Un flusso di lavoro per determinare quantitativamente le variazioni specifiche della lesione della degenerazione maculare legata all'età nell'autofluorescenza del fondo oculare

Sommario

Questa ricerca descrive un flusso di lavoro per determinare e confrontare i livelli di autofluorescenza da singole regioni di interesse (ad esempio, drusen e depositi di drusenoidi sottoretinici nella degenerazione maculare legata all'età [AMD]) tenendo conto dei diversi livelli di autofluorescenza in tutto il fondo oculare.

Abstract

L'imaging con autofluorescenza del fondo oculare (FAF) consente la mappatura non invasiva dei fluorofori intrinseci del fondo oculare, in particolare dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), ora quantificabile con l'avvento dell'autofluorescenza quantitativa (QAF) basata sull'oftalmoscopia laser a scansione confocale. È stato dimostrato che la QAF è generalmente ridotta al polo posteriore nella degenerazione maculare legata all'età (AMD). La relazione tra QAF e varie lesioni AMD (drusen, depositi di drusenoidi sottoretinici) non è ancora chiara.

Questo documento descrive un flusso di lavoro per determinare la QAF specifica per la lesione nell'AMD. Viene utilizzato un approccio di imaging multimodale in vivo , tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la tomografia a coerenza ottica nel dominio spettrale (SD-OCT), la scansione del volume maculare e la QAF. Utilizzando plug-in FIJI personalizzati, l'immagine QAF corrispondente viene allineata con l'immagine nel vicino infrarosso della scansione SD-OCT (punti di riferimento caratteristici, ad esempio biforcazioni dell'imbarcazione). La foveola e il bordo della testa del nervo ottico vengono contrassegnati nelle immagini OCT (e trasferiti all'immagine QAF registrata) per un posizionamento accurato delle griglie di analisi.

Le lesioni specifiche per AMD possono quindi essere marcate sui singoli OCT BScan o sull'immagine QAF stessa. Le mappe QAF normative sono create per tenere conto della media variabile e della deviazione standard dei valori QAF in tutto il fondo oculare (le immagini QAF di un gruppo rappresentativo di AMD sono state mediate per costruire mappe QAF AMD retiniche standard normative). I plug-in registrano le coordinate X e Y, z-score (una misura numerica che descrive il valore QAF in relazione alla media delle mappe AF in termini di deviazione standard dalla media), il valore medio dell'intensità, la deviazione standard e il numero di pixel contrassegnati. Gli strumenti determinano anche i punteggi z dalla zona di confine delle lesioni marcate. Questo flusso di lavoro e gli strumenti di analisi miglioreranno la comprensione della fisiopatologia e dell'interpretazione delle immagini cliniche della FA nell'AMD.

Introduzione

L'imaging con autofluorescenza del fondo oculare (FAF) fornisce una mappatura non invasiva dei fluorofori del fondo oculare presenti in modo naturale e patologico¹. L'autofluorescenza (AF) blu più comune (eccitazione a 488 nm) eccita i granuli di lipofuscina e melanolipofuscina dell'epitelio pigmentato retinico (RPE)^2,3,4. La distribuzione e l'aumento/diminuzione dei granuli svolgono un ruolo centrale nel normale invecchiamento e in varie malattie della retina, tra cui la degenerazione maculare legata all'età (AMD)⁵.

Un ulteriore sviluppo della FAF, l'autofluorescenza quantitativa del fondo oculare (QAF), consente ora la determinazione accurata delle intensità di fibrillazione atriale retinica topograficamente risolte ^4,6. Incorporando un riferimento nel percorso ottico del dispositivo di imaging FAF, è possibile confrontare le intensità AF tra dispositivi, punti temporali e soggetti. Questa tecnica ha comportato un cambio di paradigma per quanto riguarda un presunto fattore patogenetico nell'AMD, che per molto tempo si è ipotizzato fosse dovuto all'eccessivo accumulo di lipofuscina nelle cellule RPE⁷. La quantificazione istologica e clinica della fibrillazione atriale, tuttavia, ha rivelato una diminuzione della fibrillazione atriale nella DMLE (a causa della ridistribuzione e della perdita di lipofuscina autofluorescente e dei granuli di melanolipofuscina), invece dell'aumento proposto della fibrillazione atriale ^8,9,10.

Il monitoraggio della fibrillazione atriale ha implicazioni cliniche. Von der Emde et al. e altri hanno dimostrato che la fibrillazione atriale non solo diminuisce, ma diminuisce ulteriormente nel corso dell'AMD negli occhi ad alto rischio e intermedi^{di AMD 8,9}. Inoltre, gli studi istologici suggeriscono che la maggior parte delle cellule RPE affette da AMD mostrano un comportamento caratteristico con l'aggregazione e l'estrusione dei granuli prima della perdita delle cellule RPE attraverso la subduzione, lo sloughing, la migrazione o l'atrofia^13,14,15,16. Ciò indica inoltre che la perdita di fibrillazione atriale potrebbe essere un fattore scatenante o un segnale surrogato dell'imminente progressione della malattia.

