Sviluppo di processi per l'essiccazione a spruzzo di batteri probiotici e valutazione della qualità del prodotto

Per essere definiti probiotici, i microrganismi aggiunti agli alimenti (o integratori) devono essere consumati vivi, essere in grado di sopravvivere durante il passaggio nel tratto gastrointestinale dell'ospite e raggiungere il sito di azione in quantità adeguate per esercitare effetti benefici ^1,2,7.

Il crescente interesse per i probiotici è dovuto ai numerosi benefici per la salute umana che conferiscono, come la stimolazione del sistema immunitario, la riduzione dei livelli sierici di colesterolo e il potenziamento della funzione di barriera intestinale agendo contro i microbi dannosi, nonché i loro effetti benefici nel trattamento della sindrome dell'intestino irritabile, tra gli altri ^2,3. Inoltre, diversi studi hanno dimostrato che i probiotici possono influenzare positivamente altre parti del corpo umano in cui comunità microbiche squilibrate possono causare malattie infettive ^3,4,5.

Affinché i probiotici siano terapeuticamente efficaci, il prodotto deve contenere tra 10 6-10⁷ CFU / g di batteri al momento del consumo⁶. D'altra parte, il Ministero della Salute italiano e della Salute del Canada ha stabilito che il livello minimo di probiotici negli alimenti dovrebbe essere di 10⁹ CFU/g di cellule vitali al giorno o per porzione, rispettivamente⁷. Considerando che sono necessari carichi elevati di probiotici per garantire che avranno effetti benefici, è essenziale garantire la loro sopravvivenza durante la lavorazione, la conservazione a scaffale e il passaggio attraverso il tratto gastrointestinale (GI). Diversi studi hanno dimostrato che la microincapsulazione è un metodo efficace per migliorare la vitalità complessiva dei probiotici 8,9,10,11.

In questo contesto, sono stati sviluppati diversi metodi per la microincapsulazione dei probiotici, come spray-drying, liofilizzazione, spray-chilling, emulsione, estrusione, coacervazione e, più recentemente, letti fluidizzati^11,12,13,14. La microincapsulazione mediante essiccazione a spruzzo (SD) è ampiamente utilizzata nell'industria alimentare perché è un processo semplice, veloce e riproducibile. È facile da scalare e ha un alto rendimento produttivo a basso fabbisogno energetico^11,12,13,14. Tuttavia, l'esposizione alle alte temperature e al basso contenuto di umidità può influenzare la sopravvivenza e la vitalità delle cellule probiotiche¹⁵. Entrambi i parametri possono essere migliorati per un dato ceppo determinando gli effetti dell'età e delle condizioni di coltura per pre-adattare la coltura e ottimizzare le condizioni di essiccazione a spruzzo (temperature di ingresso e uscita, processo di atomizzazione) e la composizione incapsulante 8,14,16,17,18.

Anche la composizione della soluzione incapsulante è un fattore importante durante la SD in quanto può definire il livello di protezione contro condizioni ambientali avverse. Inulina, gomma arabica, maltodestrine e latte scremato sono ampiamente usati come agenti incapsulanti per l'essiccazione probiotica 5,17,18,19. L'inulina è un fruttooligosaccaride che presenta una forte attività prebiotica e promuove la salute intestinale¹⁹. Il latte scremato è molto efficace nel mantenere la vitalità delle cellule batteriche essiccate e genera una polvere con buone proprietà di ricostituzione¹⁷.

Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259 è un batterio dell'acido lattico che produce batteriocin e presenta attività antilisteriale, oltre ai tratti probiotici^20,21. È un batterio Gram-positivo eterofermentativo facoltativo a forma di bastoncino che cresce da 15 °C a 37 °C²⁰ ed è compatibile con la temperatura corporea omeostatica. Questo studio mirava a presentare tutte le fasi coinvolte nella produzione e caratterizzazione fisico-chimica di un probiotico spray-dried (L. paraplantarum FT-259) e valutare l'influenza dei protettori e le temperature di essiccazione.

1. Produzione delle cellule probiotiche

1. Preparare il brodo De Man Rogosa e Sharpe (MRS).
2. Riattivare l'1% (v/v) della coltura di interesse nel brodo MRS (qui è stato utilizzato Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259).
3. Incubare per 24 ore ad una temperatura adeguata (abbiamo usato 37 °C).

2. Separare i batteri dalla coltura

1. Centrifugare la coltura batterica a 7.197 x g per 5 minuti a 4 °C utilizzando provette coniche da 50 ml. È importante che il peso dei tubi sia bilanciato prima della procedura.
2. Utilizzando una pipetta, rimuovere il surnatante e gettarlo in un contenitore adatto. Lavare i pellet con un tampone fosfato (pH 7) e omogeneizzare la soluzione.
3. Ripetere il processo di centrifugazione come menzionato prima.
4. Per ottenere il pellet, utilizzare una pipetta per rimuovere e gettare il surnatante in un contenitore appropriato.

3. Aggiunta di coadiuvanti per l'essiccazione

1. Selezionare la combinazione di due coadiuvanti essiccanti (protettivi): miscela inulina:maltodestrina e latte scremato simulato (tabella 1)^22,23.
2. Pesare 5 g di inulina e 5 g di maltodestrina per ottenere la prima combinazione di protettivi.
3. Pesare 3 g di inulina, 3 g di lattosio, 0,4 g di_{SiO 2} colloidale e 3,6 g di proteine del siero di latte per ottenere la seconda combinazione di protettivi.
4. Aggiungere ciascuno dei coadiuvanti di essiccazione all'acqua ultrapura (1:10) e sottoporli all'agitazione magnetica fino alla solubilizzazione.
5. Assicurarsi che i protettori e l'acqua siano omogenei, quindi aggiungere i pellet probiotici alla miscela e mescolare moderatamente per 20 minuti.

