Metodi migliorati per la preparazione di sezioni trasversali e supporti interi srotolati di Primordia di foglie di mais per fluorescenza e imaging confocale

Summary

I primordi delle foglie di mais sono profondamente inguainati e arrotolati, rendendoli difficili da studiare. Qui presentiamo metodi per la preparazione di sezioni trasversali e supporti interi srotolati di primordi di foglie di mais per la fluorescenza e l'imaging confocale.

Abstract

Nel mais (Zea mays) e in altre graminacee (Poaceae), i primordi fogliari sono profondamente inguainati e arrotolati all'interno della spirale fogliare, rendendo difficile studiare lo sviluppo precoce delle foglie. Qui descriviamo i metodi per preparare sezioni trasversali e supporti interi srotolati di primordi di foglie di mais per la fluorescenza e l'imaging confocale. Il primo metodo utilizza uno spellafili per rimuovere le porzioni superiori delle foglie più vecchie, esponendo la punta del primordio fogliare e consentendo la sua misurazione per un campionamento più accurato della sezione trasversale. Il secondo metodo utilizza nastro nano trasparente e biadesivo per srotolare e montare primordi a foglia intera per l'imaging. Mostriamo l'utilità dei due metodi nella visualizzazione e nell'analisi dei reporter di proteine fluorescenti nel mais. Questi metodi forniscono una soluzione alle sfide presentate dalla morfologia distintiva dei primordi delle foglie di mais e saranno utili per visualizzare e quantificare i tratti anatomici e di sviluppo delle foglie nel mais e in altre specie di erba.

Introduction

Le colture erbacee sono una delle principali fonti di cibo e biocarburanti per la popolazione mondiale¹ e migliorare l'anatomia delle foglie ha il potenziale per aumentare la loro produttività ^2,3. Tuttavia, la nostra attuale comprensione di come l'anatomia delle foglie è regolata nelle erbe è limitata⁴ e richiede l'analisi dei primordi fogliari, poiché molti tratti anatomici e fisiologici della foglia sono predeterminati all'inizio dello sviluppo ^5,6,7. Le tecniche di imaging cellulare, come la fluorescenza e l'imaging confocale, sono indispensabili per studiare l'anatomia delle foglie di erba e i tratti cellulari, ma queste tecniche sono difficili da applicare ai primordi delle foglie di erba perché sono profondamente inguainate e arrotolate all'interno della spirale fogliare. Abbiamo affrontato questo problema sviluppando metodi per la preparazione di sezioni trasversali e supporti a foglia intera srotolati per la fluorescenza e l'analisi confocale dei primordi delle foglie di mais, un sistema modello per lo studio dell'anatomia e dello sviluppo delle foglie di erba ^2,8.

La foglia di mais, come tutte le foglie d'erba, è costituita da una lama a forma di cinghia con una guaina che avvolge il gambo e sviluppa germogli 9,10,11,12,13. Le foglie si sviluppano dal meristema apicale del germoglio (SAM) in uno schema distico, dove ogni nuova foglia inizia nella posizione opposta della foglia precedente, risultando in due file di foglie lungo l'asse verticale (Figura 1A)¹⁴ . Lo stadio di sviluppo di ciascun primordio fogliare è identificato dalla sua posizione rispetto al SAM, con il primordio più vicino designato come plastocrono1 (P1) e i seguenti primordi designati come P2, P3 e così via (Figura 1B, C) ². Durante lo sviluppo (Figura 1D), il primordio fogliare appare prima come un contrafforte a forma di mezzaluna attorno alla base del SAM (P1), e poi cresce in un primordio a forma di cappuccio che si estende sul meristema (P2)9,10,11. I margini basali del cappuccio si espandono lateralmente e si sovrappongono l'un l'altro mentre la punta cresce verso l'alto, formando un primordio a forma di cono (P3-P5)¹⁰. Il primordio cresce quindi rapidamente in lunghezza, e il bordo della guaina-lama alla base diventa più prominente con la formazione del ligule, la proiezione frangia sul lato adassiale della foglia (P6/P7). Infine, la foglia si srotola mentre emerge dalla spirale durante la crescita allo stato stazionario, in cui le cellule in divisione sono limitate all'interno della piccola regione basale della lama, formando un gradiente con cellule in espansione e differenziazione lungo l'asse prossimale-distale (P7/P8)¹⁵. L'apice del germoglio di una piantina di mais contiene più primordi in diversi stadi di sviluppo, rendendolo un modello eccellente per studiare lo sviluppo delle foglie⁸.

Un'analisi accurata dello sviluppo precoce delle foglie richiede la stadiazione o l'uso di criteri standardizzati per definire fasi distinte dello sviluppo del primordium in relazione ad altri parametri morfologici o di crescita. Poiché i primordi fogliari sono nascosti all'interno del germoglio d'erba, i ricercatori in genere usano parametri come l'età della pianta o la dimensione delle foglie emergenti come predittori per gli stadi e le dimensioni dei primordi fogliari ^9,16. Nel mais, l'età cronologica della pianta è determinata dal numero di giorni dopo la semina o la germinazione (DAP/DAG)^17,18. Lo stadio vegetativo (stadio V) è determinato dalla foglia più alta con un colletto visibile, una linea chiara sul lato abassiale tra la lama e la guaina che corrisponde alla posizione della ligula e dei padiglioni auricolari, una coppia di regioni a forma di cuneo alla base della lama (Figura 1A,B)^17,19 . Tra 20 e 25 DAG, il SAM passa in un meristema di infiorescenza e cessa di produrre nuove foglie²⁰. I tassi di crescita dei primordi delle foglie di mais possono variare a seconda dell'ambiente e del genotipo della pianta. Per questo motivo, l'età delle piante e le dimensioni delle foglie emergenti non possono prevedere con precisione le dimensioni dei primordi fogliari; Tuttavia, l'utilizzo di questi parametri può aiutare a prevedere la gamma di stadi e dimensioni di Primordia per scopi sperimentali.

L'analisi della sezione trasversale è un metodo popolare per esaminare l'anatomia e lo sviluppo delle foglie nel mais e in altre erbe perché consente il campionamento di più plastocroni in una singola sezione attraverso il germoglio^21,22,23. Questo metodo è anche conveniente per l'imaging cellulare di campioni freschi, poiché le foglie circostanti fungono da impalcatura che mantiene i primordi fogliari in posizione durante il sezionamento e il montaggio²⁴. Tuttavia, uno svantaggio di questo metodo è che può essere difficile localizzare con precisione il plastocron bersaglio e la regione all'interno del primordio quando si seziona da un germoglio intatto. Inoltre, poiché la crescita delle foglie varia tra i plastocroni e lungo l'asse prossimale-distale^2,5, un campionamento impreciso potrebbe comportare un'interpretazione errata dello stadio di sviluppo e della regione del primordio in una data sezione. Pertanto, lo sviluppo di un metodo per il campionamento preciso della sezione trasversale è fondamentale per garantire l'accuratezza e la riproducibilità delle analisi anatomiche e dello sviluppo dei primordi delle foglie di erba.