Finora gli studi QAF hanno valutato l'AF solo globalmente al polo posteriore utilizzando sistemi di coordinate polari a griglia prefabbricata (ad esempio, QAF8/Delori Grid)¹⁷. L'utilizzo di griglie prefabbricate per misurare l'AF produce più valori AF su aree predeterminate per occhio di un soggetto. L'analisi dei valori di FA in questo modo potrebbe non rilevare i cambiamenti locali nelle aree con FA patologicamente alterata, ad esempio, nell'AMD in cima o vicino alle drusen o ai depositi di drusenoidi sottoretinici (SDD). I Drusen e, in misura maggiore, gli SDD sono associati a un alto rischio di sviluppare AMD tardiva e perdita della vista. I drusi, in particolare, hanno un tipico ciclo di aumento delle dimensioni nel corso di molti anni e possono deteriorarsi rapidamente prima dell'atrofia. È ipotizzabile che, ad esempio, la fibrillazione atriale globale diminuisca nell'AMD, ma aumenti o si riduca ulteriormente all'interno e intorno a queste specifiche lesioni focali correlate alla malattia.

Diversi pattern locali di FA potrebbero anche avere rilevanza prognostica per la progressione della malattia. Ad esempio, i livelli di autofluorescenza potrebbero essere utilizzati per valutare se le drusen stanno aumentando di dimensioni o sono già in regressione all'atrofia. È già stato dimostrato che i pattern perilesionali alterati della FA nell'atrofia geografica hanno un impatto significativo sulla progressione dell'atrofia nel tempo¹⁸. Inoltre, i modelli di autofluorescenza locale potrebbero rivelare ulteriori dettagli sullo stato di salute dell'RPE. Spesso, la tomografia a coerenza ottica (OCT) mostra iperriflettanza nella coriocapillare, sebbene lo strato RPE appaia intatto. Un approccio multimodale che combina i valori locali di QAF e l'OCT potrebbe aiutare a differenziare le lesioni con un alto rischio di interruzione dell'RPE e atrofia imminente.

Uno dei motivi per cui non sono state eseguite analisi spazialmente risolte negli studi è perché il software del produttore più comunemente utilizzato non fornisce uno strumento per questo tipo di analisi. Le proprietà della FA di diverse lesioni dipendenti dallo stadio della malattia AMD potrebbero spiegare ulteriormente la patogenesi dell'AMD. Pertanto, sarebbe auspicabile uno strumento per misurare la fibrillazione atriale regionale specifica per lesione. Per confrontare con precisione le lesioni che si trovano in tutta la retina, il flusso di lavoro ha bisogno di un modo per tenere conto dei vari gradi di fibrillazione atriale nel fondo oculare umano¹⁹. Più centralmente, la fibrillazione atriale è tipicamente più bassa a causa degli effetti di ombreggiatura del pigmento maculare e del diverso numero di granuli^20,21.

La fibrillazione atriale raggiunge il suo picco a ~9° (distanza dalla fovea in tutte le direzioni) e diminuisce in misura maggiore perifericamente⁴. Pertanto, se si confrontassero i valori assoluti dei livelli di AF delle drusen morbide (situate in corrispondenza della fovea e della parafovea nelle aree a bassa AF) e delle SDD (situate paracentralmente nelle aree ad alta AF), i risultati non sarebbero comparabili²². Ispirato dal lavoro di Pfau et al. e dal concetto di perdita di sensibilità (correzione della sensibilità misurata in AMD per la collina della visione [diminuzione della sensibilità retinica con la distanza dalla fovea] di controlli sani) per la perimetria controllata dal fondo oculare, la fibrillazione atriale viene confrontata con i valori standardizzati di fibrillazione atriale in tutta la macula^23,24. I risultati sono riportati come z-score (misurazione numerica della relazione tra una regione del valore di interesse e la media).

Lo scopo di questo studio è quello di valutare l'uso di un nuovo strumento per misurare i livelli locali di QAF in diversi tipi di lesioni in pazienti con AMD. Questo strumento è progettato per misurare i livelli di autofluorescenza delle lesioni identificate nelle scansioni OCT. Ciò consente la valutazione dei livelli di autofluorescenza locale nelle lesioni, come le drusen morbide o le SDD, e consente di monitorare i cambiamenti della fibrillazione atriale dalle lesioni nel tempo. La potenziale utilità di questo strumento è quella di abilitare un nuovo biomarcatore strutturale che stima lo stato di salute dell'RPE e può avere un valore prognostico per le lesioni indagate.

Protocollo

Lo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico dell'Università di Bonn (codice protocollo 305/21). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i soggetti coinvolti nello studio. Abbiamo richiesto a tutti i partecipanti al video di firmare moduli di liberatoria che ci concedessero il permesso di utilizzare la loro immagine e le loro informazioni personali nella creazione di un video online.

