Analisi di goccioline lipidiche colorate con fluorescenza con ricostruzione 3D per la valutazione della steatosi epatica

Sommario

Qui, dimostriamo un protocollo ottimizzato basato sulla fluorescenza BODIPY 493/503 per la caratterizzazione delle goccioline lipidiche nel tessuto epatico. Attraverso l'uso di proiezioni ortogonali e ricostruzioni 3D, il fluoroforo consente una discriminazione di successo tra steatosi microvescicolare e macrovescicolare e può rappresentare un approccio complementare ai protocolli istologici classici per la valutazione della steatosi epatica.

Abstract

Le goccioline lipidiche (LD) sono organelli specializzati che mediano l'accumulo lipidico e svolgono un ruolo molto importante nel sopprimere la lipotossicità e prevenire le disfunzioni causate dagli acidi grassi liberi (FA). Il fegato, dato il suo ruolo critico nel metabolismo dei grassi del corpo, è costantemente minacciato dall'accumulo intracellulare di LD sotto forma di steatosi epatica sia microvescicolare che macrovescicolare. La caratterizzazione istologica delle LD si basa tipicamente su coloranti diazo liposolubili, come la colorazione Oil Red O (ORO), ma una serie di svantaggi ostacola costantemente l'uso di questa analisi con campioni di fegato. Più recentemente, i fluorofori lipofili 493/503 sono diventati popolari per visualizzare e localizzare le LD a causa del loro rapido assorbimento e accumulo nel nucleo delle goccioline lipidiche neutre. Anche se la maggior parte delle applicazioni sono ben descritte in colture cellulari, ci sono meno prove che dimostrano l'uso affidabile di sonde fluorofore lipofile come strumento di imaging LD in campioni di tessuto. Qui, proponiamo un protocollo ottimizzato basato su dipirrometene di boro (BODIPY) 493/503 per la valutazione delle LD in campioni di fegato da un modello animale di steatosi epatica indotta da dieta ricca di grassi (HFD). Questo protocollo copre la preparazione del campione di fegato, il sezionamento dei tessuti, la colorazione BODIPY 493/503, l'acquisizione delle immagini e l'analisi dei dati. Dimostriamo un aumento del numero, dell'intensità, del rapporto di area e del diametro delle LD epatiche durante l'alimentazione HFD. Utilizzando proiezioni ortogonali e ricostruzioni 3D, è stato possibile osservare l'intero contenuto di lipidi neutri nel nucleo LD, che apparivano come goccioline quasi sferiche. Inoltre, con il fluoroforo BODIPY 493/503, siamo stati in grado di distinguere microvescicole (1 μm < d ≤ 3 μm), vescicole intermedie (3 μm < d ≤ 9 μm) e macrovescicole (d > 9 μm), consentendo la corretta discriminazione della steatosi microvescicolare e macrovescicolare. Nel complesso, questo protocollo basato sulla fluorescenza BODIPY 493/503 è uno strumento affidabile e semplice per la caratterizzazione epatica della LD e può rappresentare un approccio complementare ai protocolli istologici classici.

Introduzione

Le goccioline lipidiche (LD), classicamente viste come depositi di energia, sono organelli cellulari specializzati che mediano l'accumulo di lipidi e comprendono un nucleo lipidico neutro idrofobico, che contiene principalmente esteri di colesterolo e trigliceridi (TG), incapsulati da un monostrato fosfolipidico ^1,2,3.

La biogenesi LD avviene nel reticolo endoplasmatico (ER), iniziando con la sintesi di triacilglicerolo (TAG) ed esteri sterolici. I lipidi neutri sono diffusi tra i lembi del doppio strato ER a basse concentrazioni, ma si fondono in ....

Protocollo

Tutte le procedure animali eseguite in questo studio sono state approvate dall'Istituto di Coimbra per la ricerca clinica e biomedica (iCBR) Animal Welfare Body (ORBEA, # 9/2018) e conformi alle direttive nazionali ed europee sulla cura degli animali e alle linee guida ARRIVE.

1. Progettazione sperimentale

1. Coppia di ratti Wistar maschi di 13 settimane in gabbie ventilate in condizioni ambientali controllate di temperatura (22 °C ± 1 °C), umidità (50%-60%) e luce (ciclo luce-buio 12 ore) e con accesso ad libitum all'acqua del rubinetto e al chow standard per roditori.
2. Dopo un periodo di acclimata....