L'analisi a montaggio di foglie intere consente l'indagine completa e integrativa dei processi tissutali e cellulari che si verificano su scala dell'intero organo, come la crescita proliferativa²⁵ e il pattern venoso^26,27,28. Il metodo fornisce una panoramica paradermica della foglia, consentendo la scoperta di processi e modelli distinti che altrimenti sarebbero difficili da rilevare utilizzando l'analisi della sezione trasversale^24,27. A differenza di Arabidopsis, dove esistono già metodi consolidati per l'imaging di supporti a foglia intera^29,30, attualmente non esiste un metodo standard per l'imaging di supporti a foglia intera non arrotolati nelle erbe. Un precedente protocollo per srotolare primordi isolati di foglie di mais coinvolgeva materiali non comuni e non era adatto per l'imaging cellulare³¹. Le tecniche di imaging avanzate, come la tomografia computerizzata (TC) e la risonanza magnetica (MRI), possono acquisire informazioni anatomiche 3D senza isolare e srotolare i primordi 11,32,33^, ma sono costose e richiedono attrezzature specializzate. Lo sviluppo di una tecnica per superare i vincoli imposti dalla morfologia laminata e conica dei primordi fogliari nel mais e in altre erbe farebbe progredire le indagini sui loro tratti anatomici e di sviluppo.

Qui presentiamo metodi per la preparazione di sezioni trasversali e supporti interi srotolati di primordi di foglie di mais per la fluorescenza e l'imaging confocale. Abbiamo usato questi metodi per quantificare il numero di vene e mappare la distribuzione ormonale spazio-temporale nei primordi delle foglie di mais con proteine fluorescenti (FP)²⁴. Il primo metodo consiste nel rimuovere la parte superiore delle foglie più vecchie dalle piantine di mais con uno spellafili (Figura 1E). Esponendo la punta del primordio (P5-P7), diventa possibile determinarne la lunghezza senza dover rimuovere completamente le foglie circostanti più vecchie, consentendo così un sezionamento facile e preciso. Il secondo metodo prevede lo srotolamento e il montaggio di primordi a foglia intera (P3-P7) con nastro nano biadesivo trasparente (Figura 1F). Questi metodi sono adatti per visualizzare vari FP²⁴, ma necessitano di ottimizzazione per l'utilizzo di coloranti fluorescenti e reagenti di clearing. Inoltre, delineiamo alcune procedure per appiattire gli stack z, cucire le immagini e unire i canali in ImageJ/FIJI³⁴, che si applicano alle immagini prodotte dai due metodi. Questi metodi sono utili per la fluorescenza di routine o l'imaging confocale delle foglie di mais, ma possono anche essere adattati per altre specie di erba modello, come riso, Setaria e Brachypodium.

Figura 1: Organizzazione e morfologia dei primordi delle foglie di mais e panoramica dei metodi . (A) Rappresentazione schematica di una piantina di granturco. Il mais ha una fillotassia distica, con la nuova foglia che inizia nella posizione opposta della foglia precedente. Il numero di foglie indica l'ordine cronologico in cui le foglie sono emerse dalla germinazione (cioè prima foglia, L1; seconda foglia, L2; terza foglia, L3; ecc.). Ogni foglia ha una lama distale e una guaina basale delineata da un collare che corrisponde alla ligula e al padiglione auricolare. La foglia più alta con il colletto visibile denota la fase vegetativa. La piantina in questo esempio è allo stadio V2, con il collare L2 (punta di freccia) visibile. L'icona delle forbici indica la posizione al mesocotile (me) dove la piantina deve essere tagliata per essere raccolta. (B) Rappresentazione schematica del germoglio sezionato che mostra isolati da L1 a L4, con i primordi fogliari da L5 a L9 mostrati come immagine ingrandita in (C). Il numero di plastocroni indica la posizione del primordio rispetto al SAM, con il primordio fogliare più giovane (P1) più vicino al SAM e i primordi fogliari più vecchi (P2, P3, P4 e così via) successivamente più lontani². (D) Rappresentazione schematica della morfologia dei primordi delle foglie di mais da P1 a P5. (E) Panoramica schematica del metodo per l'analisi della sezione trasversale dei primordi delle foglie di mais. (1) Tagliare le foglie più vecchie con uno spellafili. (2) Misurare il primordio e sezionare le riprese. (3) Montare la sezione su una diapositiva per l'imaging e l'elaborazione (4, 5). F) Panoramica schematica del metodo di analisi a montaggio intero dei primordi delle foglie di granturco. (1) Rimuovere le foglie circostanti per estrarre il primordium. (2) Tagliare e srotolare il primordium piatto sul nano nastro. (3) Montare il campione per l'imaging e l'elaborazione (4, 5). Abbreviazioni: L = foglia; bl = lama; sh = guaina; co = collare; me = mesocotile; V = vegetativo; P = plastocron; SAM = meristema apicale di tiro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Protocol