1. Acquisizione di immagini in autofluorescenza quantitativa (QAF)

1. Per un'acquisizione accurata delle immagini con il dispositivo QAF, assicurarsi che il partecipante sia comodamente seduto di fronte al dispositivo. Chiedere al partecipante di premere il mento e la fronte contro il mento e il poggiatesta. Regolare l'altezza della mentoniera fino a quando l'angolo della palpebra laterale non è alla stessa altezza del contrassegno rosso.
2. Assicurarsi che l'immagine sia messa a fuoco nel vicino infrarosso ruotando la rotella sul dispositivo di registrazione fino a quando i piccoli recipienti non sono a fuoco. Ingrandisci l'occhio spostando la fotocamera in avanti fino a quando gli angoli dell'immagine non sono illuminati in modo uniforme. Come regola generale, regolare la messa a fuoco sull'equivalente sferico. Ridurre la messa a fuoco prima dell'imaging QAF di una o due diottrie, poiché il QAF blu utilizza una lunghezza d'onda più corta e cambiare il modus del dispositivo QAF dal vicino infrarosso alla modalità QAF.
3. Regolare e aumentare l'illuminazione e regolare la messa a fuoco dell'immagine fino a quando i piccoli vasi più vicini alla fovea sono a fuoco e l'immagine è illuminata in modo brillante senza punti rossi (che indicano una sovrailluminazione). Sbiancare il fotopigmento attendendo almeno 30 secondi in modalità QAF prima dell'acquisizione dell'immagine per consentire l'eccitazione continua della luce blu per sbiancare il pigmento del fotorecettore nel campo visivo delle impostazioni della fotocamera.
4. Per acquisire le immagini, premere l'acquisizione delle immagini sul touchpad del dispositivo di imaging; assicurarsi di acquisire più di un'immagine QAF in caso di battito delle palpebre o movimenti oculari improvvisi durante l'acquisizione.
   NOTA: Il flusso di lavoro richiede anche immagini di tomografia a coerenza ottica nel dominio spettrale (SD-OCT). L'acquisizione di immagini OCT è spiegata altrove, in quanto è ampiamente utilizzata nella pratica clinica²⁵.

2. Esportazione dell'immagine

1. Per questa pipeline di analisi, assicurarsi che le immagini QAF e Strumento di personalizzazione di Office siano nel formato di file XML (Extensible Markup Language). Nel visualizzatore HEYEX, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine QAF/OCT desiderata e selezionare Esporta | come XML dal menu a discesa.

3. Plug-in open source per l'analisi QAF: installazione della pipeline

NOTA: Il software QAF presentato è un plug-in open source denominato "Spectralis pipeline" creato per il software open source ImageJ (espansione FIJI)²⁶.

1. Per accedere al plug-in, apri FIJI, seleziona Guida, quindi Aggiorna dal menu a discesa, quindi fai clic su Gestisci siti di aggiornamento per aggiungere il sito di aggiornamento di Creative Computation "https://sites.imagej.net/CreativeComputation/" ai siti di aggiornamento preesistenti.
2. Scaricare i plug-in e riavviare FIJI. A questo punto, la pipeline Spectralis è installata. I diversi plug-in Spectralis si trovano nel menu a discesa Plugin | Spectralis o Plugin | SpectralisBatch.

4. Configurazione - archiviazione dei dati

NOTA: per consentire un flusso di lavoro senza interruzioni, si consiglia di impostare la struttura delle cartelle come segue. Innanzitutto, imposta una cartella per ogni soggetto di studio. Oculus dexter (OD) e oculus sinister (OS) si riferiscono rispettivamente all'occhio destro e sinistro e queste abbreviazioni vengono utilizzate in questo flusso di lavoro.

1. Per ogni occhio esaminato di ciascun soggetto dello studio, impostare una cartella per un OCT, denominata rispettivamente OD_OCT e OS_OCT. Lascia che la pipeline Spectralis memorizzi automaticamente l'output del plug-in "Mark_BScans_OCT" come valori separati da tabulazioni in queste cartelle.
2. Per le immagini QAF, creare due cartelle denominate OD_QAF e OS_QAF.
3. Creare cartelle aggiuntive se vengono utilizzate altre modalità di imaging multimodale. Assicurarsi che la struttura di cartelle risultante sia simile a quella elencata di seguito:
   CASE_ID
   OD_OCT
   OD_QAF
   OD_other_imaging_modality
   OS_OCT
   OS_QAF
   OS_other_imaging_modality

5. Conversione del file XML QAF in un'immagine QAF (plug-in utilizzato: QAF_xml_reader)

1. I file di esportazione XML QAF di Spectralis sono memorizzati in formato RGB (rosso-verde-blu), limitato a una scala da 0 a 255 (che rappresenta i valori AF misurati) e che include le regioni di calibrazione "standard" e "nero". Il plug-in "QAF_xml_reader" produce un'immagine QAF. Per questo, apri il menu a discesa dei plug-in , seleziona Spectralis | QAF_XML_Reader e scartare la schermata di apertura.
2. Viene visualizzata una nuova finestra che mostra il prompt Scegli una directory contenente un'esportazione QAF XML Spectralis:. Selezionare la directory e fare clic su Seleziona.
3. Immettere il fattore di calibrazione di riferimento (RCF) del dispositivo QAF (incluso nelle informazioni sull'immagine QAF) e l'età del paziente al momento dell'acquisizione dell'immagine.
4. La finestra successiva si chiama Parametri QAF. Se il paziente è pseudofachico al momento dell'acquisizione dell'immagine, selezionare invece l'età di 20 anni (questo ha l'effetto di non applicare alcuna correzione dell'età). Dopo aver fatto clic su OK, quando viene visualizzato un popup con l'etichetta Mappa a 8 bit, immettere il valore QAF minimo (qafMin) e il valore QAF massimo (qafMax) per un'immagine QAF codificata a colori. Nel caso in cui qafMin e qafMax siano sconosciuti, utilizzare le impostazioni predefinite, fare clic su OK e osservare l'immagine originale etichettata Dati QAF grezzi visualizzata, nonché l'immagine QAF a 32 bit e l'immagine QAF codificata a colori a 8 bit.
   NOTA: L'immagine QAF codificata a colori viene utilizzata esclusivamente a scopo illustrativo; l'immagine QAF a 32 bit con i valori QAF effettivi viene utilizzata per ulteriori analisi.

