Articolo metodologico

Preparato a base di metanolo a montaggio intero per lo studio delle cellule gangliari retiniche

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DOI:

10.3791/65222

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7 aprile 2023

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1Department of Ophthalmology, Renmin Hospital of Wuhan University

In questo articolo

Sommario

Il metanolo può essere utilizzato come mezzo fisso ausiliario per preparazioni retiniche a montaggio intero e conservazione a lungo termine, utile per lo studio delle cellule gangliari retiniche.

Abstract

Le cellule gangliari retiniche (RGC), che sono i neuroni di proiezione della retina, propagano le informazioni visive esterne al cervello. I cambiamenti patologici nelle RGC hanno una stretta relazione con numerose malattie degenerative della retina. L'immunocolorazione retinica a montaggio intero è frequentemente utilizzata negli studi sperimentali sulle RGC per valutare le condizioni di sviluppo e patologiche della retina. In alcune circostanze, alcuni preziosi campioni di retina, come quelli di topi transgenici, potrebbero dover essere conservati per un lungo periodo senza influenzare la morfologia o il numero di RGC. Per risultati sperimentali credibili e riproducibili, l'utilizzo di un mezzo di conservazione efficace è essenziale. Qui, descriviamo l'effetto del metanolo come mezzo fisso ausiliario per i preparati retinici a montaggio intero e la conservazione a lungo termine. In breve, durante il processo di isolamento, il metanolo freddo (-20 °C) viene pipettato sulla superficie della retina per aiutare a fissare i tessuti e facilitarne la permeabilità, quindi le retine possono essere conservate in metanolo freddo (-20 °C) prima di essere immunocolorate. Questo protocollo descrive il flusso di lavoro di isolamento della retina e il protocollo di conservazione dei campioni di tessuto, che è utile e pratico per lo studio delle RGC.

Introduzione

Le cellule gangliari retiniche (RGC) sono gli unici neuroni di proiezione nella retina e integrano e trasmettono informazioni visive esterne al cervello1. Molte malattie neurodegenerative come il glaucoma e la neuropatia ottica traumatica sono caratterizzate da danni irreversibili e perdita di RGC 2,3. L'analisi dei cambiamenti morfologici e quantitativi delle RGC è un passo cruciale nel determinare come le malattie neurodegenerative si sviluppano e avanzano 4,5.

Il saggio di immunofluorescenza indiretta è un metodo ampiamente accettato per monitorare la distribuzione delle proteine e il conteggio delle cellule. In laboratorio, l'immunocolorazione retinica a montaggio intero è comunemente utilizzata negli studi sperimentali sulle RGC per valutare le condizioni fisiologiche e patologiche della retina6. I marcatori più comuni utilizzati per la quantificazione RGC nell'intera retina includono Brn3a, RNA binding protein with multiple splicing (RBPMS), e così via 7,8. La caratterizzazione della quantità e della distribuzione delle RGC richiede un'immunocolorazione retinica a montaggio intero di alta qualità. Generalmente, nei protocolli di immunocolorazione, la retina viene immersa in fissativi chimici prima di essere incubata in anticorpi. I fissativi ideali non dovrebbero cambiare la forma delle cellule, l'accessibilità o l'affinità degli epitopi per gli anticorpi o le dimensioni lineari del tessuto 9,10.

A causa della complessa struttura della retina, problemi come la fragilità e il ripiegamento della retina, così come alcune difficoltà comuni tra cui il restringimento delle cellule e nuclei poco chiari, sono inclini a verificarsi quando si realizza un cerotto retinico a montaggio intero, che ha un impatto negativo sulla ricerca sperimentale. Inoltre, non tutte le retine sono immunocolorate immediatamente, specialmente quando si tratta di retine di topi transgenici con prezzi costosi che sono di origine preziosa, rendendo necessaria la conservazione dei campioni retinici extra per un ulteriore utilizzo.

La soluzione fissativa appropriata può fissare rapidamente il tessuto, evitare l'autolisi tissutale, preservare la normale morfologia e struttura delle cellule tissutali e mantenere l'antigenicità delle proteine e di altre sostanze10. Allo stato attuale, la fissazione a base di formaldeide è stata ampiamente utilizzata in vari tessuti, tra cui retine separate, conchiglie oculari emisecate e bulbi oculari interi10. Il restringimento tissutale e l'alterazione morfologica delle cellule sono le due sfide critiche incontrate dopo l'immersione in formaldeide11. Inoltre, stanno emergendo sempre più formulazioni di fissazione modificate per massimizzare la conservazione delle proprietà originali della retina e delle cellule bersaglio 9,10. Diversi trattamenti di fissazione retinica possono influenzare la struttura retinica, l'immunogenicità delle proteine, l'eccitazione della fluorescenza e il ciclo di tempra dell'attenuazione in modo diverso12,13. Le retine fissate con la soluzione di Davidson sono morfologicamente più intatte rispetto a quelle fissate con formalina, ma la soluzione di Davidson è meno compatibile con alcuni anticorpi, come la molecola 112 dell'adattatore legante il calcio ionizzato con marcatore microgliale. Considerando la natura fragile delle retine, i ricercatori si chiederanno naturalmente se l'integrità della retina, così come le proprietà e la morfologia delle cellule bersaglio, cambieranno dopo la conservazione a lungo termine. Tuttavia, i possibili effetti della soluzione di fissazione sulla morfologia delle cellule retiniche e RGC dopo la conservazione per diversi mesi sono stati raramente riportati. L'ottimizzazione della fissazione retinica è fondamentale per la valutazione e la conservazione delle RGC.

