Method Article

Scaffold decellularizzati derivati da mele per l'ingegneria del tessuto osseo in vitro e in vivo

DOI:

10.3791/65226

⸱

February 23rd, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, University of Ottawa, 2Department of Biology, University of Ottawa, 3Department of Mechanical Engineering, University of Ottawa, 4Department of Surgery, University of Ottawa, 5Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 6Institute for Science, Society and Policy, University of Ottawa, 7SymbioticA, School of Human Sciences, University of Western Australia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo studio, descriviamo in dettaglio i metodi di decellularizzazione, caratterizzazione fisica, imaging e impianto in vivo di biomateriali a base vegetale, nonché metodi per la semina e la differenziazione cellulare negli scaffold. I metodi descritti consentono la valutazione di biomateriali di origine vegetale per applicazioni di ingegneria del tessuto osseo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I biomateriali di cellulosa di origine vegetale sono stati impiegati in varie applicazioni di ingegneria tissutale. Studi in vivo hanno dimostrato la notevole biocompatibilità di scaffold realizzati in cellulosa derivata da fonti naturali. Inoltre, questi scaffold possiedono caratteristiche strutturali rilevanti per più tessuti e promuovono l'invasione e la proliferazione delle cellule dei mammiferi. Recenti ricerche che utilizzano tessuto di ipanzio di mela decellularizzato hanno dimostrato la somiglianza della dimensione dei suoi pori con quella dell'osso trabecolare, nonché la sua capacità di supportare efficacemente la differenziazione osteogenica. Il presente studio ha ulteriormente esaminato il potenziale degli scaffold di cellulosa derivati dalla mela per applicazioni di ingegneria del tessuto osseo (BTE) e ha valutato le loro proprietà meccaniche in vitro e in vivo . I preosteoblasti MC3T3-E1 sono stati seminati in scaffold di cellulosa derivati da mele che sono stati poi valutati per il loro potenziale osteogenico e le proprietà meccaniche. La colorazione con fosfatasi alcalina e rosso alizarina S ha confermato la differenziazione osteogenica in scaffold coltivati in terreno di differenziamento. L'esame istologico ha dimostrato un'invasione cellulare diffusa e una mineralizzazione attraverso gli scaffold. La microscopia elettronica a scansione (SEM) ha rivelato aggregati minerali sulla superficie degli scaffold e la spettroscopia a dispersione di energia (EDS) ha confermato la presenza di elementi fosfato e calcio. Tuttavia, nonostante un aumento significativo del modulo di Young in seguito alla differenziazione cellulare, è rimasto inferiore a quello del tessuto osseo sano. Studi in vivo hanno mostrato l'infiltrazione cellulare e la deposizione di matrice extracellulare all'interno degli scaffold derivati da mele decellularizzate dopo 8 settimane di impianto nella calvaria di ratto. Inoltre, la forza richiesta per rimuovere le impalcature dal difetto osseo era simile al carico di frattura precedentemente riportato dell'osso calvario nativo. Nel complesso, questo studio conferma che la cellulosa derivata dalla mela è un candidato promettente per le applicazioni BTE. Tuttavia, la dissomiglianza tra le sue proprietà meccaniche e quelle del tessuto osseo sano può limitarne l'applicazione a scenari a basso carico. Potrebbero essere necessarie ulteriori reingegnerizzazioni e ottimizzazioni strutturali per migliorare le proprietà meccaniche degli scaffold in cellulosa derivati dal melo per applicazioni portanti.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I difetti ossei di grandi dimensioni causati da una lesione o da una malattia spesso richiedono innesti di biomateriali per una rigenerazione completa1. Le attuali tecniche progettate per migliorare la rigenerazione del tessuto osseo utilizzano regolarmente innesti autologhi, allogenici, xenogenici o sintetici2. Per l'innesto osseo autologo, considerato la pratica di innesto "gold standard" per riparare grandi difetti ossei, l'osso viene estratto dal paziente. Tuttavia, questa procedura di innesto presenta diversi inconvenienti, tra cui limitazioni di dimensioni e forma, disponibilità di tessuti e morbilità del sito di campionamento3. Inoltre, le procedure di innesto autologo sono suscettibili di infezioni del sito chirurgico, conseguenti fratture, formazione di ematomi nel sito di prelievo o ricostruito e dolore post-operatorio4. L'ingegneria del tessuto osseo (BTE) offre una potenziale alternativa ai metodi convenzionali di innesto osseo5. Combina biomateriali strutturali e cellule per costruire nuovo tessuto osseo funzionale. Quando si progettano biomateriali per la BTE, è fondamentale combinare una struttura macroporosa, una chimica superficiale che promuova l'adesione cellulare e proprietà meccaniche che assomiglino molto a quelle dell'osso nativo6. Ricerche precedenti hanno indicato che la dimensione dei pori e il modulo elastico ideali per i biomateriali utilizzati nella BTE sono rispettivamente di circa 100-200 μm7 e 0,1-20 GPa, a seconda del sito di innesto8. Inoltre, la porosità e l'interconnessione dei pori degli scaffold sono fattori critici che influenzano la migrazione cellulare, la diffusione dei nutrienti e l'angiogenesi8.

La BTE ha mostrato risultati promettenti con vari biomateriali sviluppati e valutati come opzioni alternative agli innesti ossei. Alcuni di questi biomateriali sono materiali osteoinduttivi, materiali ibridi e idrogel avanzati8. I materiali osteoinduttivi stimolano lo sviluppo di strutture ossee di nuova formazione. I materiali ibridi sono composti da polimeri sintetici e/o naturali8. Gli idrogel avanzati imitano la matrice extracellulare (ECM) e sono in grado di fornire i fattori bioattivi necessari per promuovere l'integrazione del tessuto osseo8. L'idrossiapatite è un materiale tradizionale e una scelta comune per la BTE grazie alla sua composizione e biocompatibilità9. Il vetro bioattivo è un altro tipo di biomateriale per la BTE, che ha dimostrato di stimolare specifiche risposte cellulari per attivare i geni necessari per l'osteogenesi10,11. Anche i polimeri biodegradabili, tra cui il poli(acido glicolico) e il poli(acido lattico), sono stati ampiamente utilizzati nelle applicazioni BTE12. Infine, anche i polimeri naturali o di derivazione naturale come il chitosano, la chitina e la cellulosa batterica hanno dimostrato risultati incoraggianti per la BTE13. Tuttavia, mentre sia i polimeri sintetici che quelli naturali mostrano un potenziale per la BTE, lo sviluppo di un'impalcatura funzionale con la macrostruttura desiderata richiede in genere protocolli estesi.