6. Registrazione di immagini QAF con l'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office (plug-in utilizzato: Register_OCT_2)

NOTA: questo passaggio è necessario per allineare con precisione l'immagine OCT con l'immagine QAF, in modo che le lesioni nelle immagini QAF e nei BScan OCT siano allineate.

1. Accedere al plug-in tramite il menu a tendina Plugins | Spectralis, o creare un tasto di scelta rapida per accedere ai diversi plug-in utilizzati. A tale scopo, selezionare Register_OCT_2 in Plugin | Scorciatoie | Aggiungi scorciatoia e scegli il tasto di scelta rapida desiderato.
2. Dopo aver aperto il plug-in, fare clic su OK nella prima finestra visualizzata. Successivamente, nella finestra principale di ImageJ verrà visualizzata una finestra contenente il prompt: Scegliere una directory contenente l'esportazione XML OCT di Spectralis: . Selezionare la cartella contenente l'esportazione XML OCT di Spectralis e fare clic su Apri.
   NOTA: A questo punto verrà caricato lo Strumento di personalizzazione di Office, che a seconda della potenza di elaborazione del computer in uso potrebbe richiedere fino a 2 minuti.
3. Successivamente, attendi che venga visualizzata una finestra contenente il prompt Salva immagini registrate in: . Selezionare la directory in cui verrà archiviato EnFaceStack (file immagine allineato) e fare clic su Apri.
4. Attendi una finestra pop-up contenente il prompt Scegli un'immagine da aggiungere all'EnFaceStack: per apparire, seleziona l'immagine QAF a 32 bit per allineare l'immagine con l'SD-OCT e fai clic su Apri. Se sono incluse tutte le immagini necessarie in questo EnFaceStack , selezionare Annulla.
5. Quando la finestra successiva chiede all'utente di selezionare un'etichetta per EnFaceStack, selezionare l'etichetta QAF predefinita; in alternativa, immettere il nome desiderato della modalità nella casella Altro. Selezionare OK per registrare l'immagine.
   NOTA: non includere spazi o altri segni di punteggiatura nel campo Altro .
6. Osserva le tre finestre che si aprono. Il primo è etichettato Localizzatore e visualizza l'SD-OCT come immagine dell'occhio sinistro (OS). La seconda finestra è denominata QAF o una delle altre modalità selezionate in precedenza come occhio sinistro (OS) o destro (OD) originale. L'ultima finestra si chiama Punti di riferimento, che chiede di selezionare da uno a tre punti di riferimento in ogni immagine.
7. Allineare le due immagini selezionando da uno a tre punti di riferimento per ogni immagine-biforcazioni vaso o altre caratteristiche situate su entrambe le modalità. Ingrandisci (usa il carattere della tastiera " +" per ingrandire e " -" per rimpicciolire) prima di selezionare il punto di riferimento. Assicurati che i punti di riferimento selezionati siano distribuiti sia verticalmente che orizzontalmente nell'immagine. Una volta annotati tutti i punti di riferimento, selezionare OK nella scheda Punti di riferimento e Annulla al prompt successivo.
8. Quando viene visualizzata la finestra che richiede Visualizzare i risultati , selezionare Sì per verificare se l'immagine è stata allineata correttamente. Fallo ingrandendo una piccola imbarcazione e posizionando il cursore accanto ad essa, quindi scorri verso l'alto o verso il basso per controllare quanto si muove la nave rispetto al cursore. Se l'allineamento non è preciso, eliminare il file ".tiff" nella directory OD_QAF e riavviare il processo dall'inizio del passaggio 2.
   NOTA: Poiché i contrassegni sui Mark_BScans_OCT devono essere precisi, anche l'allineamento tra l'immagine SD-OCT e QAF deve essere molto accurato. L'allineamento perfetto al pixel può essere ottenuto sulla maggior parte delle immagini, anche se in alcuni casi l'allineamento è limitato a una precisione di tre o quattro pixel.

7. Creazione di un'immagine QAF media per il confronto (plug-in utilizzato: StandardRetina/BatchStandardRetina)

NOTA: I valori QAF dipendono fortemente dalla posizione retinica (ad esempio, ombreggiatura centrale causata dal pigmento maculare). Pertanto, i valori QAF delle drusen devono essere confrontati con i valori QAF standard della stessa regione. Come prerequisito per l'analisi, StandardRetina crea una mappa di immagini QAF mediate (ad esempio, da una coorte di controllo abbinata all'età). La mappa dell'entroterra risultante mostra una mappa pixel per pixel di un valore QAF medio per la retina centrale.