Forniamo una descrizione dettagliata di un metodo affidabile e tecnicamente semplice che utilizziamo per la colorazione retinica murina a montaggio intero. Il nostro metodo enfatizza la corretta preparazione e conservazione delle retine per l'indagine RGC, tenendo conto della necessità di conservazione a lungo termine del tessuto retinico e degli aspetti specifici della formazione o della degradazione dei fluorofori.

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Protocollo

Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente se non diversamente indicato. Tutti i topi C57BL / 6J utilizzati sono stati ottenuti dal Laboratory Animal Center dell'Università di Wuhan e tutti gli esperimenti correlati sono stati approvati dal Comitato per l'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di Wuhan. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza dei topi.

1. Enucleazione e fissazione degli occhi

  1. Eutanasia dei topi con asfissia di anidride carbonica ed enucleare delicatamente il bulbo oculare usando una pinzetta senza denti.
  2. Risciacquare il bulbo oculare una volta in soluzione salina tamponata fosfato (PBS).
  3. Forare il bulbo oculare con un ago da siringa sulla cornea al microscopio (oculare WF: 10x/22; obiettivo di ingrandimento continuo: 0,67x-4,5x) per accelerare la fissazione nel bulbo oculare e migliorare l'efficienza di fissaggio.
  4. Trasferire in una piastra a 24 pozzetti contenente il 4% di paraformaldeide (PFA).
  5. Fissare il bulbo oculare in PFA al 4% per 45 minuti, quindi trasferirlo a 1x PBS per rimuovere immediatamente il PFA in eccesso (lavare tre volte, 5 minuti / tempo).

2. Isolamento e appiattimento della retina

  1. Trasferire il bulbo oculare su un vetrino e posizionarlo sotto un microscopio da dissezione (oculare WF: 10x/22; obiettivo di ingrandimento continuo: 0,67x-4,5x).
  2. Tenere la pinza in una mano e usarla per bloccare il margine della cornea per impedire il movimento del bulbo oculare. Utilizzare l'altra mano per tenere le forbici da dissezione e tagliare intorno alla cornea a circa 1 mm di profondità attraverso il limbus corneosclerale. Rimuovere la lente e il corpo vitreo.
  3. Tenere il disco ottico al centro e, usando le forbici da dissezione, tagliare la retina radialmente lungo i quattro quadranti, raggiungendo circa i 2/3 del raggio della retina.
  4. Morseggiare uno dei bordi sclerali usando una pinza dentata. Con l'altra mano, tenere il bordo della sclera con una pinza non dentata e spostarsi da dove la sclera è fissata dalla pinza dentata verso la base della sclera. Sbucciare con cura la retina.
  5. Estrarre il PBS utilizzando una pipetta (200 μL) per lavare e bagnare la retina, quindi rimuovere l'eccesso di PBS con un piccolo pezzo di carta assorbente. Se necessario, appiattire delicatamente la retina con una piccola spazzola a setole.
  6. Pipettare lentamente il metanolo freddo (preraffreddato in un congelatore a -20°C) goccia a goccia sulla superficie interna della retina (il volume di metanolo non è fisso, purché la retina possa essere completamente coperta dal metanolo). La retina diventa bianca e sviluppa una maggiore tenacità.
  7. Appiattire delicatamente la retina e rimuovere le impurità come le membrane pigmentarie residue e il corpo vitreo con piccole spazzole di setole. Capovolgere la retina usando piccoli pennelli a setole e ripetere il processo sopra menzionato.
  8. Trasferire la retina trattata con metanolo in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e tenerla imbevuta di metanolo.
  9. Conservarlo a -20°C per 1-2 ore per un'immunocolorazione immediata, oppure lasciare la retina in metanolo e conservarlo a -20°C per la conservazione a lungo termine.
  10. Rimuovere il metanolo dalla piastra a 24 pozzetti e sciacquare la retina con 1x PBS.