1. Messa in scena dello sviluppo delle foglie di mais e progettazione dell'esperimento

1. Crescita delle piante e messa in scena dello sviluppo delle foglie
   1. Determinare l'età e lo stadio di sviluppo delle piante da utilizzare per l'esperimento ed eseguire una stadiazione dettagliata dello sviluppo delle foglie.
      NOTA: Si raccomanda di eseguire la stadiazione su piante con lo stesso background genetico delle linee mutanti o transgeniche che verranno utilizzate negli esperimenti. Il SAM smette di produrre nuove foglie tra 20 e 25 DAG, a seconda del background genetico e delle condizioni di crescita. Per questo motivo, i metodi qui descritti sono ideali per le piantine di mais di età compresa tra 7 e 14 anni DAG.
   2. Coltivare le piante di mais in una serra o in una camera di crescita seguendo un protocollo di cura delle piante adatto³⁵.
   3. Raccogliere le piante all'età desiderata o allo stadio V con un coltellino o un paio di forbici tagliando il mesocotile, che è il fusto sotto la superficie del suolo (Figura 1A). Inserire con cura lo strumento di taglio nel terreno accanto alla piantina e farlo scorrere verso la base con un angolo di 45 ° per tagliare il mesocotile.
   4. Sollevare la piantina dal terreno e spolverare via lo sporco residuo o le particelle di terreno che potrebbero essere aggrappate alla pianta. Rimuovere a mano il coleoptile, la guaina protettiva che copre il germoglio emergente nelle giovani piantine.
   5. Per ogni pianta, registra lo stadio V, il numero di foglie e la lunghezza dell'ultima foglia che emerge dalla spirale. Scatta foto delle piante per riferimento futuro.
   6. Rimuovere le foglie più vecchie una per una. Per fare questo, tenere la pianta per i resti del mesocotile o del gambo e asportare ogni foglia dalla base della guaina e aprire delicatamente la guaina in modo circolare con una sonda dentale (Figura 1B).
      NOTA: vedere il passaggio 2.1 per un metodo rapido per rimuovere le foglie circostanti.
   7. Sotto un microscopio stereo con un ingrandimento di circa 2x, sezionare attentamente il resto dell'apice del germoglio su salviette umide per evitare che il campione si secchi. Asportare delicatamente e dispiegare ogni primordio fogliare con una sonda dentale con un ago piegato o un paio di pinze sottili fino a quando SAM, P1 e P2 sono visibili (Figura 1D). Registrare l'aspetto e la misurazione di ciascun plastocron.
      NOTA: Vedere un esempio di stadiazione dello sviluppo fogliare nelle piantine di mais nel file supplementare 1.
2. Pianificazione dell'esperimento
   NOTA: pianificare attentamente l'esperimento può migliorare l'efficienza. Ad esempio, nell'analisi della sezione trasversale, determinare la posizione approssimativa da tagliare quando si esegue l'imaging di plastocroni o regioni specifiche può ridurre il tempo di dissezione. La Figura 2 mostra un esempio di campionamento standardizzato. Inoltre, l'ottimizzazione dei parametri di imaging in base alle proprietà degli FP o delle sonde fluorescenti può migliorare l'efficienza degli esperimenti.
   1. Utilizzare le informazioni di stadiazione come guida per focalizzare l'esperimento su plastocroni, regioni primordiali e tessuti specifici. Utilizzare gli FP o altre sonde fluorescenti di interesse per seguire le sezioni 2 e/o 3 riportate di seguito su alcuni campioni.
      NOTA: Cfr. la linea di marcatori FP di mais disponibile 36-42 stock di sementi a https://www.maizegdb.org/data_center/stock.
   2. Determinare i parametri ottimali di acquisizione delle immagini per ogni reporter o sonda FP, inclusi il rilevatore o il filtro appropriato, le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione, la dimensione del foro stenopeico e altre impostazioni. Salvare le impostazioni per riprodurre le condizioni di lavoro per ciascuno degli esperimenti.
      NOTA: Vedere Linh e Scarpella³⁰ per alcune linee guida tecniche per la microscopia a scansione laser confocale delle foglie in via di sviluppo.
   3. Pianificare il tempo di imaging in base all'emivita e ad altre proprietà del reporter FP⁴³.
      NOTA: Il tempo tra la dissezione e l'imaging deve essere considerato anche quando si pianifica un esperimento, poiché i campioni di piante fresche sono soggetti a essiccazione e cambiamenti cellulari durante questo periodo.

Figura 2: Schema di campionamento per l'analisi a sezione trasversale dei primordi delle foglie di mais. (A, sinistra) Germoglio prossimale di una piantina di mais a 7 DAG, che mostra una quarta foglia esposta (L4) a P7. Le linee spezzate indicano i sette punti di campionamento lungo il primordio, da 0,5 mm a 10 mm. (A, a destra) Rappresentazione schematica dei primordi fogliari, con la dimensione e la posizione proiettate di ciascun plastocrone: P7 (bianco); P6 (magenta); P5 (blu); P4 (verde); e P3 fino al SAM (giallo). (B-H) Immagini a fluorescenza di sezioni trasversali che rappresentano i punti di campionamento indicati in A da 10 mm (B) a 0,5 mm (H). I primordi sono pseudocolorati secondo lo schema di colori plastocronici in (A). Le sezioni sono state riprese con un microscopio a epifluorescenza utilizzando un filtro UV a emissione longpass per l'autofluorescenza. Barra della scala = 200 μm (B-H). Questa figura è stata modificata e riprodotta con il permesso di Robil e McSteen²⁴. Abbreviazioni: DAG = giorni dopo la germinazione; P = plastocron; SAM = meristema apicale di tiro; † = guaina fogliare o pre-ligula propriamente detta; * = meristema apicale di tiro; ** = stelo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