Al contrario, le strutture macroscopiche native della cellulosa possono essere facilmente derivate da diverse piante e il nostro gruppo di ricerca ha precedentemente dimostrato l'applicabilità di scaffold a base di cellulosa derivati da piante a diverse ricostruzioni tissutali. Infatti, a seguito di un semplice trattamento con tensioattivi, abbiamo sfruttato la struttura intrinseca del materiale vegetale, evidenziandone il potenziale come biomateriale versatile14. Inoltre, questi scaffold a base di cellulosa possono essere utilizzati per applicazioni di coltura cellulare di mammifero in vitro 14, sono biocompatibili e supportano la vascolarizzazione sottocutanea spontanea 14,15,16,17. Sia il nostro gruppo di ricerca che altri hanno dimostrato che questi scaffold possono essere ottenuti da piante specifiche in base all'applicazione prevista 14,15,16,17,18,19,20. Ad esempio, la struttura vascolare osservata negli steli e nelle foglie delle piante mostra una sorprendente somiglianza con la struttura che si trova nei tessuti animali19. Inoltre, gli scaffold di cellulosa derivati dalle piante possono essere facilmente modellati e sottoposti a modifiche biochimiche superficiali per ottenere le caratteristiche desiderate16. In uno studio recente, abbiamo incorporato un tampone salino durante il processo di decellularizzazione, portando a un maggiore attaccamento cellulare osservato sia in vitro che in vivo 16. Nello stesso studio, abbiamo dimostrato l'applicabilità degli scaffold di cellulosa di origine vegetale nei biomateriali compositi mediante colata di idrogel sulla superficie degli scaffold. In studi recenti, la funzionalizzazione di scaffold di origine vegetale ha dimostrato di migliorarne l'efficacia18. Ad esempio, uno studio condotto da Fontana et al. (2017) ha rivelato che l'adesione dei fibroblasti dermici umani era supportata da steli decellularizzati rivestiti di RGD, mentre gli steli non rivestiti non mostravano la stessa capacità18. Inoltre, gli autori hanno anche dimostrato che il fluido corporeo simulato modificato potrebbe essere utilizzato per mineralizzare artificialmente gli steli delle piante decellularizzate. In studi più recenti, abbiamo esplorato il concetto di osteogenesi meccanosensibile negli scaffold di cellulosa di origine vegetale e valutato il loro potenziale per BTE17,20. Inoltre, Lee et al. (2019) hanno utilizzato scaffold di origine vegetale per coltivare tessuti simili alle ossa in un ambiente in vitro 21. Attraverso valutazioni complete di diverse fonti vegetali, gli autori hanno identificato gli scaffold derivati dalla mela come i più ottimali per la coltura e la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). Inoltre, gli autori hanno proposto che gli attributi strutturali e meccanici degli scaffold derivati dalle mele svolgano un ruolo fondamentale nella loro idoneità allo scopo previsto. Essendo i primi scaffold di origine vegetale implementati nelle applicazioni di ingegneria tissutale, gli scaffold derivati dal melo hanno ampiamente dimostrato di possedere un'architettura sorprendentemente simile a quella dell'osso umano, in particolare in termini di pori interconnessi che vanno da 100 a 200 μm di diametro14,21.

Nel presente studio, abbiamo ulteriormente studiato il potenziale degli scaffold di cellulosa derivati dalla mela per la BTE e condotto un'analisi delle loro proprietà meccaniche sia in vitro che in vivo. Sebbene ci siano stati studi sul potenziale degli scaffold derivati dalla mela per BTE 17,20,21, le loro proprietà meccaniche sono state poco studiate. I risultati hanno mostrato un'invasione selvaggia e una differenziazione osteogenica dei preosteoblasti MC3T3-E1 seminati in scaffold che sono stati coltivati in terreno di differenziazione per 4 settimane. Il modulo di Young di questi scaffold era di 192,0 ± 16,6 kPa, che era significativamente superiore a quelli degli scaffold vuoti (scaffold senza cellule seminate) (31,6 ± 4,8 kPa) e degli scaffold seminati in cellula coltivati in terreno di non-differenziazione (24,1 ± 8,8 kPa). Tuttavia, va notato che il modulo di Young del tessuto osseo umano sano rientra tipicamente nell'intervallo di 0,1-2 GPa per l'osso trabecolare e di circa 15-20 GPa per l'osso corticale8. Tuttavia, a seguito di un impianto di 8 settimane in un difetto calvario del roditore, gli scaffold seminati dalle cellule sembravano essere ben integrati nell'osso circostante, come dimostrato da una forza di picco media di 113,6 N ± 18,2 N nei test di push-out, che è simile al carico di frattura precedentemente riportato dell'osso calvario nativo22. Nel complesso, i risultati ottenuti da questo studio sono molto promettenti, in particolare per le applicazioni non portanti. Tuttavia, gli scaffold di cellulosa derivati dalla mela non possiedono attualmente le proprietà meccaniche necessarie per abbinare con precisione il tessuto osseo circostante in un sito implantare. Di conseguenza, è necessario un ulteriore sviluppo per sbloccare il pieno potenziale di questi scaffold.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Ottawa.

1. Preparazione dell'impalcatura

  1. Usa un'affettatrice a mandolina per tagliare le mele McIntosh (Canada Fancy) a fette spesse 8 mm. Tagliare il tessuto di ipanzio delle fette di mela in quadrati di 5 mm x 5 mm.
  2. Mettere i campioni quadrati in sodio dodecilsolfato (SDS) allo 0,1% per 2 giorni.
  3. Lavare i campioni decellularizzati con acqua deionizzata e incubarli per una notte a temperatura ambiente (RT) in 100 mM CaCl2 per rimuovere il tensioattivo rimanente.
  4. Sterilizzare i campioni (cioè gli scaffold) in etanolo al 70% per 30 minuti, lavarli con acqua deionizzata e metterli in una piastra di coltura a 24 pozzetti prima della semina cellulare.

