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Articolo metodologico

Ex Vivo Imaging multimodale basato su OCT di occhi di donatori umani per la ricerca sulla degenerazione maculare legata all'età

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DOI:

10.3791/65240

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26 maggio 2023

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1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Alabama at Birmingham Heersink School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, University Hospital of Zurich, 3Vitreous Retina Macula Consultants of New York, 4Department of Ophthalmology, New York University Grossman School of Medicine, 5Advancing Sight Network, 6Department of Ophthalmology, University Hospital Bonn

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

I test di laboratorio possono sfruttare il valore prognostico dell'imaging multimodale basato sulla tomografia a coerenza ottica longitudinale (OCT) della degenerazione maculare legata all'età (AMD). Gli occhi dei donatori umani con e senza AMD vengono ripresi utilizzando OCT, colore, oftalmoscopia laser a scansione di riflettanza nel vicino infrarosso e autofluorescenza a due lunghezze d'onda di eccitazione prima del sezionamento dei tessuti.

Abstract

Una sequenza di progressione per la degenerazione maculare legata all'età (AMD) appresa dall'imaging clinico multimodale basato sulla tomografia a coerenza ottica (OCT) (MMI) potrebbe aggiungere valore prognostico ai risultati di laboratorio. In questo lavoro, OCT e MMI ex vivo sono stati applicati agli occhi di donatori umani prima del sezionamento del tessuto retinico. Gli occhi sono stati recuperati da donatori bianchi non diabetici di età compresa tra ≥80 anni, con un tempo di morte per conservazione (DtoP) di ≤6 ore. I globi sono stati recuperati in loco, incisi con un trephine di 18 mm per facilitare la rimozione della cornea e immersi in paraformaldeide tamponata al 4%. Le immagini del fondo oculare a colori sono state acquisite dopo la rimozione del segmento anteriore con un cannocchiale da dissezione e una fotocamera reflex utilizzando l'illuminazione trans, epi- e flash a tre ingrandimenti. I globi sono stati collocati in un buffer all'interno di una camera progettata su misura con una lente da 60 diottrie. Sono stati fotografati con dominio spettrale OCT (cubo di macula di 30°, spaziatura di 30 μm, media = 25), riflettanza nel vicino infrarosso, autofluorescenza a 488 nm e autofluorescenza a 787 nm. Gli occhi AMD hanno mostrato un cambiamento nell'epitelio pigmentato retinico (RPE), con depositi di drusen o drusenoidi sottoretinici (SDD), con o senza neovascolarizzazione e senza evidenza di altre cause. Tra giugno 2016 e settembre 2017 sono stati recuperati 94 occhi destri e 90 occhi sinistri (DtoP: 3,9 ± 1,0 ore). Dei 184 occhi, il 40,2% aveva AMD, inclusa la AMD intermedia precoce (22,8%), atrofica (7,6%) e neovascolare (9,8%) e il 39,7% aveva macule insignificanti. Drusen, SDD, focolai iperriflettenti, atrofia e cicatrici fibrovascolari sono stati identificati utilizzando OCT. Gli artefatti includevano opacizzazione tissutale, distacchi (bacillare, retinica, RPE, coroideale), cambiamento cistico foveale, un RPE ondulato e danni meccanici. Per guidare la criosezione, sono stati utilizzati volumi OCT per trovare i punti di riferimento della fovea e della testa del nervo ottico e patologie specifiche. I volumi ex vivo sono stati registrati con i volumi in vivo selezionando la funzione di riferimento per l'eye tracking. La visibilità ex vivo della patologia osservata in vivo dipende dalla qualità della conservazione. Entro 16 mesi, 75 occhi rapidi di donatori di DtoP in tutte le fasi dell'AMD sono stati recuperati e messi in scena utilizzando metodi clinici MMI.

Introduzione

Quindici anni di gestione della degenerazione maculare legata all'età (AMD) neovascolare con terapia anti-VEGF sotto la guida della tomografia a coerenza ottica (OCT) hanno offerto nuove conoscenze sulla sequenza di progressione e sulla microarchitettura di questa causa prevalente di perdita della vista. Un riconoscimento chiave è che l'AMD è una malattia tridimensionale che coinvolge la retina neurosensoriale, l'epitelio pigmentato retinico (RPE) e la coroide. Come risultato dell'imaging OCT dei pazienti dello studio e degli occhi dei pazienti della clinica trattati, le caratteristiche della patologia oltre a quelle viste dalla fotografia del fondo oculare a colori, uno standard clinico per decenni, sono ora riconosciute. Questi includono neovascolarizzazione intraretinica (neovascolarizzazione maculare di tipo 31, precedentemente proliferazione angiomatosa), depositi drusenoidi sottoretinici (SDD, chiamati anche pseudodrusen reticolari)2, vie multiple del destino RPE3,4 e cellule di Müller intensamente gliotiche nell'atrofia 5,6.

