Il metanolo può essere utilizzato come mezzo fisso ausiliario per preparazioni retiniche a montaggio intero e conservazione a lungo termine, utile per lo studio delle cellule gangliari retiniche.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Preparato a base di metanolo a montaggio intero per lo studio delle cellule gangliari retiniche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule gangliari retiniche (RGC), che sono i neuroni di proiezione della retina, propagano le informazioni visive esterne al cervello. I cambiamenti patologici nelle RGC hanno una stretta relazione con numerose malattie degenerative della retina. L'immunocolorazione retinica a montaggio intero è frequentemente utilizzata negli studi sperimentali sulle RGC per valutare le condizioni di sviluppo e patologiche della retina. In alcune circostanze, alcuni preziosi campioni di retina, come quelli di topi transgenici, potrebbero dover essere conservati per un lungo periodo senza influenzare la morfologia o il numero di RGC. Per risultati sperimentali credibili e riproducibili, l'utilizzo di un mezzo di conservazione efficace è essenziale. Qui, descriviamo l'effetto del metanolo come mezzo fisso ausiliario per i preparati retinici a montaggio intero e la conservazione a lungo termine. In breve, durante il processo di isolamento, il metanolo freddo (-20 °C) viene pipettato sulla superficie della retina per aiutare a fissare i tessuti e facilitarne la permeabilità, quindi le retine possono essere conservate in metanolo freddo (-20 °C) prima di essere immunocolorate. Questo protocollo descrive il flusso di lavoro di isolamento della retina e il protocollo di conservazione dei campioni di tessuto, che è utile e pratico per lo studio delle RGC.
Introduzione
Le cellule gangliari retiniche (RGC) sono gli unici neuroni di proiezione nella retina e integrano e trasmettono informazioni visive esterne al cervello1. Molte malattie neurodegenerative come il glaucoma e la neuropatia ottica traumatica sono caratterizzate da danni irreversibili e perdita di RGC 2,3. L'analisi dei cambiamenti morfologici e quantitativi delle RGC è un passo cruciale nel determinare come le malattie neurodegenerative si sviluppano e avanzano 4,5.
Il saggio di immunofluorescenza indire....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente se non diversamente indicato. Tutti i topi C57BL / 6J utilizzati sono stati ottenuti dal Laboratory Animal Center dell'Università di Wuhan e tutti gli esperimenti correlati sono stati approvati dal Comitato per l'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di Wuhan. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza dei topi.
1. Enucleazione e fissazione degli occhi
- Eutanasia dei topi con asfissia di anidride carbonica ed enucleare delicatamente il bulbo oculare usando una pinzetta senza denti.
- Risciacquare il bulbo ocu....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Dopo la dissezione, la retina dovrebbe apparire come un trifoglio piatto a quattro foglie. In questo studio, utilizzando il protocollo sopra descritto, la retina è diventata bianca dopo l'aggiunta di metanolo (Figura 1). Nel frattempo, la retina è cambiata da morbida a flessibile e piatta. Successivamente, gli RGC sono stati etichettati con anti-RBPMS8. Quattro campi di immagini sono stati presi nella retina a montatura intera (n = 3) utilizzando un microscopio confoc.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La fissazione è un passaggio essenziale per preservare la retina, che può influire su eventuali successive indagini RGC basate sulla morfologia. Una fissazione di successo cattura rapidamente la struttura e lo stato delle retine al momento di esporle al mezzo di fissaggio, che è fondamentale per ulteriori analisi. Sebbene la formaldeide sia stata considerata uno degli agenti fissanti più comuni per la fissazione e la conservazione di tessuti e cellule, la formaldeide da sola non sempre funziona bene come fissativo chimic.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non sono a conoscenza di affiliazioni, appartenenze, finanziamenti o partecipazioni finanziarie che potrebbero influenzare l'obiettività di questo studio.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dall'Hubei Key Laboratories Opening Project (sovvenzione n. 2021KFY055), dalla Natural Science Foundation of Hubei Province (grant n. 2020CFB240) e dai Fundamental Research Funds for the Central Universities (grant no. 2042020kf0065).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cluster di colture cellulari a 24 pozzetti | Costar | Fissazione del bulbo oculare | |
| Piastra per emoagglutinazione a 24 pozzetti | Labedit Company | Incubazione anticorpo | |
| Vetrini per microscopio di adesione | Citotest | O simile | |
| Montante di quenching anti-fluorescenza | Servicebio | G1401 | Rallenta il quenching della fluorescenza |
| BSA (albumina sierica bovina) | Servicebio | GC305010 | Reagente bloccante |
| Microscopio confocale | OLYMPUS | Applicare obiettivo 40x | |
| Forbici curve | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Strumenti di dissezione | |
| Microscopio di dissezione | RWD Life science Co., LTD | 77001S | Strumenti di dissezione |
| Pinze | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Strumenti di dissezione | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥ 99,5% |
| Smalto per unghie | SecheVite | Agente sigillante | |
| Aghi | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerare la fissazione Soluzione | |
| paraformaldeide | Servicebio | G1101 | Fissazione del bulbo oculare |
| PBS (soluzione salina tamponata con fosfato pH 7,4) | Servicebio | G0002 | Risciacquare il bulbo oculare |
| Anticorpo primario: proteina anti-RNA-legante cavia con splicing multiplo (RBPMS) | PhoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | Per immunofluorescenza. Utilizzato a 1:400 |
| Anticorpo secondario: Cy3 affiniPure donkey anti-cavia IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | Per l'immunofluorescenza. Usato a 1:400 |
| Forbici diritte | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Strumenti di dissezione |
Riferimenti
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