2. Coltura cellulare e semina di scaffold

  1. Mantenere le cellule MC3T3-E1 Subclone 4 in piastre trattate con colture cellulari di 10 cm di diametro in condizioni di coltura cellulare (37°C in un'atmosfera umidificata con il 95% di aria e il 5% di CO2 ).
  2. Preparare il terreno di coltura cellulare costituito dal mezzo minimo essenziale di Eagle - modifica alfa (α-MEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina.
  3. Staccare le cellule dalle piastre di coltura mediante tripsinizzazione (0,05% tripsina-EDTA) una volta raggiunta l'80% di confluenza.
  4. Centrifugare la sospensione cellulare a circa 200 x g per 3 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in α-MEM a 2,5 x 107 cellule per mL.
  5. Pipettare un'aliquota di 40 μL della sospensione cellulare sulla superficie degli scaffold e lasciare che le cellule aderiscano per 1 ora in condizioni di coltura cellulare. Successivamente, aggiungere 2 mL di terreno di coltura a ciascun pozzetto di coltura della piastra di coltura.
  6. Rifornire il terreno di coltura ogni 2-3 giorni per 14 giorni.
  7. Preparare un terreno di differenziazione aggiungendo 50 μg/mL di acido ascorbico e 4 mM di fosfato di sodio al terreno di coltura cellulare descritto in precedenza.
  8. Indurre la differenziazione delle cellule MC3T3-E1 incubando gli scaffold nel mezzo di differenziazione per 4 settimane. Reintegrare il terreno ogni 3-4 giorni. Parallelamente, incubare gli scaffold in un terreno di coltura non differenziato (cioè un terreno senza gli integratori per indurre la differenziazione) per la stessa durata, con lo stesso programma di cambio del terreno per fungere da controllo negativo.

3. Misurazioni delle dimensioni dei pori mediante microscopia a scansione laser confocale

  1. Lavare gli scaffold derivati da mele decellularizzate con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
  2. Incubare gli scaffold in 1 mL di colorante bianco calcofluor al 10% (v/v) per 25 minuti al buio a RT.
  3. Lavare gli scaffold (n = 3) con PBS e visualizzare tre aree selezionate in modo casuale per scaffold con un microscopio a scansione laser confocale risonante (CLSM) ad alta velocità con ingrandimento 10x, utilizzando un canale DAPI, come segue:
    1. Configurazione filtro ad emissione laser: 405 nm (laser); 425-475 nm (emissione)
    2. Regolare manualmente la potenza del laser e il rilevatore per garantire un'acquisizione ottimale dell'immagine. Acquisisci uno z-stack di 20 immagini con una dimensione del passo di 5 μm.
  4. Utilizzando il software ImageJ, elaborare e analizzare le immagini confocali come segue:
    1. Utilizzate la funzione Z-Project to Maximum Intensity per creare un'immagine e applicate la funzione Trova bordi per evidenziare il bordo dei pori.
    2. Tracciate manualmente i pori con lo strumento Selezione a mano libera .
    3. Adatta ogni poro come un'ellisse, misura la lunghezza dell'asse maggiore, compila tutte le misurazioni (un totale di 54 nel presente studio - 6 in 3 aree selezionate casualmente per ogni scaffold) e calcola la lunghezza media.

4. Analisi della distribuzione cellulare mediante microscopia confocale a scansione laser

  1. Lavare tre volte gli scaffold con semi cellulari coltivati nel terreno di non differenziazione o differenziazione con PBS. Fissare gli scaffold con paraformaldeide al 4% per 10 min.
  2. Lavare accuratamente ogni scaffold con acqua deionizzata, permeabilizzare le cellule con una soluzione Triton-X 100 per 5 minuti e lavare nuovamente con PBS.
  3. Incubare gli scaffold in 1 mL di acido periodico all'1% per 40 min e risciacquare con acqua deionizzata 14,16.
  4. Incubare gli scaffold in 1 mL di una soluzione contenente 100 mM di metabisolfito di sodio e 0,15 M di acido cloridrico, integrata con 100 μg/mL di ioduro di propidio. Immergere completamente gli scaffold nella soluzione.
  5. Lavare gli scaffold con PBS e colorare i nuclei cellulari incubando gli scaffold in una soluzione DAPI da 5 mg/mL per 10 minuti al buio. Lavare di nuovo accuratamente e conservare le impalcature in PBS prima dell'imaging.
  6. Immagine di tre superfici selezionate in modo casuale di tre diversi scaffold seminati di cellule con un CLSM risonante ad alta velocità con ingrandimento 10x, utilizzando i canali DAPI e TRITC, come segue:
    1. Configurazione del filtro di emissione laser:
      DAPI: Laser: 405 nm; Emissione: 425-475 nm
      TRITC: Laser: 561 nm; Emissione: 570-620 nm
    2. Regolare manualmente la potenza del laser e il rilevatore per garantire un'acquisizione ottimale dell'immagine. Acquisisci uno z-stack di 20 immagini con una dimensione del passo di 5 μm.
  7. Utilizzare il software ImageJ per elaborare le immagini confocali e creare una proiezione massima sull'asse z per l'analisi dell'immagine utilizzando la funzione Z-Project to Maximum Intensity (Proietta Z alla massima intensità ).

5. Analisi della fosfatasi alcalina

  1. Lavare tre volte gli scaffold con semi cellulari coltivati nel terreno di non differenziazione o differenziazione con PBS. Fissare gli scaffold con formalina tamponata neutra al 10% per 30 min. Fissare gli scaffold vuoti (scaffold senza cellule seminate) che fungano da controllo negativo.
  2. Preparare una soluzione colorante a base di 5-bromo-4-cloro-3'-indolificato e tetrazolio nitro-blu (BCIP/NBT) sciogliendo una compressa di BCIP/NBT in 10 mL di acqua deionizzata.
  3. Lavare gli scaffold fissi con una soluzione di Tween allo 0,05% e colorarli con la soluzione BCIP/NBT per 20 minuti a RT. Lavare gli scaffold colorati con una soluzione di Tween allo 0,05% e conservarli in PBS prima dell'imaging.
  4. Fotografa le impalcature macchiate con una fotocamera digitale da 12 megapixel.

6. Analisi della deposizione di calcio

  1. Lavare tre volte gli scaffold con semi cellulari coltivati nel terreno di non differenziazione o differenziazione con PBS. Fissare gli scaffold con formalina tamponata neutra al 10% per 30 min. Fissare gli scaffold vuoti (scaffold senza cellule seminate) che fungano da controllo negativo.
  2. Preparare una soluzione colorante al 2% (p/v) di rosso alizarina S (ARS).
  3. Lavare gli scaffold fissi con acqua deionizzata e colorarli con la soluzione ARS per 1 ora a RT. Lavare gli scaffold colorati con acqua deionizzata e conservarli in PBS prima dell'imaging.
  4. Fotografa le impalcature macchiate con una fotocamera digitale da 12 megapixel.