1. Esistono due modi per creare retine standard all'interno della pipeline Spectralis: il primo, AddToStandardRetina_OCT, consente un nuovo caso alla volta nella mappa enface, mentre il secondo, BatchStandardRetina, aggiunge più casi contemporaneamente.
   1. Per aggiungere un'immagine alla volta, seleziona Plugin | Spettrali | AddToStandardRetina_OCT e chiudere la schermata di apertura. Quando viene visualizzata una finestra che visualizza il testo Scegli una directory contenente un'esportazione XML OCT Spectralis, seleziona la cartella e fai clic su Seleziona per aprire BScan.
   2. Quando viene visualizzata una nuova finestra che visualizza il prompt Scegli una directory contenente le immagini EnFace registrate:, selezionare la cartella appropriata e fare clic su Seleziona.
   3. Osservare le tre finestre visualizzate, una con l'etichetta EnFaceStack che visualizza le immagini impilate dalla cartella selezionata nel secondo passaggio, la seconda con l'etichetta Bscan Stack che visualizza il BScan dello Strumento di personalizzazione di Office e una terza finestra con l'etichetta Scegli modalità. Selezionare una modalità da EnFaceStack.
   4. Selezionare una modalità e osservare la nuova finestra che si apre con il prompt Scegliere una directory contenente StandardRetina. Se non esiste già una directory contenente uno StandardRetina , selezionare una cartella vuota per creare un nuovo StandardRetina.
   5. Esaminare la nuova Retina standard, scorrere verso l'alto e verso il basso e spostare il cursore per visualizzare la media e la deviazione standard per quella posizione specifica. Fare clic sul pulsante Accettare? Per aggiungere l'ultima foto a StandardRetina o eliminarla.
2. Per aggiungere più immagini contemporaneamente, utilizzare Batch_QAF_StandardRetina.
   1. Innanzitutto, preparare un file "manifest.txt" nella stessa cartella degli ID caso e assicurarsi che elenchi il percorso relativo dalla posizione del file .txt allo Strumento di personalizzazione di Office e EnFaceStack. Separare i due con uno spazio di tabulazione e assicurarsi che non vi siano spazi vuoti aggiuntivi davanti e dietro i nomi. Il file dovrebbe essere simile a questa configurazione:
      pathToOCT_1>pathToEnFaceStack_1>001/OD-OCT>001/OD-QAF
      pathToOCT_2>pathToEnFaceStack_2>002/OD-OCT>002/OD-QAF
   2. Crea il file in un software per fogli di calcolo e salvalo come file txt. Assicurarsi che tutti i percorsi contengano la sezione (lettere di carattere) QAF per il corretto funzionamento del file manifesto. I plug-in si trovano nel menu a discesa Plugin | SpectralisBatch-Batch | QAF_StandardRetina.
   3. Chiudere la schermata di apertura e attendere che si apra una nuova finestra che visualizza il prompt Selezionare la retina standard iniziale. Selezionare una cartella con un StandardRetina preesistente o selezionare una cartella vuota per creare un nuovo StandardRetina.
   4. Cerca che venga visualizzato un messaggio con l'etichetta Seleziona modalità; il valore predefinito è QAF. Assicurarsi che il nome file della rispettiva modalità corrisponda esattamente al nome file di una sezione in ogni EnFaceStack denominato nel file manifesto. Successivamente, quando viene visualizzata una finestra in cui viene richiesto all'utente di scegliere un file manifesto (descritto in precedenza), fare clic su Annulla se non è necessario aggiungere altri file manifesto a questo StandardRetina o selezionare un altro file manifesto. Esaminare il nuovo StandardRetina in una nuova finestra denominata Accettare?, e decidere se aggiungere il batch più recente a StandardRetina o eliminare il batch più recente.
      NOTA: Il processo di combinazione di tutti i QAF in una StandardRetina potrebbe richiedere un po' di tempo.

