccia personalizzata sul lato sinistro della gabbia utilizzando fascette autobloccanti attraverso i due fori da 4 mm, con l'ugello che passa attraverso il foro da 6 mm (Figura 1B-l).
  14. Collegare i cavi elettrici di uscita dell'adattatore di alimentazione ai due terminali del motore (Figura 1B-l).
    NOTA: Non esiste un requisito di polarità specifico per il collegamento dei fili ai terminali del motore.
  15. Collegare i cavi elettrici di ingresso dell'adattatore di alimentazione al contattore temporale (Figura 1B-m).

2. Induzione della privazione del sonno

  1. Premere i pulsanti con il segno più a destra rispettivamente sulle metà sinistra e destra del contattore di tempo (vedere la tabella dei materiali), finché non viene visualizzato "M" sui contatori meccanici su entrambi i lati (Figura 1C-a).
  2. Premere i pulsanti centrali con il segno più sulle metà sinistra e destra del contattore del tempo finché non viene visualizzato "5M" sui contatori meccanici su entrambi i lati (Figura 1C-b).
  3. Premere il pulsante con il segno più a sinistra sulla metà sinistra del contattore di tempo fino a quando non viene visualizzato "15M" sul contatore meccanico sinistro (Figura 1C-c).
    NOTA: Il contattore temporale sarà quindi acceso per 15 minuti e spento per 5 minuti in modalità ciclica.
  4. Metti i topi nella gabbia con acqua e cibo ad libitum.
  5. Alimentare il contattore temporizzato e la ventola di raffreddamento.
    NOTA: La piattaforma ora oscillerà a 10 giri/min.
  6. Pesare ogni topo all'ora di Zeitgeber 0 (ZT0) ogni giorno.
    NOTA: La luce è accesa dalle 8 AM (ZT0) alle 8 PM (ZT12).

3. Test di tolleranza al glucosio orale

  1. Misurare i livelli di glucosio a digiuno nei topi a digiuno campionando il sangue dalle vene caudali.
  2. Iniettare la soluzione di glucosio in ciascun topo (2 g/kg di peso corporeo) per via intraperitoneale utilizzando siringhe da 1 ml.
  3. Raccogliere campioni di sangue attraverso la vena caudale e testare la glicemia rispettivamente a 15 minuti, 30 minuti, 60 minuti e 120 minuti dopo l'iniezione di glucosio.
  4. Rimetti i topi nella gabbia con il cibo e l'acqua ad libitum dopo il test.

4. Prelievo dei tessuti cerebrali

  1. Decapitare i topi dopo un'adeguata anestesia esponendoli all'isoflurano (2%) per 3-5 minuti.
  2. Esporre il cranio e praticare un taglio verticale di 1 cm in corrispondenza del cranio utilizzando le forbici chirurgiche.
  3. Rimuovere il cranio utilizzando emostatici per zanzare (vedi Tabella dei materiali) per esporre il tessuto cerebrale.
  4. Sposta delicatamente l'intero cervello fuori dalla cavità cranica usando una pinzetta curva.
    NOTA: Il tessuto cerebrale deve essere rimosso secondo le politiche locali.
  5. Lavare il tessuto cerebrale con soluzione salina tamponata con fosfato freddo (1x PBS, 4 °C).
  6. Congelare a scatto il tessuto cerebrale intatto in azoto liquido e trasferire il tessuto a -80 °C per la conservazione a lungo termine.
    NOTA: Se conservato a -80°C, il tessuto cerebrale congelato è stabile per almeno 6 mesi.

5. Rilevamento dell'espressione genica mediante reazione a catena della polimerasi (PCR)

  1. Scongelare i tessuti cerebrali a 4 °C o su ghiaccio.
  2. Trasferire il tessuto in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL ed estrarre l'RNA totale utilizzando il metodo basato su TRIzol13.
  3. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro (vedi Tabella dei materiali) dopo l'estrazione dell'RNA.
  4. Eseguire la trascrizione inversa dell'RNA totale (1 μg) in DNA complementare (cDNA) utilizzando un kit commerciale14.
  5. Misurare i livelli di espressione genica mediante reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa in tempo reale15.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Il dispositivo stabilito per la privazione del sonno nei topi è mostrato nella Figura 1D. Al giorno 7 dopo l'inizio della privazione del sonno, il monitoraggio dell'elettroencefalogramma (EEG) e dell'elettromiografia (EMG)16 ha indicato che il dispositivo ha ridotto significativamente la durata del sonno e aumentato la durata della veglia nei topi (Figura 2A-D). Nel frattempo, l'attuale protocollo ha aume...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