7. Analisi della mineralizzazione

  1. Lavare tre volte gli scaffold con semi cellulari coltivati nel terreno di non differenziazione o differenziazione con PBS. Fissare gli scaffold con paraformaldeide al 4% per 48 h. Fissare gli scaffold vuoti (scaffold senza cellule seminate) che fungano da controllo negativo.
  2. Disidratare i campioni in soluzioni contenenti concentrazioni di etanolo crescenti dal 50% al 100%, come descritto in precedenza23.
  3. Eseguire la microscopia elettronica a scansione (SEM) e la spettroscopia a dispersione di energia (EDS) per analizzare gli aggregati minerali come segue:
    1. Essiccare i campioni utilizzando un essiccatore per punti critici, seguendo il protocollo del produttore24.
    2. Applicare uno strato d'oro a 5 nm sulle impalcature utilizzando un rivestimento per polverizzazione d'oro, seguendo il protocollodel produttore 25.
    3. Fotografare la superficie degli scaffold con un microscopio elettronico a scansione impostato a 3 kV, con un ingrandimento di 85x.
    4. Eseguire l'EDS impostando il microscopio elettronico a scansione a 15 kV. Su tre aree selezionate in modo casuale per scaffold, acquisire spettri EDS per l'analisi della composizione degli aggregati minerali.

8. Misure del modulo di Young

  1. Rimuovere gli scaffold con semi cellulari dal rispettivo mezzo di incubazione e testare immediatamente i campioni.
  2. Utilizzando un apparato di compressione uniassiale costruito su misura dotato di una cella di carico da 1,5 N, comprimere le impalcature (n = 3 per condizione) a una velocità costante di 3 mm·min-1 a una deformazione di compressione massima del 10% dell'altezza dell'impalcatura.
  3. Determinare il modulo di Young dalla pendenza della porzione lineare delle curve sforzo-deformazione. Nel presente studio, il modulo è stato determinato tra il 9% e il 10% di deformazione.

9. Analisi dell'infiltrazione cellulare e della mineralizzazione mediante istologia: scaffold in vitro

  1. Lavare tre volte gli scaffold con semi cellulari coltivati in terreno di non differenziazione o differenziazione con PBS.
  2. Fissare gli scaffold con semi cellulari con paraformaldeide al 4% per 48 ore prima della risospensione in etanolo al 70% per la conservazione.
  3. Istologia:
    NOTA: Nel presente studio, l'intera preparazione istologica (inclusione, sezionamento e colorazione) descritta nei passaggi successivi è stata eseguita dalla Louise Pelletier Istology Core Facility (Università di Ottawa).
    1. Dopo la disidratazione e l'inclusione in paraffina, tagliare i campioni in sezioni seriali spesse 5 μm, a partire da 1 mm all'interno degli scaffold, e montare le sezioni su vetrini da microscopio.
    2. Colorare le sezioni con coloranti di ematossilina ed eosina (H&E) o von Kossa (VK).
    3. Visualizzare le sezioni con un microscopio scanner a vetrini con un ingrandimento di 40x (n = 1 scaffold in mezzo di non differenziazione e n = 2 scaffold in mezzo di differenziazione nel presente studio).
    4. Utilizzando il software ImageJ, è possibile valutare visivamente l'infiltrazione cellulare (colorazione H&E) e la mineralizzazione (colorazione VK).

10. Modello di difetto calvario di ratto

  1. Ottenere la revisione e l'approvazione dei protocolli sperimentali da parte del comitato locale per la cura degli animali.
  2. Preparare scaffold decellularizzati circolari (5 mm di diametro e 1 mm di spessore) seguendo la Sezione 1 sopra descritta e utilizzando un punzone per biopsia da 5 mm.
  3. Eseguire la craniotomia bilaterale seguendo un protocollo stabilito26, come segue:
    1. Anestetizzare i ratti maschi di Sprague-Dawley con isoflurano, prima al 3% fino a quando non sono incoscienti, e poi al 2-3% durante la procedura.
    2. Esporre il periostio e il cranio tagliando la pelle sovrastante con una lama di bisturi. Rimuovere il periostio.
    3. Creare difetti bilaterali in entrambe le ossa parietali su ciascun lato della sutura sagittale utilizzando un trapano dentale dotato di una trefina di 5 mm di diametro sotto irrigazione costante di NaCl allo 0,9%.
    4. Pulisci l'osso circostante con NaCl allo 0,9% per rimuovere eventuali frammenti ossei.
    5. Posizionare gli scaffold circolari decellularizzati nei difetti.
    6. Chiudere la pelle sovrastante con punti di sutura 4-0.
  4. Dai ai ratti un accesso illimitato a cibo e acqua e monitorali quotidianamente.
  5. Dopo 8 settimane dall'impianto, sopprimere i ratti mediante inalazione di CO2 e perforazione toracica come misura secondaria di eutanasia.
  6. Per esporre il cranio e recuperare gli impianti, rimuovere la pelle che copre il cranio utilizzando una lama di bisturi.
  7. Tagliare il cranio in corrispondenza delle ossa frontali e occipitali e sul lato di entrambe le ossa parietali utilizzando un trapano dentale per rimuovere completamente la sezione superiore del cranio.

11. Prova di espulsione

  1. Collegare un dispositivo di compressione uniassiale (con una cella di carico da 445 N) al modulo di acquisizione dati USB.
  2. Collegare il modulo di acquisizione dati a un computer dotato di un'applicazione software di acquisizione dati.
  3. Immediatamente dopo l'estrazione cranica, posizionare ciascun campione (n = 7 impianti di 4 animali nel presente studio) sul portacampioni del dispositivo di compressione uniassiale in modo che il lato dorsale dell'osso sia rivolto verso l'alto.
  4. Abbassare lo stantuffo a 0,5 mm/min fino a toccare leggermente l'impianto estratto.
  5. Iniziare il test abbassando lo stantuffo attraverso l'impianto fino alla completa spinta mentre si applica la compressione a una velocità costante di 0,5 mm/min utilizzando il software di acquisizione dati.
  6. Registrare la forza di picco sulla curva forza/spostamento utilizzando il software di acquisizione dati.