8. Annotazione delle regioni di interesse per l'analisi (plug-in utilizzato: Mark_BScans_OCT)

1. Per contrassegnare le lesioni (come le drusen), apri Plugins | Spettrali | Mark_BScans_OCT e chiudere il prompt di apertura. Cercare una nuova finestra con l'etichetta Scegli una directory contenente un'esportazione XML OCT Spectralis da visualizzare. Selezionare la cartella con lo Strumento di personalizzazione di Office desiderato e fare clic su OK.
2. Dopo che FIJI ha caricato lo Strumento di personalizzazione di Office, osservare la nuova finestra con l'etichetta Scegli una directory contenente le immagini registrate en face da visualizzare. Selezionare la directory contenente EnFaceStack e fare clic su Seleziona.
3. Vengono ora visualizzate tre nuove finestre, una con l'etichetta EnFaceStack, una con l'etichetta BscanStack e una con l'etichetta Parametri utente.
   1. La finestra Parametri utente richiede all'utente di immettere i seguenti parametri: ID caso, che apparirà quindi nel nome del file csv di output, larghezza di banda in mm, larghezza della linea di facciata, larghezza della linea BScan e opacità della maschera della regione.
      1. Il parametro larghezza di banda in mm determina la larghezza di ogni isoscafo in millimetri ( mm ). Utilizzare la larghezza della linea di Interfaccia per modificare la larghezza della linea delle lesioni contrassegnate nella finestra denominata EnFaceStack.
      2. La larghezza della linea BScan determina la larghezza della linea sullo stack Bscan della finestra. Si noti che l'impostazione di questo parametro su 1 è l'impostazione migliore per la larghezza della linea per la maggior parte dei casi.
      3. Scegli tra una maschera facciale o una mappa delle distanze visualizzata in una finestra separata per decidere se colorare le bande interne. Successivamente, fare clic su Fine nella finestra Contrassegna in BScan nel plug-in .
   2. Successivamente, quando viene richiesto di selezionare una StandardRetina preesistente, selezionare la cartella contenente StandardRetina e fare clic su Seleziona. Si noti che se è selezionato uno StandardRetina, il Mark_BScans_OCT di uscita selezionerà il punteggio z della modalità (di un valore QAF misurato rispetto a StandardRetina). Se si preferisce il valore QAF non elaborato, fare clic su Annulla e attendere una nuova finestra con l'etichetta Messaggio che avverte che i risultati saranno valori non elaborati, non punteggi z.
4. Cerca una nuova finestra che si apre, chiedendo di scegliere una directory contenente lo stato salvato con i dati salvati. Se esiste un file di salvataggio, fare clic sulla directory contenente le sezioni | Selezionare. Nel caso in cui l'avanzamento non debba essere salvato, selezionare Annulla. Cerca una nuova finestra con l'etichetta Segna in BScan e, da un menu a discesa, seleziona Salva, Ignora, Fatto e Contrassegna.
   1. Segno: Iniziare ad annotare le regioni di interesse nel BScan, con comandi simili a quelli del plug-in "Register_OCT_2" spiegato sopra. Per contrassegnare una regione, selezionare Inizia facendo clic con il pulsante destro del mouse e trascinando il cursore del mouse verso la fine della lesione, assicurarsi che il contrassegno sia selezionato nella finestra Segna in B-Sscan e fare clic su OK. La regione di interesse è ora contrassegnata in questo BScan.
   2. Ignorare: Selezionare Ignora nella finestra Contrassegno in BScan e fare clic su OK per ignorare il contrassegno.
   3. Salvare: Selezionare Salva nella finestra Contrassegna in BScan e fare clic su OK per visualizzare una nuova finestra, contenente il prompt di selezionare una directory in cui salvare lo stato. Selezionare una cartella già esistente o crearne una nuova. Aprire i file già esistenti avviando "Mark_BScans_OCT" e selezionare la directory contenente lo stato di salvataggio quando viene visualizzata la finestra Scegli una directory contenente lo stato salvato .
      NOTA: non è possibile memorizzare più stati di salvataggio in una directory; gli stati di salvataggio da una localizzazione all'altra non possono essere cambiati facilmente (ad esempio, da TEDESCO a USA).
   4. Fatto: Selezionare Fine nella finestra Contrassegna in BScan e fare clic su OK per far apparire una nuova finestra con l'etichetta modalità di scelta .
   5. Quando viene visualizzato un prompt con l'etichetta porta la modalità corretta in cima allo stack di facce, portare in primo piano la modalità denominata QAF, che è stata allineata utilizzando "Register_OCT_2". A tale scopo, scorrere EnFaceStack, selezionare la finestra En face Stack o fare clic sulla freccia sinistra o destra. Si noti che il nome della modalità viene visualizzato nell'angolo in alto a sinistra.
   6. Per ispezionare e contrassegnare meglio le lesioni, ingrandire la finestra di Bscan. Fare clic sulla finestra B-Scan , puntare il mouse nella direzione per ingrandire e premere il tasto + ; Per rimpicciolire, premere il tasto -.
   7. Scorrere la pila BScan scorrendo verso l'alto o verso il basso con il mouse, trascinando la barra in basso a sinistra o a destra per spostarsi all'interno della scansione, oppure selezionando il riquadro B-Scan e facendo clic sui tasti freccia sinistra e destra sulla tastiera. Si noti che una panoramica dell'area corrente nello stack BScan è fornita dalla linea rossa nella finestra EnFaceStack e in alto a sinistra della finestra BScan dove viene visualizzato il numero BScan (ad esempio, 31/120).
5. Fare clic su OK per creare un nuovo file .tsv nella cartella "OD_OCT" o "OS_OCT" corrispondente. Si noti che il nome del file .tsv sarà composto da "Mark_Bscans_OCT" più l'ID del caso immesso, la lateralità e la modalità scelta nell'ultimo passaggio di Mark_Bscans_OCT. Inoltre, gli "iso-scafi" codificati a colori delle drusen verranno ora visualizzati in EnFaceStack.

Risultati

Visualizzazione dell'output
Per analizzare e trarre conclusioni adeguate dai risultati, è importante comprendere il file di output di Mark_Bscans_OCT. Le prime tre colonne sono etichettate in base all'ID del caso, alla lateralità del file e alla modalità di imaging scelta. La quarta colonna è indicata in base alla modalità ed è etichettata z-score. Si noti che al momento della stesura di questo testo, Mark BScans può calcolare tutte le lesioni solo in una volta sola; Le righe si riferiscono agli iso-scafi, le cui distanze dal bordo esterno della lesione sono specificate nelle colonne inferiore e superiore del foglio di calcolo. Gli iso-gusci misurano la fibrillazione atriale in z-score (in caso di QAF) in una circonferenza specificata che circonda la lesione. Si noti che il valore minimo di un pixel in un iso-scafo può essere trovato nelle colonne etichettate min, le colonne etichettate mediana, max, media e stdev, contengono rispettivamente la mediana, il massimo, la media e la deviazione standard della media dei valori dei pixel in uniso-scafo. La colonna n contiene il numero totale di pixel in un iso-scafo. La Figura 1 mostra una singolare drusen molle marcata di un paziente maschio di 84 anni con degenerazione maculare senile intermedia (iAMD).