2. Imaging delle sezioni trasversali dei primordi delle foglie di mais

1. Spogliare le foglie circostanti più vecchie e misurare il primordio fogliare
   1. Raccogliere la piantina tagliandola accuratamente al mesocotile sotto la superficie del suolo con un coltellino o un paio di forbici, come descritto nei passaggi 1.1.3-1.1.4 (Figura 1A).
   2. Determinare la dimensione corretta del foro per spellafili da utilizzare e dove verrà effettuato il taglio lungo le riprese. Assicurarsi che il foro sia abbastanza grande da adattarsi al primordio di destinazione.
   3. Inizia a tagliare nella parte più distale del germoglio e lavora gradualmente verso la base fino a quando la punta del primordio è esposta.
   4. Per effettuare il taglio, tieni lo spellafili con le mascelle rivolte verso le riprese. Posiziona il germoglio sul foro selezionato e stringi insieme le maniglie della spogliarellista per tagliare la spirale delle foglie.
      NOTA: Per evitare di tagliare accidentalmente il primordio del bersaglio, allineare con attenzione il centro delle riprese con il foro nello spellafili. Per le piante più grandi, si consiglia di rimuovere manualmente alcune delle foglie circostanti a mano prima di utilizzare lo spogliarellista.
      ATTENZIONE: Gli spellafili hanno mascelle affilate che possono causare tagli o altre lesioni se non usati con attenzione.
   5. Mentre continui a stringere le maniglie insieme, fai scorrere la spogliarellista lontano dal germoglio per tagliare la parte superiore delle foglie. Assicurarsi che la regione bersaglio nel primordio rimanga inguainata dalle foglie circostanti (Figura supplementare S1C,D).
      NOTA: Dopo aver tagliato le foglie superiori, il germoglio viene lasciato con una punta primordiale esposta (P5, P6 o P7, a seconda della posizione del taglio e della dimensione del foro di spellafilo utilizzato; Figura 1E). Questo primordio servirà come riferimento per stimare le dimensioni e lo stadio dei primordi più giovani. P6 è il riferimento più pratico da utilizzare nelle piantine di mais grazie alla sua gamma di dimensioni e alla morfologia simile a uno spillo.
   6. Usa un righello per misurare la lunghezza dalla punta del primordio alla base delle riprese. Registrare la misurazione.
      NOTA: La lunghezza del primordio sarà leggermente sovrastimata in quanto vi sono pochi millimetri di fusto alla base dei primordi (Figura 2A).
2. Sezionamento a mano libera e imaging del primordium fogliare
   1. Sotto un microscopio stereo con un ingrandimento di circa 0,8x, tenere fermo il germoglio su una superficie liscia, come un tagliere di vetro o altro materiale resistente ai graffi. Utilizzare una lama di rasoio o un bisturi per tagliare sezioni sottili (0,25-0,8 mm) delle riprese nei punti desiderati lungo la lunghezza del primordium.
   2. Fai un taglio iniziale leggermente sopra la regione target per scartare la porzione distale del tiro, quindi ottieni sezioni sottili attorno alla regione target. Per fare tagli netti, tieni la lama perpendicolare al germoglio e fai scorrere verso l'interno con un movimento regolare e uniforme.
      NOTA: Ci possono essere alcuni millimetri di margine di manovra di sezionamento per primordi più grandi (P6 o P7). Tuttavia, per primordi più piccoli (P5 e precedenti), 1 mm può fare una differenza significativa nel campionamento, poiché questi primordi sono impilati entro i primi millimetri dalla base del germoglio (vedi Figura 2A, F-H). Si consiglia di utilizzare una lama di rasoio a doppio taglio per un sezionamento più fine.
      ATTENZIONE: Prestare attenzione quando si utilizzano lamette e bisturi per evitare tagli o lesioni accidentali.
   3. Sostituire regolarmente la lama del rasoio, poiché le guaine fogliari possono facilmente opacizzare la lama. Coprire il germoglio con salviette umide dopo ogni ciclo di sezionamento per evitare che il campione si secchi.
   4. Montare la sezione fogliare su un vetrino pulito (75 mm x 25 mm), utilizzare una pipetta per applicare una goccia d'acqua (o glicerolo al 50%) direttamente sulla sezione e posizionare un vetrino (22 mm x 22 mm) sulla parte superiore.
   5. Se si utilizza un colorante fluorescente, applicare la soluzione colorante alla sezione, posizionare un coprivetrino sulla parte superiore e incubarlo secondo necessità.
      NOTA: a seconda del tipo di colorante, potrebbero essere necessari ulteriori passaggi per la lavorazione delle sezioni fogliari prima di procedere alla fase successiva. Questi riferimenti^44,45,46,47 forniscono dettagli generali e usi dei coloranti fluorescenti nell'imaging delle cellule vegetali. Un colorante fluorescente colorante per nucleo, la 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU), è stato utilizzato efficacemente su sezioni trasversali di primordia⁴⁸ di foglie di mais. Al contrario, i coloranti per la colorazione delle membrane plasmatiche, come Fei Mao 4-64 (FM 4-64) e lo ioduro di propidio, non producono risultati soddisfacenti (Figura 3A-D).
   6. Posizionare il vetrino sul palco di un microscopio a scansione laser a epifluorescenza o confocale e regolare la messa a fuoco e le impostazioni necessarie per visualizzare il fluoroforo³⁰. Vedere la Tabella 1 per le impostazioni di illuminazione e acquisizione delle immagini utilizzate per selezionare le linee di reporter FP del mais.
      NOTA: sezioni spesse possono produrre alti livelli di autofluorescenza di fondo. Considerare alcune strategie di imaging e preparazione dei campioni che possono aiutare a mitigare questo problema^30,49 (vedere Tabella 2).
      ATTENZIONE: Prestare attenzione e indossare occhiali protettivi quando si lavora con potenti sorgenti luminose e laser per ridurre il rischio di danni agli occhi.
   7. Immagine attraverso la sezione dell'anta a diversi ingrandimenti e canali di rilevamento (compresa l'illuminazione in campo luminoso)³⁰. Usa l'ingrandimento 4x per visualizzare l'intera sezione trasversale e l'ingrandimento 20x o 40x per visualizzare tessuti specifici. Ridurre il tempo di esposizione a ingrandimenti più elevati per l'imaging con epifluorescenza per proteggere i campioni dal rapido fotosbiancamento (vedere Tabella 1).
   8. Cattura immagini dell'intera sezione o di specifiche regioni di interesse (ROI). Se necessario, acquisire uno z-stack, che è una serie di immagini catturate a diverse profondità focali³⁰.
   9. Per acquisire uno z-stack, determinare prima le posizioni superiore e inferiore nel campione, quindi il numero di sezioni ottiche che devono essere catturate tra queste posizioni. Un minor numero di sezioni ottiche si traduce in una dimensione Z-step maggiore, che è la distanza tra ciascuna sezione. A seconda delle proprietà dell'FP e dell'ingrandimento utilizzato, acquisire da tre a 25 sezioni ottiche con dimensioni z-step comprese tra 1 e 12 μm per l'imaging di sezioni trasversali dei primordi delle foglie di mais.
      NOTA: per appiattire lo z-stack, utilizzare una tecnica di rendering del volume appropriata⁵⁰ che può essere eseguita tramite il software del microscopio o utilizzando ImageJ/FIJI³⁴ (vedere i passaggi 4.1 e 4.2).
   10. Salvare tutti i file di immagine e i metadati associati, se disponibili.

Tabella 1: Impostazioni di illuminazione e acquisizione delle immagini utilizzate per la fluorescenza e l'imaging confocale di reporter FP di mais selezionati. Abbreviazioni: FP = proteina fluorescente; TRITC = tetrametilrhodamina; FITC = isotiocianato di fluoresceina; WLL = laser a luce bianca; Ar-ion = laser agli ioni di argon; HyD = rivelatore ibrido; AU = unità Airy; Hz = Hertz, linea di scansione al secondo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