12. Analisi dell'infiltrazione cellulare e della mineralizzazione mediante istologia: scaffold in vivo

  1. Fissare la calvaria estratta e gli impianti in formalina tamponata neutra al 10% per 72 ore prima di risospendere in etanolo al 70% per la conservazione.
  2. Istologia:
    NOTA: Nel presente studio, tutta la preparazione istologica (inclusione, sezionamento e colorazione) descritta nei passaggi successivi è stata eseguita da Accel Labs (Montreal, QC, Canada).
    1. Tagliare i campioni (incorporati nel metacrilato di metile) in sezioni spesse 6 μm a tre diversi livelli (in alto, in basso e verso il centro) e montarli su vetrini da microscopio.
    2. Colorare le sezioni con H&E o tricromico di Masson-Goldner (MGT).
  3. Fotografare le sezioni con un microscopio scanner a vetrini con ingrandimento 40x (4 espianti da 2 animali nel presente studio).
  4. Utilizzando il software ImageJ, è possibile valutare visivamente l'infiltrazione cellulare (colorazione H&E) e la deposizione di collagene (colorazione MGT).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Misurazione delle dimensioni dei pori, distribuzione cellulare e mineralizzazione in vitro (Figura 1 e Figura 2)
La rimozione completa dei componenti cellulari nativi degli scaffold tissutali della mela è stata ottenuta dopo aver trattato gli scaffold con SDS e CaCl2 (Figura 1A). Le impalcature mostravano una struttura altamente porosa, che è stata confermata utilizzando la microscopia confocale. La quantificazione delle immagini ha dimostrato una dimensione media dei pori di 154 μm ± 40 μm. La distribuzione delle dimensioni dei pori variava tra 73 μm e 288 μm. Tuttavia, la maggior parte dei pori variava tra 100 μm e 200 μm (Figura 1C).

Dopo un periodo di coltura di 4 settimane nel terreno di differenziazione, gli scaffold seminati di cellule hanno mostrato diffusi depositi di minerali bianchi (Figura 1A). Gli scaffold contenenti cellule mostravano una colorazione bianca opaca, suggerendo una mineralizzazione, che non è stata osservata negli scaffold vuoti (scaffold senza cellule seminate). Inoltre, l'analisi mediante microscopia a scansione laser confocale ha rivelato una distribuzione cellulare omogenea all'interno degli scaffold (Figura 1B).

Gli scaffold seminati o meno con cellule sono stati colorati con BCIP/NBT e ARS per analizzare rispettivamente l'attività dell'ALP e la mineralizzazione (Figura 1D). La colorazione BCIP/NBT ha rivelato un aumento sostanziale dell'attività ALP (raffigurata da un forte colore viola) all'interno degli scaffold seminati in cellule coltivati in terreno di differenziamento, in contrasto con gli scaffold vuoti o gli scaffold con seme cellulare coltivati in terreno di non differenziazione. Allo stesso modo, gli scaffold a seme cellulare coltivati in terreno di differenziazione hanno mostrato un colore rosso più intenso dopo la colorazione con ARS, indicando una maggiore mineralizzazione rispetto agli scaffold vuoti o agli scaffold a seme cellulare coltivati in terreno di non differenziazione. Negli scaffold vuoti è stata osservata una colorazione di fondo, probabilmente dovuta alla presenza di CaCl2 nel protocollo di decellularizzazione.

La colorazione (H&E e VK) è stata eseguita sugli scaffold per analizzare l'infiltrazione e la mineralizzazione cellulare, mentre SEM ed EDS sono stati utilizzati per valutare ulteriormente la mineralizzazione (Figura 2). La colorazione H&E (Figura 2A) ha mostrato una buona infiltrazione cellulare negli scaffold seminati in colture in terreno di non-differenziazione o di differenziamento. Nuclei multipli erano visibili nella periferia e in tutte le impalcature. La presenza di collagene è stata osservata anche nelle impalcature di colore rosa pallido. Inoltre, la colorazione VK eseguita sugli scaffold dopo 4 settimane di coltura in terreno di differenziazione ha rivelato che le pareti dei pori erano colorate, mentre i depositi di calcio sono stati rilevati solo lungo i bordi esterni delle pareti dei pori negli scaffold coltivati in terreno di non differenziazione e potrebbero essere il risultato dell'assorbimento di calcio durante il trattamento di decellularizzazione. La mineralizzazione localizzata sulla superficie degli scaffold seminati di cellule coltivati in terreno di differenziazione per 4 settimane è stata osservata mediante analisi SEM (Figura 2B). Più specificamente, sono stati osservati depositi minerali simili ad aggregati sferoidi alla periferia dei pori. Al contrario, non sono stati osservati aggregati minerali sugli scaffold vuoti o sugli scaffold con semi cellulari coltivati per 4 settimane in terreno di non-differenziazione. Distinti picchi caratteristici corrispondenti al fosforo (P) e al calcio (Ca) sono stati osservati negli spettri EDS delle regioni di interesse selezionate, in particolare sui depositi minerali osservati sugli scaffold seminati a cellule coltivati per 4 settimane in terreno di differenziazione (Figura 2B).

Analisi biomeccanica in vitro (Figura 3)
Il modulo di Young degli scaffold seminati nelle cellule è stato misurato dopo 4 settimane di coltura in terreno di non-differenziazione o di differenziazione (n = 3 per ogni condizione sperimentale). È stato confrontato con il modulo di Young degli scaffold vuoti (scaffold senza cellule seminate) (Figura 3). Non è stata osservata alcuna differenza significativa nel modulo tra gli scaffold vuoti (31,6 kPa ± 4,8 kPa) e gli scaffold seminati in cellule coltivate in terreno di non-differenziazione (24,1 kPa ± 8,8 kPa; p = 0,88). Al contrario, è stata notata una differenza significativa tra il modulo degli scaffold vuoti (31,6 kPa ± 4,8 kPa) e quello degli scaffold seminati in cellule coltivate in terreno di differenziamento (192,0 kPa ± 16,6 kPa; p < 0,001). Inoltre, è stata osservata una differenza significativa (p < 0,001) tra i moduli di Young degli scaffold seminati in cellule coltivate in terreni di non differenziazione e differenziazione. La Figura 1 supplementare mostra una tipica curva sforzo-deformazione per il calcolo del modulo di Young.

Prestazioni biomeccaniche in vivo e rigenerazione ossea (Figura 4 e Figura 5)
Le craniotomie chirurgiche sono state condotte su un totale di 6 ratti Sprague-Dawley. Difetti bilaterali di 5 mm di diametro sono stati creati in entrambe le ossa parietali del cranio utilizzando una fresa a trefina e scaffold di cellulosa derivati dalla mela senza cellule seminate sono stati impiantati nei difetti calvari (Figura 4A). Dopo 8 settimane dall'impianto, gli animali sono stati soppressi e la parte superiore dei loro crani è stata raccolta e processata per test meccanici o analisi istologiche.