La Figura 2 mostra l'occhio sinistro di un paziente rappresentativo con SDD contrassegnato con lo strumento QAF-Workflow (Figura 3). Le SDD in questo paziente sono state associate a una riduzione della fibrillazione atriale (z-score = -0,4 ± 0,2). Allo stesso modo, gli iso-scafi intorno all'SDD hanno dimostrato una riduzione dell'AF (ad esempio, l'iso-scafo più vicino = -0,3 ± 0,3) rispetto allo StandardRetina. Una spiegazione plausibile per questo fenomeno potrebbe essere l'effetto di shadowing (ridotta traslucenza) delle lesioni SDD sull'RPE. L'uso degli SDD è stato esemplare. Lo strumento consente di valutare i livelli locali di fibrillazione atriale anche in altre lesioni, come le drusen. Inoltre, lo strumento consente di monitorare i cambiamenti della fibrillazione atriale dalle lesioni nel tempo.

Figura 1: Una singolare drusen molle marcata di un paziente maschio di 84 anni con degenerazione maculare senile intermedia (iAMD). (A) L'immagine QAF di un occhio sinistro con le drusen marcate. (B) Primo piano delle drusen: centro marrone che rappresenta le drusen marcate e bande colorate che rappresentano gli iso-scafi circostanti. La tabella seguente illustra il file di output. I valori di drusen QAF vengono confrontati con i corrispondenti valori QAF dell'eccentricità corrispondente di StandardRetina. Ciò si traduce in punteggi z che rappresentano la deviazione dalla media delle aree non interessate. Il riquadro blu mostra da sinistra a destra: l'ID del caso, la lateralità dell'occhio, la modalità utilizzata e l'output desiderato (in questo caso, z-score). Le colonne all'interno del riquadro arancione mostrano i confini dell'area misurata in millimetri (inferiore = limite inferiore, superiore = limite superiore). La casella verde etichetta le colonne che mostrano le misurazioni QAF. Da sinistra a destra, questi contengono il minimo, la mediana, il massimo, il numero di pixel, la media e la deviazione standard della media. Ogni riga rappresenta un iso-guscio, le righe all'interno del riquadro blu rappresentano i valori all'interno della lesione e le righe all'interno del riquadro viola mostrano gli iso-gusci che circondano ciascuna lesione (dall'alto verso il basso con l'aumentare della distanza dalla lesione). Barra della scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: SDD marcati in un'immagine QAF di una paziente di 80 anni con AMD precoce. (A) Gli SDD possono essere visti nell'immagine QAF. La stessa immagine QAF è mostrata con annotazioni stampate di SDD. (B) Intorno a ciascuna lesione marcata, gli iso-scafi sono raffigurati con una codifica a colori (verde chiaro, verde scuro e rosso). (C) Una versione ingrandita del rettangolo blu. Il bordo esterno di ogni SDD è contrassegnato in blu. Abbreviazioni: QAF = autofluorescenza quantitativa; AMD = degenerazione maculare legata all'età; SDD = deposito di drusenoidi sottoretinici. Barra della scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Flusso di lavoro per determinare la fibrillazione atriale delle lesioni. Questa figura mostra i plug-in software necessari per determinare la fibrillazione atriale specifica per lesione. (A) L'immagine mostra un'immagine QAF codificata a colori che può essere utilizzata per visualizzare la distribuzione dei valori QAF, ma non deve essere utilizzata per ulteriori analisi. (B) Viene mostrata un'immagine QAF in primo piano, con l'immagine a infrarossi della scansione SD-OCT sullo sfondo. Questo dovrebbe visualizzare l'allineamento utilizzando le biforcazioni dei vasi. Questa operazione può essere eseguita utilizzando il plug-in Register_OCT_2. (C) Una retina standard che viene utilizzata per misurare i valori z-score delle lesioni. Le retine standard possono essere create utilizzando StandardRetina/BatchStandardRetina. (D) Viene raffigurato un BScan con frecce blu che puntano agli SDD, evidenziati da linee gialle (nota: le lesioni sono sempre contrassegnate sotto l'RPE indipendentemente dalla posizione nella direzione z). (E) Tutte le lesioni marcate sono visibili impresse su un'immagine QAF (vedere la Figura 1). Gli ultimi due passaggi vengono eseguiti utilizzando il plug-in Mark_BScans_OCT. Abbreviazioni: AF = autofluorescenza; QAF = autofluorescenza quantitativa; SDD = deposito di drusenoidi sottoretinici; IR = infrarossi; RPE = epitelio pigmentato retinico; SD-OCT = tomografia a coerenza ottica a dominio spettrale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo flusso di lavoro fornisce una guida passo passo per l'utilizzo di strumenti plug-in FIJI open source per determinare e confrontare la fibrillazione atriale di lesioni specifiche per AMD. I plug-in forniscono modelli facili da usare che non richiedono alcuna conoscenza di codifica e possono essere applicati da medici senza supporto tecnico²⁷. Per quanto ne sappiamo, questi strumenti sono unici nel loro genere per la quantificazione della fibrillazione atriale specifica per lesione.