I modelli murini di privazione del sonno sono essenziali per studiare gli effetti dell'interruzione del sonno su varie malattie, tra cui le malattie cardiovascolari21, le condizioni psichiatriche22 e i disturbi neurologici23. Tra le strategie di privazione del sonno esistenti nei topi, gli approcci fisici che comportano l'interruzione ripetitiva a breve termine del sonno sono i più comunemente usati 5,7,12

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (82230014, 81930007, 82270342), dello Shanghai Outstanding Academic Leaders Program (18XD1402400), della Commissione per la scienza e la tecnologia della municipalità di Shanghai (22QA1405400, 201409005200, 20YF1426100), dello Shanghai Pujiang Talent Program (2020PJD030), SHWSRS(2023-62), dello Shanghai Clinical Research Center for Aging and Medicine (19MC1910500) e del programma di innovazione post-laurea del Bengbu Medical College (Byycxz21075).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mLAxygenMCT-150-C-S
centrifuga da 50 mLKit ELISA peradenosina NEST 602002
Tecnologia RuifanRF8885
Gabbia per animaliZeYa techMJ2
GlucometroYuYue580
C57BL/6J TopiJieSiJie Animale da laboratorioN/AEtà: 8-10 settimane
BiellaShengXiang TechN/ALunghezza:  20 cm
Ventola di raffreddamentoLiMingEFB0805VHTensione di alimentazione: 5 V; Consumo energetico: 1,2 W; Flusso d'aria: 26,92 cfm; Dimensioni: 40 mm * 40 mm * 56 mm
Kit ELISA CorticosteroneElabscienceE-OSEL-M0001
Sistema di registrazione e analisi EEG/EMGPinnacle Technology8200-K1-iSE3
IsofluranoRWD20071302
emostatici per zanzare FST13011-12Strumento chirurgico
Motore e supporto motoreMingYangMY36GP-555Tensione di alimentazione: 24 V c.c.; Diametro dell'albero: 8 mm; Coppia massima in uscita: 100 Kgf.cm; Velocità massima di uscita: 10 giri/min
NanoDrop 2000cThermo ScientificNanoDrop 2000c
Adattatore per mattoncino di alimentazioneMingYangQiYe-0243Tensione di ingresso: 110-220 V c.a.; Tensione di uscita: 24 V c.c.; Corrente di uscita: 2 A; Lunghezza del cavo: 2 m
Kit commerciale qPCRVazymeQ711-02
Apparecchiatura di misurazione qPCRRoche480
Piattaforma rettangolare fissata con un cilindro in acciaio compatibile con le vitiPersonalizzatoN/A Larghezza: 20 cm; lunghezza: 25 cm; lunghezza del cilindro: 30 cm, spessore: 2 mm
Kit commerciale da RNA inverso a cDNAVazymeR323-01
Vite e dadoGuwanjiN/ADiametro interno: 6 mm, 12 mm
Cilindro in acciaio compatibile con vitiPersonalizzatoN/ALunghezza: 300 mm
Canali in acciaio scanalatoPersonalizzatoN/ALunghezza: 400 mm o 500 mm, spessore: 2 mm
Contattore a tempoLiXiangDH48S-STensione di alimentazione: 110-220 V c.a.; Unità di misura: ore, minuti, secondi; Configurazione dei contatti: DPDT
TRIzolVazymeR401-01
Provetta per