3. Imaging di interi supporti srotolati di primordia di foglie di mais

1. Sezionare i primordi e preparare il vetrino con nano tape
   1. Raccogliere la piantina tagliandola accuratamente nel mesocotile sotto la superficie del suolo con un coltellino o un paio di forbici, come descritto nei passaggi 1.1.3-1.1.4 (Figura 1A).
   2. Preparare il vetrino (75 mm x 25 mm) con il nano nastro biadesivo trasparente (figura supplementare S1H) prima di sezionare la pianta. Taglia un pezzo rettangolare di nastro nano e incollalo al centro di un vetrino pulito. Non rimuovere la pellicola protettiva di plastica sul lato superiore del nastro.
      NOTA: Determinare la dimensione del nastro da utilizzare in base alla dimensione dei campioni da visualizzare (vedere esempi di campioni sovradimensionati nella figura supplementare S1I,J). Il nano tape è disponibile in materiale gel acrilico o poliuretanico. Entrambi i tipi sono efficaci per la fluorescenza e l'imaging confocale²⁴. Per evitare lo scolorimento del nastro, proteggerlo dall'esposizione prolungata alla luce conservandolo in un contenitore scuro.
   3. Inizia a sezionare il germoglio rimuovendo la parte superiore delle foglie più vecchie con uno spellafili, come descritto nel passaggio 2.1.
   4. Tenere il germoglio dal mesocotile e rimuovere con cura le foglie circostanti con una sonda dentale per estrarre i primordi. Per fare questo, rimuovere le foglie dalla base delle riprese e spiegarle una alla volta fino a quando il primordio di interesse è esposto.
   5. In alternativa, utilizzare lo spellafili per estrarre direttamente i primordi fogliari effettuando un taglio nella regione basale del germoglio (Figura supplementare S1E-G).
      NOTA: Questo metodo comporta un rischio maggiore di rottura della primordia.
2. Montaggio e imaging del primordium.
   1. Rimuovere la pellicola protettiva dal nastro. Appoggiare il primordio esposto sul nastro. Utilizzare una lametta per tagliare il primordio alla base, scartando il gambo basale e l'ipocotile (Figura 1F).
   2. Srotolare il primordio utilizzando una sonda dentale con ago piegato (diametro della punta di 0,25-0,6 mm). Utilizzare una microsonda (diametro della punta di 0,15-0,2 mm) per primordi inferiori a 3 mm (da P3 a P4 precoce).
   3. Posizionare la punta dell'ago parallelamente alla superficie e aprire il margine basale esterno, premendolo delicatamente contro il nastro.
   4. Per uno srotolamento più agevole, lubrificare la superficie interna (adasassiale) della foglia immergendo la punta dell'ago in glicerolo al 100%.
   5. Con il margine esterno aderente al nastro, allineare la punta dell'ago parallelamente all'asse lungo della foglia. Far scorrere delicatamente l'ago lateralmente per srotolare e appiattire la foglia sul nastro (Figura 1F).
      NOTA: La rottura o il danneggiamento della foglia durante lo srotolamento è comune, specialmente nei primordi più grandi con una nervatura centrale robusta (vedi Figura 3E-G). Srotolare vigorosamente la foglia può ferire la sua superficie e produrre artefatti durante l'imaging (Figura 3H). Vedere la Tabella 2 e la discussione per le soluzioni consigliate a questi problemi.
   6. Applicare una goccia d'acqua al primordio srotolato. Posizionare immediatamente un coprislip sopra la goccia d'acqua e il primordium. Premere delicatamente i bordi del coprivetrino in modo che aderiscano al nastro.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare grandi coprivetrini rettangolari (50 mm x 24 mm o 60 mm x 24 mm) con aree extra per l'adesione al nastro. Ridurre al minimo la formazione di bolle d'aria, che possono distorcere la foglia e causare una rifrazione della luce irregolare (vedere Figura 3I-K). Assicurarsi che il coprislip aderisca completamente al nastro, poiché i margini del primordio montato potrebbero rotolare indietro sotto un coprislip liberamente aderente (vedere Figura 3L).
   7. Posizionare il vetrino sullo stadio di un microscopio a scansione laser a epifluorescenza (vedere la figura supplementare S1K) o a scansione laser confocale e regolare la messa a fuoco e le impostazioni necessarie per visualizzare il fluoroforo³⁰. Vedere la Tabella 1 per le impostazioni di illuminazione e acquisizione delle immagini utilizzate per le linee di reporter FP del mais selezionate.
   8. Immagina l'intera foglia o un ROI specifico attraverso vari canali di rilevamento³⁰. Per visualizzare l'intera foglia, acquisire manualmente le immagini a mosaico della foglia o utilizzare l'operazione di piastrellatura del microscopio a basso ingrandimento (4x o 10x).
      NOTA: Anche con l'ingrandimento più basso, i primordi delle foglie di mais possono essere troppo grandi per essere fotografati con un microscopio a scansione laser a epifluorescenza o confocale, con conseguenti tempi di imaging più lunghi che possono causare fotosbiancamento (vedi Figura 3M) o aumento dell'autofluorescenza di fondo. Pertanto, si consiglia di utilizzare uno stereomicroscopio a fluorescenza per l'imaging di campioni di foglie intere più grandi di 5 mm.
   9. Per l'imaging confocale, sarà necessario ottenere z-stack che racchiudono lo spessore della foglia (vedi passo 2.2.9).
   10. Salvare tutti i file di immagine e i metadati associati, se disponibili.

Tabella 2: Risoluzione dei problemi comuni nell'imaging di sezioni trasversali e interi supporti di primordi di foglie di mais. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figura 3: Sezione trasversale subottimale e preparazione a montaggio intero dei primordi delle foglie di mais. (A-D) Immagini confocali rappresentative di sezioni trasversali di primordi fogliari con un marcatore di membrana plasmatica, PIP2-1-CFP (A), e un colorante fluorescente legante la membrana plasmatica, FM 4-64 (B), con corrispondenti immagini in campo chiaro (C,D). Rispetto a PIP2-1-CFP, FM 4-64 visualizza una visualizzazione non ottimale dei contorni delle celle. (E-M) Immagini rappresentative di fluorescenza di interi monti di primordi fogliari che mostrano la presenza di lacerazione (E-G), superfici contuse^† (H), bolle d'aria* (I-K), margini rollbackati (L) e regioni fotosbiancate^‡ (M). I primordi fogliari esprimono DII-Venere (E-G), GAR2-YFP (H-J), mDII-Venere (K), PIN1a-YFP (L) e DR5-RFP (M). Barra di scala = 200 μm (A-D); 500 μm (E-M). La Figura 3A è stata modificata e riprodotta con il permesso di Robil e McSteen²⁴, mentre la Figura 5B-M sono dati non pubblicati dagli autori. Abbreviazioni: P = plastochron; YFP = proteina fluorescente gialla; RFP = proteina fluorescente rossa; CFP = proteina fluorescente ciano; PIP2-1-CFP = p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP; DII-Venere = pZmUbi:DII:YFP-NLS; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venere = pZmUbi:mDII:YFP-NLS; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; BF = campo luminoso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