Risultati

L'esecuzione di successo di questa tecnica dovrebbe comportare una chiara colorazione delle goccioline lipidiche per la caratterizzazione simultanea della morfologia LD (forma e densità del nucleo lipidico basata sulla ricostruzione 3D) insieme alla loro distribuzione spaziale, numero per area totale e dimensione media (valutata con la pipeline sopra descritta, Figura 1).

Discussione

Questo protocollo basato sulla fluorescenza BODIPY 493/503 per la valutazione della LD mirava a sviluppare un nuovo approccio di imaging per la valutazione della steatosi epatica. Data la forte correlazione tra obesità e steatosi epatica, la dieta ricca di grassi in stile occidentale è stata utilizzata per stabilire un modello animale di steatosi epatica²⁶. Un robusto aumento del contenuto di TG epatici è stato confermato da un kit di test colorimetrici quantitativi dei trigliceridi, che ha sugger.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubo in silicone con diametro interno da 1,6 mm, mini set di gocciolamento per flebo	Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)	Sigma-Aldrich, Lione, Francia	D3922
4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR	D1306
Etanolo al 70%	Honeywell	10191455
Adobe Illustrator CC	Adobe Inc.	Utilizzato per progettare le figure
Analizzatore automatico Hitachi 717	Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germania	8177-30-0010
Penna barriera (Liquid blocker super pap pen)	Daido Sangyo Co., Ltd, Japon	_
Blade	Leica	221052145	Utilizzato nel criostato
Cell Profiler versione 4.2.5	https://cellprofiler.org/releases/	Utilizzato per analizzare le immagini
Vetrini coprioggetti	Menzel-Glaser, Germania	_
Cryomolds	Tissue-Tek	_
Cryostat (incluso disco per campioni ed estrattore di calore) CM3050 S	Leica Biosystems	_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D-8418	Utilizzato per sciogliere la bodipia per la soluzione madre da 5 mg/mL. ATTENZIONE: Tossico e infiammabile. I vapori possono causare irritazione . Manipolare in una cappa fume . Evitare il contatto diretto con la pelle. Indossare guanti di gomma, occhiali protettivi per gli occhi .
Contenitore per ghiaccio secco (raffreddatore di polistirolo)	Novolab	A26742
Pinza Dumont	Fine Science Tools, Germania	11295-10
Piastra di Petri in vetro (H 25 mm, ø 150 mm)	Thermo Scientific	150318	Utilizzato per pesare il fegato dopo la dissezione
Glycergel	DAKO Omnis	S303023
GraphPad Prism software, versione 9.3.1	GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
Dieta ricca di grassi	Envigo, Barcellona, Spagna	MD.08811
Ketamina (Nimatek  100 mg/mL)	Dechra	791/01/14DFVPT	Utilizzato ad una concentrazione finale di 75 mg/kg
Microscopio confocale a scansione laser  (unità di rilevamento QUASAR; )	Carl Zeiss, germania	LSM 710 Axio Observer Z1 microscopio
Medetomidina (Sedatore 1 mg/mL)	Dechra	1838 ESP / 020/01/07RFVPT	Utilizzato a una concentrazione finale di 1 mg/kg
Ago	BD microlancia	300635
No 15 Bisturi sterile in acciaio al carbonio Lama	Swann-Morton	205
Obiettivi 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) e 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)	Carl Zeiss, Germania
Pennelli	Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X	Utilizzato per gestire criosezioni
Pompa peristaltica (Minipuls 3)	Gilson	1004170
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH ~ 7,4)	Sigma-Aldrich, Lione, Francia	P3813
Manico per bisturi, 125 mm (5"), n. 3	Swann-Morton	0208
Sistema di colorazione per vetrini StainTray	Simport Scientific	M920
Dieta standard	Mucedola	4RF21
Superfrost Plus vetrini per microscopio	Menzel-Glaser, Germania	J1800AMNZ
Terreni di montaggio Tissue-Tek OCT	VWR CHEMICALS	361603E
per trigliceridi	Cayman Chemical	10010303
Bagno ad ultrasuoni	Bandelin Sonorex	TK 52
Molla Vannas forbici - 3 mm tagliente	Fine Science Tools, Germania	15000-00
ZEN Nero software	Zeiss