Riferimenti

  1. Yang, D. F., et al. Acute sleep deprivation exacerbates systemic inflammation and psychiatry disorders through gut microbiota dysbiosis and disruption of circadian rhythms. Microbiological Research. 268, 127292(2023).
  2. Alanazi, M. T., Alanazi, N. T., Alfadeel, M. A., Bugis, B. A. Sleep deprivation and quality of life among uterine cancer survivors: systematic review. Supportive Care In Cancer : Official Journal of the Multinational Association of Supportive Care In Cancer. 30 (3), 2891-2900 (2022).
  3. Tobaldini, E., et al. Sleep, sleep deprivation, autonomic nervous system and cardiovascular diseases. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 74, 321-329 (2017).
  4. Arthaud, S., et al. Paradoxical (REM) sleep deprivation in mice using the small-platforms-over-water method: polysomnographic analyses and melanin-concentrating hormone and hypocretin/orexin neuronal activation before, during and after deprivation. Journal of Sleep Research. 24 (3), 309-319 (2015).
  5. Saré, R. M., et al. Chronic sleep restriction in developing male mice results in long lasting behavior impairments. Frontiers In Behavioral Neuroscience. 13, 90(2019).
  6. Roman, V., Vander Borght, K., Leemburg, S. A., Vander Zee, E. A., Meerlo, P. Sleep restriction by forced activity reduces hippocampal cell proliferation. Brain Research. 1065 (1-2), 53-59 (2005).
  7. Zhao, H. Y., et al. Chronic sleep restriction induces cognitive deficits and cortical beta-amyloid deposition in mice via BACE1-antisense activation. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (3), 233-240 (2017).
  8. Lord, J. S., et al. Early life sleep disruption potentiates lasting sex-specific changes in behavior in genetically vulnerable Shank3 heterozygous autism model mice. Molecular Autism. 13 (1), 35(2022).
  9. Sinton, C. M., Kovakkattu, D., Friese, R. S. Validation of a novel method to interrupt sleep in the mouse. Journal of Neuroscience Methods. 184 (1), 71-78 (2009).
  10. Rotenberg, V. S. Sleep after immobilization stress and sleep deprivation: common features and theoretical integration. Critical Reviews in Neurobiology. 14 (3-4), 225-231 (2000).
  11. Kim, T. K., et al. Melatonin modulates adiponectin expression on murine colitis with sleep deprivation. World Journal of Gastroenterology. 22 (33), 7559(2016).
  12. Barf, R. P., Scheurink, A. J. Sleep disturbances and glucose homeostasis. European Endocrinology. 7, 14-18 (2011).
  13. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  14. Libus, J., Štorchová, H. Quantification of cDNA generated by reverse transcription of total RNA provides a simple alternative tool for quantitative RT-PCR normalization. Biotechniques. 41 (2), 156-164 (2006).
  15. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nature Protocols. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  16. Mang, G. M., et al. Evaluation of a piezoelectric system as an alternative to electroencephalogram/electromyogram recordings in mouse sleep studies. Sleep. 37 (8), 1383-1392 (2014).
  17. Maret, S., et al. Homer1a is a core brain molecular correlate of sleep loss. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (50), 20090-20095 (2007).
  18. Li, K., et al. Olfactory deprivation hastens Alzheimer-like pathologies in a human tau-overexpressed mouse model via activation of cdk5. Molecular neurobiology. 53, 391-401 (2016).
  19. Sousa, M. E., et al. Invariant Natural Killer T cells resilience to paradoxical sleep deprivation-associated stress. Brain, Behavior, and Immunity. 90, 208-215 (2020).
  20. Zhao, Y., et al. Disruption of circadian rhythms by shift work exacerbates reperfusion injury in myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 79 (21), 2097-2115 (2022).
  21. Miller, M. A., Cappuccio, F. P. Inflammation, sleep, obesity and cardiovascular disease. Current Vascular Pharmacology. 5 (2), 93-102 (2007).
  22. Minkel, J., et al. Sleep deprivation potentiates HPA axis stress reactivity in healthy adults. Health Psychology. 33 (11), 1430(2014).
  23. Bishir, M., et al. Sleep deprivation and neurological disorders. BioMed Research International. 2020, 5764017(2020).
  24. Franken, P., Tobler, I., Borbély, A. A. Cortical temperature and EEG slow-wave activity in the rat: analysis of vigilance state related changes. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 420 (5-6), 500-507 (1992).
  25. Li, Y., et al. Effects of chronic sleep fragmentation on wake-active neurons and the hypercapnic arousal response. Sleep. 37 (1), 51-64 (2014).
  26. Jones, C. E., et al. Early-life sleep disruption increases parvalbumin in primary somatosensory cortex and impairs social bonding in prairie voles. Science Advances. 5 (1), (2019).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Ritmo circadianopiattaforma basculanteprivazione del sonno nei topiprivazione automatizzata del sonnomonitoraggio EEGmonitoraggio EMGespressione del gene Clocktolleranza al glucosiorisposta allo stress
Stabilire un dispositivo per la privazione del sonno nei topi
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.