Il presente studio fornisce un protocollo modificato per isolare i macrofagi sinoviali e i fibroblasti dal tessuto dell'artrite infiammatoria murina.
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Articolo metodologico
Isolamento e coltura di macrofagi sinoviali primari e fibroblasti da tessuto di artrite murina
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'artrite reumatoide è una malattia autoimmune che porta all'infiammazione cronica delle articolazioni. I macrofagi sinoviali e i fibroblasti sinoviali hanno ruoli centrali nella patogenesi dell'artrite reumatoide. È importante comprendere le funzioni di entrambe le popolazioni cellulari per rivelare i meccanismi alla base della progressione patologica e della remissione nell'artrite infiammatoria. In generale, le condizioni sperimentali in vitro dovrebbero imitare il più possibile l'ambiente in vivo . Le cellule primarie derivate dai tessuti sono state utilizzate in esperimenti che caratterizzano i fibroblasti sinoviali nell'artrite. Al contrario, negli esperimenti che studiano le funzioni biologiche dei macrofagi nell'artrite infiammatoria, sono state utilizzate linee cellulari, macrofagi derivati dal midollo osseo e macrofagi derivati dai monociti del sangue. Tuttavia, non è chiaro se tali macrofagi riflettano effettivamente le funzioni dei macrofagi residenti nei tessuti. Per ottenere macrofagi residenti, i protocolli precedenti sono stati modificati per isolare ed espandere sia i macrofagi primari che i fibroblasti dal tessuto sinoviale in un modello murino di artrite infiammatoria. Queste cellule sinoviali primarie possono essere utili per l'analisi in vitro dell'artrite infiammatoria.
Introduzione
L'artrite reumatoide (RA) è una malattia autoimmune caratterizzata da iperplasia della sinovia, che porta alla distruzione articolare 1,2. I macrofagi e i fibroblasti residenti nei tessuti sono presenti nella sinovia sana per mantenere l'omeostasi articolare. Nei pazienti con AR, i fibroblasti sinoviali (SF) proliferano e le cellule immunitarie, compresi i monociti, si infiltrano nella sinovia e nel liquido articolare, processi associati all'infiammazione 1,3,4. I macrofagi sinoviali (SM), che comprendono i macrofagi ....
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Protocollo
Gli esperimenti che coinvolgono animali sono stati approvati dall'Animal Experiment Committee dell'Università di Ehime e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida dell'Università di Ehime per gli esperimenti sugli animali (37A1-1 * 16).
1. Preparazione di strumenti, reagenti e terreno di coltura
- Preparare il terreno di coltura come segue: integrare Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) con siero bovino fetale al 10% (FBS) e soluzione antibiotico-antimicotica all'1% (anti-anti).
- Preparare il mezzo di digestione come segue: integrare il terreno di coltura con 1 mg/ml di collagenasi di tipo IV. R....
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Risultati
I topi femmina C57BL / 6 a 7-8 settimane di età sono stati sottoposti ad artrite indotta da anticorpi collagene. Le cellule simili ai macrofagi e le cellule simili ai fibroblasti sono state isolate indipendentemente dal tessuto dell'artrite infiammatoria secondo la procedura sopra descritta (Figura 2A, B). Le cellule simili ai macrofagi sono state immediatamente utilizzate dopo la fase 5.7. Le cellule simili ai fibroblasti sono state inizialmente coltivate per essere sub-con.......
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Discussione
Questo metodo sviluppato qui migliora le tecniche precedenti per isolare sia le SF dall'artrite murina che i macrofagi residenti da un certo numero di organi 7,11. Il metodo modificato può isolare sia i macrofagi che i fibroblasti dalla sinovia infiammatoria con elevata purezza ed è semplice e riproducibile. Poiché il metodo non richiede strumenti complessi come uno smistatore cellulare, chiunque può condurlo. Inoltre, la presente tecnica evita preoccupazioni ass.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano lo staff della Division of Medical Research Support, l'Advanced Research Support Center (ADRES) e i membri della Division of Integrative Pathophysiology, Proteo-Science Center (PROS), Ehime University, per la loro assistenza tecnica e il loro utile supporto. Questo studio è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni KAKENHI della Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (a NS) e JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (a YI); sovvenzioni della Osaka Medical Research Foundation for Intractable Diseases, The Nakatomi Foundation, The Japanese Society for Bone and Mineral Research (JSBMR....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5,0 g/L di tripsina/5,3 mmol/L di soluzione di EDTA | nacalai tesque | 35556-44 | Diluito con antibiotico HBSS |
| ... antimicotico (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Ago a farfalla | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Filtro cellulare | Falcon | 352340 | 40 µ m poro, Nylon |
| Cellmatrix Tipo I-C | Gelatina Nitta | 637-00773 | Collagene Tipo I-C |
| Provetta Centriguge 15 | TPP | 91014 | Provetta da 15 mL Provetta |
| Centriguge 50 | TPP | 91050 | Provetta da 50 mL |
| Collagenasi da C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Tipo IV collagenasi |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | SIGAM | 173012 | È stata eseguita l'inattivazione del calore |
| salina bilanciata di Hanks (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Piatto per coltura tissutale 40 | TPP | 93040 | Per coltura cellulare |
| Piatto per coltura tissutale 60 | TPP | 92006 | Per colture cellulari |
| Pinzette | KFI | 1-9749-31 | Pinzette a punta fine |
| Bio Research Center | PRI28-1522 | Punta seghettata | |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscopio |
Riferimenti
- Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. Rheumatoid arthritis. Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).
- Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S.
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Ristampe e permessi