4. Elaborazione delle immagini tramite ImageJ/FIJI

1. Appiattimento degli z-stack utilizzando la proiezione a intensità massima (MIP)
   1. Avviare ImageJ/FIJI e aprire la pila di immagini oppure creare una nuova pila da più immagini separate selezionando Immagine | Pile | Immagini da impilare dal menu.
   2. Selezionare la pila di immagini. Dal menu, seleziona Immagine | Pile | Progetto Z.... Nella finestra di dialogo Progetto Z , scegliete Intensità massima (Max Intensity ) dal menu a discesa Tipo di proiezione (Projection type ). Fate clic su OK per creare la proiezione z di intensità massima.
      NOTA: l'immagine appiattita è una proiezione 2D dei pixel con la massima intensità attraverso gli z-stack⁵⁰. Questo metodo è adatto per visualizzare il fluoroforo ma non le caratteristiche anatomiche nelle immagini a campo chiaro di sezioni trasversali spesse e supporti a foglia intera.
   3. Salvare l'immagine come TIFF (Tagged Image File Format) selezionando File | Salva con nome | Tiff. Immettere un nome per il file e fare clic su Salva.
      NOTA: si consiglia di utilizzare TIFF per la memorizzazione di immagini a fluorescenza e confocali, in quanto mantiene la qualità e il dettaglio quando l'immagine viene salvata.
2. Appiattimento degli z-stack utilizzando il plugin EDF (Extended Depth of Field)⁵¹
   1. Installare il plugin EDF⁵². Scarica il file Extended_Depth_Field.jar (versione 17.05.2021) da http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ e inseriscilo nella cartella "plugins" di ImageJ/FIJI.
   2. Avviare ImageJ/FIJI e aprire la pila di immagini oppure creare una nuova pila da più immagini separate selezionando Immagine | Pile | Immagini da impilare dal menu.
   3. Selezionare la pila di immagini. Dal menu, selezionare Plugin | Profondità di campo estesa | Modalità facile EDF. Nella finestra di dialogo Profondità di campo estesa utilizzare i dispositivi di scorrimento in Velocità/Qualità per impostare la qualità e la velocità di elaborazione desiderate e il reg Mappa altezza per impostare il livello di uniformità per la topografia. Fare clic su Esegui per creare l'immagine ricostruita.
      NOTA: EDF combina lo stack in un'immagine 2D nitida e composita proiettando la migliore messa a fuoco⁵¹. Questa tecnica è utile per superare la limitata profondità di fuoco ed è adatta per ricostruire immagini in campo chiaro di sezioni trasversali spesse o supporti a foglia intera. Prestare attenzione quando si applica questo filtro per visualizzare il fluoroforo perché, a differenza del MIP, EDF regola il contrasto dell'immagine, influenzando l'intensità dei pixel.
   4. Salvare l'immagine come file TIFF selezionando File | Salva con nome | Tiff. Immettere un nome per il file e fare clic su Salva.
3. Unire le immagini utilizzando il plugin Grid/Collection Stitching⁵³
   1. Salvare la raccolta di immagini o pile di immagini da unire in un'unica directory.
   2. Avviare ImageJ/FIJI e selezionare Plugins | Cuciture | Griglia/Cucitura di collezione dal menu. Nella finestra di dialogo Griglia/Cucitura raccolta, scegliete Posizione sconosciuta dal menu a discesa Tipo e quindi Tutti i file nella directory dall'elenco Ordine. Fare clic su OK.
   3. Nella finestra di dialogo Cucitura griglia: posizione sconosciuta, Tutti i file nella directory, specificare la posizione delle immagini digitando o incollando il percorso della directory nel campo di testo Directory oppure facendo clic su Sfoglia... per individuare la directory. Fare clic su OK per iniziare il processo di cucitura.
      NOTA: l'opzione Posizione sconosciuta nel plug-in Griglia/Raccolta Stitching ricostruisce un'immagine composita da un insieme di immagini contigue analizzando le loro regioni sovrapposte. Pertanto, questa opzione è utile per cucire mosaici di immagini di sezioni trasversali o supporti a foglia intera che non sono ottenuti utilizzando un'operazione di scansione delle piastrelle.
   4. Al termine della cucitura, verrà visualizzata una nuova finestra con l'immagine cucita. Salvare l'immagine come file TIFF selezionando File | Salva con nome | Tiff. Immettere un nome per il file e fare clic su Salva.
      NOTA: È inoltre possibile cucire grandi montaggi di immagini 2D e 3D utilizzando i comandi di ricostruzione delle immagini nel software del microscopio o tramite le opzioni di importazione dei bioformati in ImageJ/FIJI.
4. Combinazione di più canali mediante il comando Unisci canali
   1. Avviare ImageJ/FIJI e aprire le immagini o le pile di immagini da unire.
      NOTA: le pile di immagini possono essere convertite prima utilizzando i passaggi 4.1 o 4.2. La MIP è generalmente raccomandata per l'appiattimento dei canali fluorofori, mentre l'EDF è più adatto per l'appiattimento dei canali a campo chiaro o di altri canali con profondità di fuoco variabile.
   2. Regolare la luminosità e il contrasto delle immagini con Image | Regola | Luminosità/Contrasto. Utilizzare i cursori o i campi di input per regolare i parametri, quindi fare clic su Applica. In alternativa, utilizzare un metodo di allungamento dell'istogramma lineare selezionando Elabora | Migliora il contrasto.... Imposta la percentuale di pixel saturi, seleziona Normalizza, quindi fai clic su OK.
      NOTA: Quando si quantifica o si confronta l'intensità del segnale fluoroforo tra le immagini, è generalmente meglio non regolare la luminosità o il contrasto perché ciò può modificare le intensità relative dei pixel nell'immagine, che possono influenzare le misurazioni e i confronti.
   3. Per distinguere tra i canali, applicare pseudocolori a immagini specifiche utilizzando una tabella di ricerca (LUT). A tale scopo, selezionare l'immagine, quindi dal menu ImageJ/FIJI, selezionare Immagine, fare clic su Tabelle di ricerca e scegliere la LUT appropriata dall'elenco a discesa.
   4. Dal menu, seleziona Immagine | Colore | Unisci canali. Per ogni canale (C1, C2, C3...), utilizzare l'elenco a discesa per selezionare l'immagine da assegnare a quel canale. Fare clic su OK per unire i canali.
   5. Salvare la nuova immagine come TIFF selezionando File | Salva con nome | Tiff. Immettere un nome per il file e fare clic su Salva.

Results

Analisi della sezione trasversale dei primordi delle foglie di mais
Abbiamo usato la sezione 2 del protocollo per quantificare il numero di vene e caratterizzare i modelli di risposta ormonale nelle sezioni trasversali dei primordi delle foglie di mais con FP (Figura 4) ²⁴. Per valutare il ruolo dell'ormone vegetale auxina nella crescita fogliare e nella formazione delle vene, abbiamo quantificato il numero di vene nei primordi fogliari di un mutante di mais carente di auxina, nappa evanescente2⁵⁴. Nei primi plastocroni, le vene in via di sviluppo mostrano una netta cellularizzazione nello strato cellulare mediano del primordium^21,22 delle foglie di mais. Tuttavia, identificare e contare le vene utilizzando tecniche istologiche convenzionali²² può essere laborioso e richiedere molto tempo. Quindi, per quantificare le vene, abbiamo utilizzato il marcatore proteico di efflusso di auxina del mais p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP⁴¹ (PIN1a-YFP di seguito), che segna le vene in via di sviluppo e i filamenti procambiali (PCS; Figura 4A). Utilizzando la sezione 2 del protocollo, siamo stati in grado di standardizzare il campionamento della sezione trasversale misurando i primordi prima del sezionamento (Figura 4B, C). Abbiamo scoperto una tendenza in cui vt2 ha un primordio più ampio e più vene del normale (Figura 4D, E) ²⁴, che è coerente con i dati delle foglie⁵⁵ completamente espanse, indicando che il difetto in vt2 è iniziato presto nello sviluppo delle foglie. Utilizzando la sezione 2 del protocollo, siamo stati anche in grado di esaminare sistematicamente i modelli di espressione dei reporter FP di risposta ormonale nei primordi fogliari (vedi esempi delle immagini in Figura 4F-I). Attraverso uno schema di campionamento standardizzato della sezione trasversale, abbiamo mappato la distribuzione delle risposte di auxina, citochinina (CK) e acido gibberellico (GA) attraverso diversi plastocroni e regioni dei primordi fogliari e abbiamo scoperto nuovi modelli di risposta che ipotizziamo abbiano implicazioni per la crescita fogliare e la formazione delle vene²⁴. Pertanto, questi risultati rappresentativi dimostrano l'utilità della sezione 2 del protocollo per l'analisi della sezione trasversale dei primordi delle foglie di mais.