Sulla base della valutazione visiva, le impalcature sembravano ben integrate nei tessuti circostanti il cranio. Sono stati eseguiti test meccanici di push-out per valutare quantitativamente l'integrazione degli scaffold (n = 7) nella calvaria ospite. Le misurazioni sono state condotte utilizzando un dispositivo di compressione uniassiale (Figura 4B) subito dopo l'eutanasia degli animali. I risultati hanno rivelato che la forza di picco era di 113,6 N ± 18,2 N (Tabella 1).

L'analisi istologica è stata condotta per valutare l'infiltrazione cellulare e la deposizione di matrice extracellulare all'interno degli scaffold impiantati (Figura 5). La colorazione H&E ha rivelato un'infiltrazione cellulare all'interno dei pori dell'impalcatura e l'evidenza di vascolarizzazione, come dimostrato dalla presenza di vasi sanguigni all'interno degli scaffold. Inoltre, la colorazione MGT ha dimostrato la presenza di collagene all'interno degli scaffold.

figure-results-1
Figura 1: Immagini dell'impalcatura, distribuzione delle dimensioni dei pori e mineralizzazione in vitro . (A) Fotografie rappresentative di un'impalcatura di cellulosa derivata dalla mela dopo la rimozione delle cellule native e del tensioattivo (a sinistra) e di un'impalcatura seminata con cellule MC3T3-E1 dopo 4 settimane di coltura in terreno di differenziazione osteogenica (a destra). La barra della scala rappresenta 2 mm. (B) Immagini rappresentative al microscopio a scansione laser confocale che mostrano cellule seminate in scaffold di cellulosa derivati da mele dopo 4 settimane di coltura in terreno di non differenziazione ("ND") o terreno di differenziazione osteogenica ("D"). La barra della scala rappresenta 50 μm. La colorazione è stata eseguita sugli scaffold per la cellulosa (rosso) utilizzando ioduro di propidio e per i nuclei cellulari (blu) utilizzando DAPI. (C) Distribuzione delle dimensioni dei pori di scaffold di cellulosa derivati da mele decellularizzate, prima di essere seminati con cellule MC3T3-E1, dalle proiezioni massime nell'asse z delle immagini confocali. L'analisi è stata eseguita su un totale di 54 pori in 3 diversi scaffold (6 pori in 3 regioni di interesse selezionate in modo casuale per scaffold). (D) Immagini rappresentative di scaffold colorati con 5-bromo-4-cloro-3'-indolifosfato e tetrazolio nitro-blu (BCIP/NBT) per valutare l'attività della fosfatasi alcalina (ALP) e con rosso di alizarina S (ARS) per visualizzare la deposizione di calcio, indicando la mineralizzazione (barra graduata = 2 mm - si applica a tutti). Gli scaffold etichettati come "blank" (scaffold senza cellule seminate) non hanno mostrato alcuna colorazione con BCIP/NBT, indicando l'assenza di attività ALP. D'altra parte, gli scaffold seminati in cellule coltivati in terreno di differenziazione ("D") hanno mostrato una maggiore attività ALP, indicata da un colore blu più intenso, rispetto agli scaffold seminati in cellule coltivate in terreno di non differenziazione ("ND"). Per la colorazione ARS, sia gli scaffold vuoti che gli scaffold coltivati in terreno di non differenziazione ("ND") hanno mostrato una tonalità di rosso più chiara rispetto agli scaffold coltivati in mezzo di differenziazione ("D"). La presenza di deposizione di calcio negli scaffold coltivati in terreno di differenziamento ("D") è stata illustrata da un colore rosso intenso e intenso. Ogni analisi è stata eseguita su tre diversi scaffold (n = 3). Questa figura è stata adattata con il permesso di Leblanc Latour (2023)27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Analisi istologica, microscopia elettronica a scansione (SEM) e spettroscopia a dispersione di energia (EDS) di scaffold in vitro . (A) Immagini rappresentative delle sezioni istologiche superiori degli scaffold. Gli scaffold incorporati in paraffina sono stati tagliati in sezioni spesse 5 μm che sono state colorate con ematossilina ed eosina (H&E) per visualizzare l'infiltrazione cellulare, o con von Kossa (VK) per visualizzare la mineralizzazione all'interno degli scaffold. Gli scaffold sono stati infiltrati con cellule MC3T3-E1, come mostrato dalla colorazione blu (nuclei) e rosa (citoplasma) visibile alla periferia e in tutta l'impalcatura. Anche il collagene (rosa pallido) era visibile (inserto ingrandito di "H&E - D"). La mineralizzazione è stata osservata solo alla periferia delle pareti dei pori negli scaffold coltivati in terreno di non-differenziazione ("ND"). Le pareti dei pori negli scaffold coltivati in mezzo di differenziazione ("D") sono state interamente colorate di nero. L'analisi è stata eseguita su uno scaffold coltivato in terreno di non differenziazione ("ND") e su due scaffold coltivati in mezzo di differenziazione ("D") (barra della scala per le immagini a basso ingrandimento = 1 mm, barra della scala per le immagini a maggiore ingrandimento = 50 μm). (B) Micrografie rappresentative ottenute mediante spettri SEM e EDS. Le impalcature sono state sottoposte a sputtering coating con oro e sono state riprese utilizzando un microscopio elettronico a scansione a emissione di campo a una tensione di 3,0 kV (barra della scala = 100 μm - si applica a tutti). Gli spettri EDS sono stati acquisiti su ciascuna impalcatura. I picchi di fosforo (2,013 keV) e calcio (3,69 keV) sono indicati su ogni spettro EDS. Sia il SEM che l'EDS sono stati eseguiti su tre diversi scaffold. Blank: scaffold senza cellule seminate. Questa figura è stata adattata con il permesso di Leblanc Latour (2023)27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Moduli di Young degli scaffold in vitro dopo 4 settimane di coltura in terreno di non differenziazione ("ND") o in terreno di differenziazione ("D"). I dati sono presentati come media ± errore standard della media (SEM) di tre campioni replicati per ciascuna condizione. La significatività statistica (* indica p<0,05) è stata determinata utilizzando un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) e il test post-hoc di Tukey. Blank: scaffold senza cellule seminate. Questa figura è stata adattata con il permesso di Leblanc Latour (2023)27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Fotografia dell'impalcatura prima dell'impianto e test di espulsione dopo 8 settimane dall'impianto: (A) Fotografia rappresentativa di un'impalcatura prima dell'impianto; (B) Dispositivo di compressione uniassiale utilizzato per le prove di push-out, con la cella di carico indicata da un asterisco (*) e il campione indicato da una freccia. Questa figura è stata adattata con il permesso di Leblanc Latour (2023)27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Analisi istologica di scaffold in vitro . Immagini rappresentative di sezioni trasversali istologiche da scaffold non seminati dopo 8 settimane dall'impianto. Le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina (H & E) per visualizzare le cellule o tricromica di Masson-Goldner (MGT) per visualizzare il collagene. La freccia indica i globuli rossi. La presenza di collagene è visibile (barra graduata = 1 mm e 200 μm rispettivamente per gli inserti sinistro e destro). Questa figura è stata adattata con il permesso di Leblanc Latour (2023)27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Numero del campioneForza di picco (N)
192.8
2162.7
3140.3
4135.7
537.7
6157.8
767.9
Significare113.6
SEM18.2