I valori di QAF variano naturalmente attraverso la retina, con valori più alti alla periferia e più bassi nella macula a causa della distribuzione irregolare della lipofuscina e della melanolipofuscina all'interno della retina, della bassa AF dei vasi e della distribuzione irregolare del pigmento maculare. A causa dell'elevata variazione dei livelli naturali di QAF nella retina, l'analisi diretta dei valori assoluti di QAF delle lesioni non è un approccio promettente. Ad esempio, una lesione ipoautofluorescente in periferia potrebbe ancora avere valori QAF assoluti più elevati rispetto ai livelli di fluorescenza fisiologica della macula. L'uso di una retina standard e l'uso di z-score per misurare i livelli di fluorescenza delle drusen correggono questa varianza naturale dei valori QAF.

Uno z-score è una misura numerica della relazione tra il valore di una regione di interesse e la media nella retina standard. Viene calcolato sottraendo la media di un individuo dalla media della Retina standard nella stessa posizione e quindi dividendo il risultato per la deviazione standard. Questa standardizzazione consente il confronto di diverse immagini QAF, poiché lo z-score indica quante deviazioni standard un valore differisce dalla media. Un punteggio z positivo indica che il valore è superiore alla media, mentre un punteggio z negativo indica che è inferiore alla media.

È importante notare che potrebbero esserci potenziali insidie che dovrebbero essere considerate. Sebbene questo metodo tenga conto della quantità variabile di livelli di FA in tutto il fondo oculare, potrebbe non essere ancora il modo più accurato per misurare e confrontare la FA di un RPE. Gli individui hanno diversi livelli e topografia del pigmento luteale maculare e le lesioni possono influenzare anche la traslucenza della retina sovrastante^28,29. È quindi plausibile che la riduzione della fibrillazione atriale misurata nelle aree di SDD (vedi risultati rappresentativi) sia una conseguenza degli effetti di ombreggiamento piuttosto che della diminuzione dei fluorofori nell'RPE^30,31,32.

Attualmente stiamo lavorando a un flusso di lavoro per tenere conto della riflettività retinica, dello spessore e del pigmento maculare quantificato (utilizzando l'AF verde e blu) con modelli misti lineari. Inoltre, finora, QAF utilizza un fattore di correzione dipendente dall'età per tenere conto dell'opacizzazione lenticolare che non tiene conto delle differenze interindividuali nell'opacizzazione lenticolare di partecipanti di età simile^{a 33} anni. Stiamo quindi lavorando a un flusso di lavoro per un fattore di correzione personalizzato dell'autofluorescenza lenticolare e dell'opacizzazione. Per estrarre in modo affidabile le informazioni sulla fibrillazione atriale da piccole lesioni, è necessaria un'adeguata affidabilità del test-retest delle immagini QAF. Per differenziare ulteriormente le immagini QAF in cui è possibile un'analisi più dettagliata, stiamo studiando gli "indici di affidabilità delle immagini QAF" in grado di prevedere l'affidabilità del test-retest delle immagini QAF. Allo stato attuale, l'approccio prudente consiste nell'acquisire immagini duplicate e studiare l'affidabilità del retest della fibrillazione atriale specifica per la lesione.

Il metodo presentato di analizzare ulteriormente gli iso-gusci delle lesioni era tecnicamente difficile da implementare, poiché gli iso-gusci delle lesioni vicine si fondono. Le aree di iso-scafi fusi potrebbero essere caratterizzate in modo distinto a seconda della lesione considerata. La nostra soluzione è stata quella di considerare tutte le lesioni di un tipo come un'unica lesione e di analizzare la loro periferia come un iso-scafo articolare. Questo metodo, tuttavia, riduce drasticamente la capacità di misurare gli iso-scafi delle singole drusen e potrebbe essere considerato un'ulteriore insidia di questa tecnica. Metodi tecnicamente più sofisticati per tenere conto delle iso-scafi fusi o della segnalazione sospesa della FA nelle aree di iso-scafi fusi potrebbero facilitare l'analisi della FA nella circonferenza delle lesioni in futuro.

Abbiamo usato AMD come malattia modello per questo studio. Il flusso di lavoro può essere adattato per studiare le lesioni anche in altre malattie. Finora, il QAF è stato utilizzato in molte malattie corioretiniche, tra cui la malattia recessiva di Stargardt, le malattie associate alla bestrofina-1, varie forme di retinite pigmentosa, la retinopatia esterna occulta zonale acuta, lo pseudoxantoma elastico e altri 17,33,34,35,36,37. Poiché questo flusso di lavoro utilizza un software open-source, incoraggiamo altri a duplicare questo lavoro nella determinazione della fibrillazione atriale specifica per lesione e ad ampliare la nostra conoscenza dei disturbi della retina. In sintesi, presentiamo un flusso di lavoro per determinare e confrontare i livelli di fibrillazione atriale di diverse lesioni retiniche in tutta la macula. Questo flusso di lavoro apre la strada a un'analisi più approfondita della FA e potrebbe facilitare lo sviluppo di nuovi biomarcatori nell'AMD e oltre.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
BatchStandardRetina plugin
(Image J)	n.a.n.a.n.a.n.a.Mark_Bscans_OCT
plugin
office	Microsoft	n.a.n.a.QAF_xml_reader
plugin	n.a.	n.d.	n.d.
Spectralis	Heidelberg Engineering	n.a.Estensione	QAF
Plugin StandardRetina	n.a.n.a.n.a		.