Figura 4: Risultati rappresentativi per l'analisi della sezione trasversale dei primordi delle foglie di mais. (A-E) Quantificazione del numero di vene e della larghezza del primordio nei primordi fogliari di nappe normali e evanescenti2 con il marcatore proteico di efflusso di auxina PIN1a-YFP. (A) Immagini rappresentative di fluorescenza di sezioni trasversali da P5 a P7 che esprimono PIN1a-YFP nelle vene in via di sviluppo e nei filamenti procambiali. Le sezioni trasversali sono state riprese con un microscopio a epifluorescenza utilizzando un filtro FITC (eccitazione 495-519 nm). Il numero di vene e la larghezza del primordio sono stati quantificati utilizzando rispettivamente gli strumenti multipunto e linea a mano libera in FIJI/ImageJ. (B) Una piantina di granturco con le spirali delle foglie superiori rimosse con uno spellafili per esporre la punta della quarta foglia (L4). La parentesi si estende sulla lunghezza del primordio proiettato, con la linea tratteggiata che indica la lunghezza media. (C) Diagramma schematico di varie forme primordiali da P5 a P7, che illustra come il numero di vene e la larghezza del primordium a metà lunghezza (linea tratteggiata orizzontale) possono variare a seconda dello stadio di sviluppo del primordium. (D,E) Misura della larghezza del primordio (D) e del numero di vene (E) nella sezione di media lunghezza della L4 di normale e vt2. La linea di tendenza rappresenta le medie mobili di 10 mm delle misurazioni ± l'errore standard della media (SEM). (F-I) Immagini confocali rappresentative di sezioni trasversali di primordi fogliari che esprimono combinazioni di PIN1a-YFP, reporter di risposta auxina, DR5-RFP, reporter di risposta alla citochinina, TCS-Tomato, marcatore sensibile all'acido gibberellico, GAR2-YFP e mDII-Venus, una versione mutata del reporter di ingresso di segnalazione auxina DII-Venus. I canali FP sono sovrapposti al canale a campo chiaro in ogni immagine. Barra di scala = 200 μm (A); 10 mm (B); 100 μm (F-I). Questa figura è stata modificata e riprodotta con il permesso di Robil e McSteen²⁴. Abbreviazioni: DAG = giorni dopo la germinazione; P = plastocron; vt2 = nappa evanescente2; PCS = filamento procambiale; YFP = proteina fluorescente gialla; FITC = isotiocianato di fluoresceina; RFP = proteina fluorescente rossa; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-Pomodoro = TCSv2::NLS-tdTomato; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venere = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Analisi a montaggio intero dei primordi delle foglie di mais
Abbiamo seguito la sezione 3 del protocollo per visualizzare e analizzare l'espressione di FP in mount a foglia intera di primordia di foglie di mais (Figura 5). Visualizzando i modelli di vene con PIN1a-YFP, abbiamo scoperto che la formazione delle vene si verifica nell'intero primordio durante i primi plastocroni, ma questo processo diventa limitato nelle regioni prossimali più avanti nello sviluppo (Figura 5A) ²⁴. Complementari alle analisi della sezione trasversale, le analisi a montaggio a foglia intera hanno rivelato modelli specifici del tessuto e dello stadio della risposta ormonale durante la formazione della vena²⁴. Un esempio è il modello di espressione del reporter di risposta CK TCSv2::NLS-tdTomato³⁷ (TCS-Tomato), relativo all'espressione PIN1a-YFP (Figura 5B)²⁴. Seguendo la sezione 3 del protocollo, siamo stati in grado di eseguire analisi sia qualitative che quantitative dell'espressione di FP nei primordi fogliari (Figura 5D-F; dati non pubblicati). Abbiamo esaminato i modelli di espressione di un reporter di risposta auxina, DR5rev::mRFPer⁴¹ (DR5-RFP), e di un marcatore GA-responsive, p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP³⁹ (GAR2-YFP), in montature a foglia intera di mutanti singoli e doppidi vt2 e pianta nana3 (d3), un mutante⁵⁶ carente di GA (Figura 5D). Abbiamo anche confrontato i livelli relativi di proliferazione cellulare tra primordi fogliari normali e vt2 usando p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP⁴² (Cyclin-D2B-YFP), che è un marker per la transizione G1/S nel ciclo cellulare 57 (Figura 5E,F). Mentre non c'era alcuna differenza significativa tra normale e vt2, l'espressione di ciclina-D2B-YFP era coerente con il profilo di proliferazione cellulare noto dei primi plastocroni³¹. Concludiamo che la sezione 3 del protocollo è un metodo efficace per analizzare interi monti di primordi di foglie di mais, che sono difficili da visualizzare a causa della loro morfologia arrotolata.

Figura 5: Risultati rappresentativi per l'analisi a montaggio intero dei primordi delle foglie di mais. (A) Immagini rappresentative di fluorescenza dei primordi fogliari di 7 piantine di mais DAG che mostrano vene in via di sviluppo e filamenti procambiali, come marcato dal marcatore proteico di efflusso di auxina PIN1a-YFP. I primordi P3-P6 sono stati asportati dalla base, srotolati e appiattiti con il lato adassiale verso l'alto. Gli inserti mostrano primi piani di P3 e P4. In P5 e P6, linee tratteggiate delimitano l'estremità distale delle zone proliferative, dove la maggior parte dei filamenti procambiali si sta ancora sviluppando e si estende. (B,C) Immagini confocali rappresentative che mostrano l'espressione di PIN1a-YFP e del reporter di risposta alla citochinina, TCS-Tomato, nella regione marginale prossimale di un primordio P5. (D) Immagini rappresentative di fluorescenza dei primordi P4 che mostrano l'espressione del reporter di risposta auxina, DR5-RFP, e del marcatore sensibile all'acido gibberellico, GAR2-YFP in mutanti normali e singoli e doppi di nappe evanescenti2 e piante nane3. (E) Immagini confocali rappresentative di P3 e/o P4 che mostrano l'espressione di Cyclin-D2B-YFP, un reporter per la transizione G1/S nel ciclo cellulare. (F) Quantità relative di proliferazione cellulare nei primordi fogliari P3/P4 di normale e vt2, quantificate misurando la densità integrata del segnale Cyclin-D2B-YFP sull'area del primordio utilizzando ImageJ/FIJI. Le barre rappresentano le misure medie ± l'errore standard della media. Barra di scala = 500 μm (A,D,E); 200 μm (B); 100 μm (C). La Figura 4A-C è stata modificata e riprodotta con il permesso di Robil e McSteen²⁴, mentre la Figura 4D-F è costituita da dati non pubblicati dagli autori. Abbreviazioni: DAG = giorni dopo la germinazione; P = plastocron; vt2 = nappa evanescente2; d3 = pianta nana3; YFP = proteina fluorescente gialla; RFP = proteina fluorescente rossa; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-Pomodoro = TCSv2::NLS-tdTomato; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; Ciclina-D2B-YFP = p Zm Ciclina-D2B::ZmCiclina-D2B:YFP; ns = nessuna differenza significativa; au = unità arbitraria. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Scheda supplementare 1: Esempi di stadiazione dello sviluppo fogliare nelle piantine di mais. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S1: Campioni di piante e materiali utilizzati nei protocolli. (A,B) Una piantina di mais 7-8 DAG con la spirale delle foglie superiori rimossa usando uno spellafili. (B) L'inserto mostra un primo piano delle riprese con il primordio P6 esposto. (C-G) Germogli di piantine di mais con le spirali superiori rimosse per l'analisi della sezione trasversale (C,D) e le foglie circostanti completamente rimosse per l'analisi a montaggio intero (E-G). (H) Un rotolo di nastro nano biadesivo trasparente in gel poliuretanico. (I,J) P6 foglia primordium (I) e regione prossimale della foglia P8 (J) srotolati e montati su vetrini con il nano nastro. (K) Un vetrino con un primordium di foglie srotolato montato sul palcoscenico di un microscopio a epifluorescenza. Abbreviazione: DAG = giorni dopo la germinazione. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Presentiamo due metodi per preparare i primordi delle foglie di mais per l'imaging cellulare. Il primo metodo (sezione 2 del protocollo) consente la misurazione del primordium per l'analisi della sezione trasversale, mentre il secondo metodo (sezione 3 del protocollo) consente lo srotolamento e l'appiattimento del primordium per l'analisi a montaggio completo. Questi metodi facilitano l'imaging cellulare dei FP nei primordi²⁴ delle foglie di mais (come mostrato nelle Figure 4 e 5) e forniscono soluzioni semplici alle sfide legate allo sviluppo delle foglie di mais per lo sviluppo dell'imaging. La sezione 2 del protocollo riduce il tempo di dissezione e migliora l'accuratezza del campionamento misurando i primordi prima del sezionamento piuttosto che basarsi esclusivamente sui parametri di stadiazione ^9,16. Con il nano nastro disponibile in commercio, la sezione 3 del protocollo risolve l'annoso problema dell'imaging dei primordi a foglia intera nel mais. Questo protocollo migliora il metodo precedente, che utilizzava il tubo di dialisi 31, ed è un'alternativa molto più economica alla TC e alla risonanza magnetica^11,32,33. Tuttavia, quando si tratta di visualizzare i tratti anatomici delle foglie e produrre risultati ottimali, entrambi i protocolli hanno alcune limitazioni, che sono delineate nella Tabella 2 e sono discusse più dettagliatamente di seguito.