3. Colorazione immunofluorescente delle RGC

  1. Trasferire con cautela la retina su una piastra di emoagglutinazione a 24 pozzetti con una pipetta Pasteur di plastica e bloccare il 5% di PBS-TX-BSA (5 g di polvere di albumina sierica bovina sciolta in 100 ml di soluzione 1x PBST; il PBST si forma aggiungendo 10 ml di Triton X-100 a 2.000 ml di 1 x PBS) a temperatura ambiente per 4 ore o durante la notte a 4 °C. Tenere il ganglio rivolto verso l'alto.
  2. Rimuovere il PBS-TX-BSA, e incubare la retina a 4 °C per 48-96 ore, aggiungendo 100 μL dell'anticorpo primario selezionato (anticorpo anti-RBPMS cavia) utilizzando una diluizione 1:400.
  3. Rimuovere l'anticorpo primario e sciacquare la retina tre volte (20 minuti ciascuna) con 1x PBS, agitando a temperatura ambiente.
  4. Incubare la retina agitando delicatamente per una notte a 4 °C con 100 μL del corrispondente anticorpo secondario (vedere tabella dei materiali), cianina Cy3 affiniPuro porcellino d'asino anti-cavia IgG (H + L), utilizzando una diluizione 1:400.
  5. Risciacquare la retina con 1x PBS tre volte (20 minuti ciascuna).
  6. Appoggiare la retina piatta sul vetrino con lo strato di cellule gangliari rivolto verso l'alto, far cadere una quantità appropriata di agente di estinzione anti-fluorescenza intorno alla retina con una pipetta e coprire il vetrino con un coprivetrino (fare attenzione a non avere bolle).
    NOTA: Per determinare la quantità appropriata di quencher anti fluorescenza, assicurarsi che copra l'intera retina. Successivamente, coprire il vetrino senza consentire alla retina di galleggiare e muoversi facilmente.
  7. Sigillare il vetrino tutt'intorno con un sigillante per evitare che si muova. Conservare i campioni a -20°C e proteggerli dalla luce.
  8. Immagine della retina utilizzando un microscopio a fluorescenza / confocale.

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Risultati

Dopo la dissezione, la retina dovrebbe apparire come un trifoglio piatto a quattro foglie. In questo studio, utilizzando il protocollo sopra descritto, la retina è diventata bianca dopo l'aggiunta di metanolo (Figura 1). Nel frattempo, la retina è cambiata da morbida a flessibile e piatta. Successivamente, gli RGC sono stati etichettati con anti-RBPMS8. Quattro campi di immagini sono stati presi nella retina a montatura intera (n = 3) utilizzando un microscopio confoc...

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Discussione

La fissazione è un passaggio essenziale per preservare la retina, che può influire su eventuali successive indagini RGC basate sulla morfologia. Una fissazione di successo cattura rapidamente la struttura e lo stato delle retine al momento di esporle al mezzo di fissaggio, che è fondamentale per ulteriori analisi. Sebbene la formaldeide sia stata considerata uno degli agenti fissanti più comuni per la fissazione e la conservazione di tessuti e cellule, la formaldeide da sola non sempre funziona bene come fissativo chimic...

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Dichiarazioni

Gli autori non sono a conoscenza di affiliazioni, appartenenze, finanziamenti o partecipazioni finanziarie che potrebbero influenzare l'obiettività di questo studio.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dall'Hubei Key Laboratories Opening Project (sovvenzione n. 2021KFY055), dalla Natural Science Foundation of Hubei Province (grant n. 2020CFB240) e dai Fundamental Research Funds for the Central Universities (grant no. 2042020kf0065).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cluster di colture cellulari a 24 pozzettiCostarFissazione del bulbo oculare
Piastra per emoagglutinazione a 24 pozzettiLabedit CompanyIncubazione anticorpo
Vetrini per microscopio di adesioneCitotestO simile
Montante di quenching anti-fluorescenzaServicebioG1401Rallenta il quenching della fluorescenza
BSA (albumina sierica bovina)ServicebioGC305010Reagente bloccante
Microscopio confocaleOLYMPUSApplicare obiettivo 40x
Forbici curveJiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.Strumenti di dissezione
Microscopio di dissezioneRWD Life science Co., LTD 77001SStrumenti di dissezione
PinzeJiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.Strumenti di dissezione
MethanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.20210624GC≥ 99,5%
Smalto per unghieSecheViteAgente sigillante
Aghi Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.Accelerare la fissazione Soluzione
paraformaldeideServicebioG1101Fissazione del bulbo oculare
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato pH 7,4)ServicebioG0002Risciacquare il bulbo oculare 
Anticorpo primario: proteina anti-RNA-legante cavia con splicing multiplo (RBPMS)PhoSolutionsCat. #1832-RBPMSPer immunofluorescenza. Utilizzato a 1:400
Anticorpo secondario: Cy3 affiniPure donkey anti-cavia IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch706-165-148Per l'immunofluorescenza. Usato a 1:400
Forbici diritteJiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.Strumenti di dissezione
di

Riferimenti

  1. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  2. Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
  3. Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070(2022).
  4. Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
  5. Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
  6. Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31(2020).
  7. Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
  8. Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
  9. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  10. Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
  11. Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
  12. Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
  13. Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
  14. Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
  15. Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59(2012).
  16. Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260(2022).
  17. Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
  18. Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
  19. Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
  20. Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
  21. Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
  22. Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).

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