Tabella 1: Forza di picco misurata dai test di push-out.

Figura supplementare 1: Curva sforzo-deformazione tipica per il calcolo del modulo di Young. Fare clic qui per scaricare il file.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diversi studi in vitro e in vivo hanno dimostrato la biocompatibilità della cellulosa di origine vegetale e il suo potenziale utilizzo nell'ingegneria tissutale 14,15,16,18,19,20, più specificamente per ospitare la differenziazione osteogenica20,21. Gli obiettivi del presente studio sono stati quelli di indagare ulteriormente il potenziale degli scaffold di cellulosa derivati dalla mela per la BTE e di valutare le proprietà meccaniche di questi scaffold sia in vitro che in vivo.

Per gli studi in vitro, le cellule preosteoblastiche (MC3T3-E1) sono state seminate negli scaffold dopo aver eliminato le cellule native dal tessuto della mela. Le cellule MC3T3-E1 sono comunemente usate per studiare la biomineralizzazione della matrice extracellulare 28,29,30. Gli scaffold sono stati poi coltivati per 4 settimane in terreno di differenziazione osteogenica o non differenziante. I risultati hanno indicato che le cellule proliferavano e subivano differenziazione all'interno degli scaffold, specialmente se coltivate in terreno di differenziazione, evidenziando così il potenziale degli scaffold di cellulosa derivati dalle mele per supportare lo sviluppo del tessuto osseo. I nuclei cellulari sono stati osservati in gran numero nei pori dell'impalcatura, confermando le osservazioni riportate in studi precedenti 14,15,16,17,20,21. Inoltre, analogamente ai nostri precedenti risultati14 e a quelli di un altro gruppo21, il diametro medio dei pori dell'impalcatura era di ~154 μm, con la maggior parte dei pori con diametri compresi tra 100 μm e 200 μm (Figura 1C). Queste dimensioni sono in accordo con l'intervallo ideale delle dimensioni dei pori (100-200 μm) noto per facilitare la crescita ossea7.

L'analisi di colorazione ha mostrato una maggiore attività dell'ALP dopo un periodo di coltura di 4 settimane nel terreno di differenziazione. Sono stati osservati più depositi di calcio sulla superficie degli scaffold seminati in cellule coltivati in terreno di differenziazione rispetto sia agli scaffold vuoti che agli scaffold seminati in cellula coltivati in terreno di non differenziazione. Risultati simili sono stati osservati con hiPSC differenziate in scaffold derivati da mele21. Mentre la presenza di ALP è stata valutata qualitativamente nel presente studio, è stato possibile eseguire ulteriori saggi per un'analisi quantitativa. La valutazione istologica degli scaffold ha inoltre confermato che gli osteoblasti infiltrati hanno mineralizzato gli scaffold dopo la differenziazione. In particolare, anche la periferia dei costrutti coltivati in mezzo di non-differenziazione è stata colorata con VK. Il CaCl2 residuo negli scaffold potrebbe aver causato questa colorazione aspecifica osservata nella periferia dopo la decellularizzazione. È stata eseguita un'analisi qualitativa delle immagini SEM per valutare ulteriormente la mineralizzazione. Dopo la coltura in terreno di differenziamento, gli scaffold seminati di cellule hanno mostrato segni di mineralizzazione dell'ECM. Gli aggregati minerali erano visibili sulla superficie dell'impalcatura, in particolare ai bordi dei pori. Queste osservazioni sono coerenti con studi precedenti che utilizzavano ECM30 e scaffold di origine vegetale21. Questi aggregati erano assenti sulla superficie degli scaffold senza cellule seminate. L'analisi EDS degli aggregati ha rivelato la presenza di alti livelli di P e Ca, suggerendo così la presenza di apatite. Da notare che mentre il protocollo descritto nel presente studio consente di visualizzare l'infiltrazione cellulare e la presenza di mineralizzazione, non consente di valutare la loro progressione nel tempo. L'analisi istologica in più punti temporali sarebbe necessaria per valutare appieno questa progressione. Inoltre, sarebbero necessarie ulteriori analisi per quantificare l'infiltrazione cellulare e la mineralizzazione sulla superficie e in tutta l'impalcatura. Infine, mentre la composizione elementare dei depositi minerali è stata determinata mediante EDS, altre tecniche di caratterizzazione, come la diffrazione a raggi X (XRD), possono essere necessarie per fornire informazioni sulla struttura cristallina dei depositi osservati.

Il modulo di Young degli scaffold era significativamente più alto dopo la coltura nel terreno di differenziazione (di circa 8 volte). Al contrario, il modulo degli scaffold coltivati in terreno di non-differenziazione assomigliava a quello degli scaffold vuoti (scaffold senza cellule seminate), simile ai risultati riportati in uno studio precedente con scaffold derivati da mele20. Nonostante il modulo di Young più elevato degli scaffold coltivati in mezzo di differenziazione, è rimasto molto inferiore a quello dell'osso naturale (da 0,1 a 2 GPa per l'osso trabecolare e da 15 a 20 GPa per l'osso corticale)8, dell'allotrapianto spongioso (3,78 GPa)31, degli innesti alloplastici in poli-etere-etere-chetone (3,84 GPa)31, del titanio (50,20 GPa)31 e della lega di cobalto-cromo (53,15 GPa)31 Impianti. Pertanto, gli scaffold nella loro formulazione attuale potrebbero non essere adatti per applicazioni portanti. Da notare che il modulo di Young fornisce informazioni sulla rigidità di un materiale. Tuttavia, la resistenza allo snervamento potrebbe anche essere presa in considerazione per fornire una comprensione più ampia delle proprietà meccaniche dell'impalcatura.