Nella sezione 2 del protocollo, abbiamo riscontrato difficoltà a visualizzare i contorni delle cellule in sezioni trasversali spesse dei primordi fogliari e la controcolorazione con coloranti fluorescenti leganti la parete cellulare o la membrana plasmatica non ha fornito risultati soddisfacenti. Ad esempio, FM 4-64 ha prodotto risultati subottimali rispetto al marcatore FP della membrana plasmatica, p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP³⁹ (PIP2-1-CFP; Figura 3A-D). Per superare questa limitazione, si consiglia di utilizzare un vibratomo per produrre sezioni di tessuto più sottili (~ 0,1 mm)⁵⁸ che consentiranno una vivida imaging a campo chiaro dei contorni delle cellule o l'ottimizzazione del protocollo di controcolorazione^47,59.

Nella sezione 3 del protocollo, la limitazione principale è la difficoltà di montare l'anta senza strappi, danni o bolle d'aria, come dettagliato nei passaggi del protocollo 3.2.5-3.2.6 (Figura 3E-K). Poiché la foglia di mais è bilateralmente simmetrica, una montatura a mezza foglia piuttosto che una montatura a foglia intera può essere sufficiente per la visualizzazione⁹. Per fare questo, il primordio può essere tagliato con una lama di rasoio lungo l'asse longitudinale dopo averlo srotolato fino alla nervatura centrale, consentendo solo la metà della foglia da montare. Un'altra limitazione della sezione 3 del protocollo è che lo spessore della foglia può limitare la risoluzione ottica del segnale fluoroforo durante l'imaging profondo. Per risolvere questo problema, è possibile utilizzare una tecnica di pulizia dei tessuti⁶⁰. Tuttavia, abbiamo scoperto che ClearSee⁶¹, un reagente di compensazione comunemente usato per l'imaging dei tessuti vegetali, non è compatibile con il protocollo perché provoca il distacco del campione e del coprislip dal nano nastro. Una potenziale soluzione a questo problema potrebbe essere quella di applicare una membrana semipermeabile³¹ sul campione fogliare, consentendo di trattarlo con la soluzione di compensazione mentre viene tenuto in posizione dal nano nastro. Tale metodo che consente di applicare soluzioni liquide alla foglia non arrotolata potrebbe anche essere utilizzato per tecniche di ibridazione e immunolocalizzazione dell'RNA intero in situ, che sono state precedentemente ottimizzate per lo sviluppo di infiorescenze di mais ma non per primordi a foglia intera^62,63.

Abbiamo descritto i protocolli per il mais, che ha grandi primordi fogliari anche nella fase di semina. Altre specie di erba con primordi fogliari molto più piccoli, come riso, orzo, grano, Setaria e Brachypodium 16,23,64,65,66^, possono richiedere l'uso di ulteriori strumenti di precisione per applicare efficacemente questi protocolli. Inoltre, questi protocolli non erano destinati all'imaging di cellule vive, che cattura i processi dinamici in tempo reale di formazione dei tessuti e le risposte cellulari. Tuttavia, poiché le sonde fluorescenti, le tecnologie di imaging e le capacità di calcolo continuano a progredire nell'imaging di cellule vive per le piante⁶⁷, la ricerca futura potrebbe basarsi su questi protocolli per sviluppare strategie di imaging di cellule vive su misura per le caratteristiche uniche dei primordi delle foglie d'erba.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nastro nano biadesivo trasparente in gel acrilico 16,5 piedi x 1,2 pollici, spessore 2 mm	EZlifego Store (Amazon)	B07YB1ZXG6	1 rotolo
di microsonda curva Bellucci Pick 16,8 cm, 6,6 pollici	Bausch & Lomb	N1692 9	1 pz
Microsonda guida Clayman Sinskey gancio albero angolato, 11,6 cm, 4,6 pollici	Storz Opthalmic Instruments	E0542	1 pz
Sonda dentale, ago piegato, 14 cm (5,5 pollici)	Ted Pella	13553	1 pz
DOWELL 10-22 AWG Spelafili	Dowell Store (Amazon)	10-22 AWG	1 pz
Lame in acciaio al carbonio a doppio bordo	Ted Pella	121-9	pkg/10; per il sezionamento fine
Vetrini per microscopio in vetro smerigliato, 75 mm x 25 mm x 1-1,2 mm	Ted Pella	260442	pkg/144
GEM Single Edge, lame non rivestite in acciaio inossidabile	Ted Pella	121-1	box/200; per il taglio/sezionamento generale
Glycerol	Thermo Scientific	PI17904	1 litro
ImageJ/FIJI con plug-in EDF (versione 17.05.2021) e plug-in	Grid/Collection StitchingNational Institutes of Health (NIH) USA	versione 2.9.0/1.54s	Il plug-in EDF è stato sviluppato da Alex Prudencio, Jesse Berent e Daniel Sage per il Biomedical Imaging Group, É cole Polytechnique Fé dé Rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). Il software di cucitura a griglia/collezione è stato sviluppato da Stephan Preibisch per il Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).
Kimwipes Ex-L Small 111,76 mm x 213,36 mm	Kimtech Science	34155	scatola/280 strati
Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0,13 - 0,16 mm di spessore	Ted Pella	260140	1 oz
PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29,5 ft x 1,18 in, 1 mm di spessore	Yecaye Store (Amazon)	L354 W1.18	2 rotoli
Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0,13 - 0,16 mm di spessore	Ted Pella	260166	1 oncia
Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0,13 - 0,16 mm di spessore	Ted Pella	260168	1 oncia
Tagliere in vetro temperato	Hacaroa (Amazon)	B09XMXBT5S	4 pz