Tabella 1: Composizione dei coadiuvanti per l'essiccazione.

4. Essiccazione a spruzzo

1. Accendere lo spray dryer (SD) e impostare la portata del gas di essiccazione, la temperatura di essiccazione in ingresso e la portata e la pressione del gas dell'atomizzatore come segue:
   Temperatura di ingresso: 80 °C
   Portata d'aria: 60 m³/h
   Velocità di avanzamento: 4 g/min
   Flusso di atomizzazione: 17 L/min
   Pressione di atomizzazione: 1,5 kgf/cm²
   Diametro dell'ugello atomizzatore: 1 mm
2. Preparare la composizione dei protettori e aggiungere i pellet probiotici concentrati.
3. Avviare l'alimentazione della composizione probiotica (cellule più protettivi) attraverso una pompa peristaltica.
4. Avviare il timer e posizionare il recipiente di raccolta del prodotto quando la soluzione entra nell'atomizzatore.
5. Registrare la temperatura di uscita ogni 5 minuti per tenere traccia di possibili instabilità della temperatura.
6. Arrestare il timer quando tutta la composizione probiotica è stata alimentata alla SD.
7. Pesare il recipiente di raccolta del prodotto per determinare la quantità di composizione alimentata al sistema e la quantità di prodotto secco raccolto, per calcolare la resa di essiccazione (prodotto recuperato) attraverso un bilancio di massa nell'essiccatore.
8. Utilizzare latte scremato simulato per valutare l'effetto della temperatura sulla vitalità delle cellule probiotiche, impostando cinque diverse temperature di essiccazione a spruzzo (80 °C, 100 °C, 120 °C, 140 °C e 160 °C rispetto alle temperature di uscita di 59 °C, 70 °C, 83 °C, 96 °C e 108 °C).

5. Caratterizzazione delle polveri

1. Contenuto di umidità del prodotto
   1. Pesare con precisione 100 mg del prodotto essiccato e posizionarlo nel recipiente di titolazione dell'apparecchiatura Karl-Fischer.
   2. Premere il pulsante di iniziazione per avviare la titolazione bi-amperometrica dell'acqua presente nel campione.
2. Attività acquatiche
   1. Pesare 0,6 g di prodotto essiccato nel vano campione dell'igrometro a 25 °C.
   2. Chiudere il coperchio dell'apparecchiatura.
      NOTA: Il test si avvia automaticamente e si interrompe quando il campione raggiunge la pressione di vapore di equilibrio all'interno del compartimento del campione.

6. Vitalità probiotica

1. Diluire le sospensioni batteriche precedentemente preparate in 9 ml di acqua peptone (0,1%, v/v).
2. Vortice fino alla completa dispersione.
3. Eseguire diluizioni decimali seriali (1:10) in 9 mL di soluzione salina (0,9% NaCl).
4. Semiare le diluizioni su piastre di agar MRS e incubare a 37 °C per 24-48 ore.
5. Contare le unità formanti colonie (CFU/g) utilizzando un contacolonie con lente d'ingrandimento.
6. Calcolare la vitalità probiotica nel prodotto essiccato secondo la seguente equazione:
   EE (%) = (N∕N _o) × 100
   dove, N è il numero di cellule vitali dopo l'essiccazione a spruzzo e N_o è il numero di cellule batteriche prima dell'essiccazione a spruzzo.
7. Esprimere il numero di cellule vitali in CFU/g di dispersione del prodotto.

7. Analisi dei dati

1. Tabulare i dati ottenuti in un software statistico ed eseguire l'analisi utilizzando un test di confronto multiplo (ANOVA).

In questo studio, L. paraplantarum è stato incapsulato da SD utilizzando agenti incapsulanti per uso alimentare (inulina: maltodestrina e latte in polvere simulato), dimostrando un'elevata qualità del prodotto ed efficacia nel preservare la vitalità cellulare batterica17,19.

I risultati della SD dei probiotici a 80 °C hanno mostrato che i distinti sistemi protettivi (inulina: maltodestrina e latte scremato simulato) hanno promosso una protezione efficiente delle cellule probiotiche, con vitalità rispettivamente del 95,1% e del 97,0%. La resa del prodotto è stata vicina al 50% p/p per entrambi i sistemi di protezione ed è stata leggermente superiore per il latte scremato simulato, che ha generato un prodotto con un aspetto e una fluidità migliori. Quindi, la composizione probiotica combinata con il latte scremato simulato è stata sottoposta ad essiccazione a spruzzo a temperature più elevate da 80 ° C a 160 ° C (Figura 1).

Come previsto, l'aumento della temperatura SD tendeva a diminuire la vitalità probiotica, che raggiungeva quasi l'80% a 160 °C. Si può anche vedere nella figura 1 che l'effetto della temperatura di essiccazione sulla resa del prodotto è stato trascurabile, con un valore medio del 50,7% ± 2,4% p/p; Questi valori sono comunemente osservati per gli spray dryer su scala di laboratorio. Questi risultati indicano che il latte scremato simulato è un buon sistema protettivo per l'essiccazione probiotica, in quanto genera un prodotto di alta qualità con buone prestazioni del sistema (resa del prodotto).

Il contenuto di umidità delle polveri e l'attività dell'acqua sono diminuiti inversamente con la temperatura di essiccazione a spruzzo, come previsto (Figura 2).

Figura 1: Resa in polvere (%) e vitalità probiotica (%) in base alla temperatura SD (°C), con latte scremato simulato come coadiuvante di essiccazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Contenuto di umidità e attività dell'acqua dei campioni probiotici essiccati in base alla temperatura SD (°C), con latte scremato simulato come sistema protettivo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.