Scaffold di mele decellularizzate sono stati quindi impiantati in difetti calvari bilaterali di dimensioni critiche di 5 mm nei ratti (n = 6 animali). I test push-out (su 7 espianti), eseguiti per valutare l'integrazione degli scaffold all'interno della calvaria ospite, hanno indicato che la forza di picco media era di 113,6 N ± 18,2 N, che è simile al carico di frattura precedentemente riportato per l'osso calvario (127,1 ± 9,6 N)22, suggerendo che gli scaffold si integravano bene nel tessuto osseo circostante. Va tuttavia notato che il test push-out fornisce solo informazioni sull'interfaccia tra lo scaffold e il tessuto circostante. Studi precedenti hanno combinato test push-out con test di indentazione per fornire una comprensione più ampia delle proprietà meccaniche dell'interfaccia osso-impianto e dello scaffold stesso22. Inoltre, i difetti bilaterali sono più inclini al disallineamento con lo stantuffo32. Il corretto posizionamento dell'espianto cranico, del modello a difetto singolo o del sistema di bloccaggio aggiuntivo sul dispositivo di prova universale potrebbe potenzialmente evitare il disallineamento32.

In sintesi, questo studio ha confermato che gli scaffold di cellulosa derivati dalla mela potrebbero promuovere l'adesione e la proliferazione dei preosteoblasti. Inoltre, la mineralizzazione si è verificata all'interno degli scaffold seminati a cellule coltivate in terreno di differenziamento, portando ad un aumento del modulo di Young dello scaffold. Tuttavia, il modulo è rimasto significativamente inferiore a quello dell'osso naturale. È interessante notare che la forza necessaria per spostare gli scaffold di cellulosa derivati dalla mela impiantati era paragonabile al carico di frattura dell'osso calvario e di altri tipi di scaffold precedentemente utilizzati per BTE22. Infine, analogamente ai risultati illustrati nei rapporti precedenti, le cellule si sono infiltrate negli scaffold impiantati e hanno depositato collagene. Nel complesso, questo studio dimostra il potenziale degli scaffold di cellulosa derivati da piante per applicazioni BTE. Questi risultati sono in accordo con uno studio precedente condotto da un altro gruppo di ricerca, che ha ulteriormente confermato l'idoneità degli scaffold di cellulosa di origine vegetale per scopi BTE21. Tuttavia, la disparità nella rigidità degli scaffold rispetto all'osso trabecolare o corticale evidenzia l'importanza di sviluppare biomateriali compositi in grado di corrispondere più da vicino alle proprietà meccaniche dell'osso naturale. Pertanto, nonostante il crescente interesse per l'utilizzo di scaffold di origine vegetale per scopi BTE, il loro uso può rimanere limitato ad applicazioni non portanti. Come abbiamo dimostrato in precedenza16, la reingegnerizzazione di scaffold di cellulosa di origine vegetale tramite modifica chimica o lo sviluppo di compositi con altri polimeri biologici/sintetici può essere essenziale per le applicazioni portanti.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dichiarazione di conflitto di interessi: M.L.L., M.T. R.J.H., C.M.C., I.C. e A.P. sono inventori di domande di brevetto depositate dall'Università di Ottawa e da Spiderwort Inc. relative all'uso di cellulosa di origine vegetale per applicazioni BTE. M.L.L., R.J.H., C.M.C. e A.P. hanno interessi finanziari in Spiderwort Inc.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il finanziamento per questo progetto è stato fornito dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (Discovery Grant) e dalla Li Ka Shing Foundation. M.L.L. ha ricevuto il supporto del programma TalentEdge dei Centri di eccellenza dell'Ontario e R.J.H. è stato supportato da una borsa di studio post-laurea NSERC e da una borsa di studio per laureati dell'Ontario (OGS).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4′,6-diamidino-2-fenilindoloThermoFisherD1306DAPI
Alizarina rosso SSigma-AldrichA5533ARS
Acido ascorbicoSigma-AldrichA4403Coltura cellulare
Cloruro di calcioThermoFisherAA12316CaCl2
Calcofluor BiancoSigma-Aldrich18909
TrapanoStrumento chirurgico
EtanoloThermoFisher615095000
Siero fetale bovinoHyclone LaboratoriesSH30396FBS
FormalinaSigma-AldrichHT50112810% Formalina
Colorante tricromo di GoldnerSigma-Aldrich1.00485GTC
Ematossilina e colorante di eosinaFisher ScientificNC1470670H& E
Microscopio a scansione laser confocale risonante ad alta velocitàNikonNikon Ti-E A1-R
Acido cloridricoSigma-Aldrich258148
ImageJ softwareNational Institutes of Health
Soluzione salina per irrigazioneBaxterJF71230,9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 celluleATCCCRL-2593Cellule pre-osteoblasti
MeleCanada
Metacrilato di metileSigma-AldrichM55909Inclusione istologica
Terreno essenziale minimoThermoFisherM0894α-MEM
ParaformaldeideFisher ScientificO40424%; PFA
Penicillina/StreptomicinaHyclone LaboratoriesSV30010Cell Culture
Periodic acidSigma-Aldrich375810
Soluzione salina tamponata con fosfatoHyclone Laboratories2810305PBS; senza Ca2+ e Mg2+
Propidium iodureInvitrogenp3566
Scansione microscopio elettronicoJEOLJSM-7500F FESEMSEM e EDS
Microscopio scanner per vetriniZeissAXIOVERT 40 CFL
Sodio dodecil solfatoFisher ScientificBP166SDS
Metabisolfito di sodioSigma-Aldrich31448
Fosfato di sodioThermoFisherBP329
Ratti Sprague-DawleyCharles-River Laboratories400Suture maschili
EthiconJ494G4-0
TrephineACE Surgical Supply Co583-0182Diametro 5 mm
Triton-X 100ThermoFisher807423
TripsinaHyclone LaboratoriesSH30236.02Coltura cellulare
TweenFisher ScientificBP337
Dispositivo di compressione universaleCellScaleUniVert
Von Kossa coloranteSigma-Aldrich1.00362Istologia
odontoiatrico McIntosh di grado fantasia

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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