Sistemi modello privi di macule (cellule e animali) ricreano alcune fette di questa complessa malattia 7,8,9. Un ulteriore successo nel migliorare l'onere dell'AMD potrebbe venire dalla scoperta e dall'esplorazione della patologia primaria negli occhi umani, dalla comprensione della composizione cellulare unica della macula, seguita dalla traduzione in sistemi modello. Questo rapporto ritrae una collaborazione trentennale tra un laboratorio di ricerca accademica e una banca degli occhi. Gli obiettivi dei metodi di caratterizzazione tissutale descritti nel presente documento sono duplici: 1) informare la tecnologia diagnostica in evoluzione dimostrando le basi dell'aspetto del fondo oculare e delle sorgenti di segnali di imaging con la microscopia e 2) classificare i campioni di AMD per tecniche di scoperta molecolare mirate (immunoistochimica) e non mirate (spettrometria di massa di imaging, IMS e trascrittomica spaziale) che preservano la fovea a solo cono e la para- e perifovea ricche di bastoncelli. Tali studi potrebbero accelerare la traduzione in OCT clinico, per il quale una sequenza di progressione e un follow-up longitudinale sono possibili attraverso l'eye-tracking. Questa tecnologia, progettata per monitorare gli effetti del trattamento, registra le scansioni da una visita clinica all'altra utilizzando vasi retinici. Collegare l'OCT tracciato oculmente ai risultati di laboratorio ottenuti con tecniche distruttive potrebbe fornire un nuovo livello di valore prognostico ai risultati molecolari.

Nel 1993, il laboratorio di ricerca ha catturato fotografie a colori del fondo oscuro postmortem sulla pellicola10. Questo sforzo è stato ispirato dalla superba fotomicroscopia e istologia della retina periferica umana di Foos e colleghi 11,12,13 e dalle estese correlazioni clinico-patologiche AMD di Sarks et al.14,15. A partire dal 2009, è stato adottato l'imaging multimodale ex vivo (MMI) ancorato sul dominio spettrale OCT. Questa transizione è stata ispirata dagli sforzi simili di altri 16,17 e soprattutto dalla consapevolezza che gran parte dell'ultrastruttura descritta dai Sark era disponibile in tre dimensioni, nel tempo, nella clinica 18,19. L'obiettivo era quello di acquisire occhi con macule attaccate in un lasso di tempo ragionevole per studi ben potenziati dei fenotipi a livello cellulare nella retina, RPE e coroide. L'intento era quello di andare oltre le statistiche "per occhio" a "per tipo di lesione", uno standard influenzato dai concetti di "placca vulnerabile" della malattia cardiovascolare20,21.

Il protocollo in questo rapporto riflette l'esperienza con quasi 400 paia di occhi di donatori accesi in diversi flussi. Nel 2011-2014 è stato creato il sito Web Project MACULA di istopatologia AMD, che include spessori di strato e annotazioni da 142 campioni archiviati. Questi occhi sono stati conservati dal 1996 al 2012 in un fissativo glutaraldeide-paraformaldeide per istologia epossi-resina ad alta risoluzione e microscopia elettronica. Tutti i fundi erano stati fotografati a colori quando ricevuti e sono stati ripresi da OCT poco prima dell'istologia. Un supporto per gli occhi originariamente progettato per gli studi sul nervo ottico22 è stato utilizzato per ospitare un punzone tissutale a tutto spessore di 8 mm di diametro centrato sulla fovea. Le scansioni OCT B attraverso il centro foveale e un sito 2 mm superiore, corrispondente all'istologia agli stessi livelli, sono state caricate sul sito web, oltre a una fotografia del fondo oculare a colori. La scelta dei piani OCT è stata dettata dalla preminenza della patologia AMD sotto la fovea23 e dalla prominenza degli SDD in aree ricche di bastoncelli superiori alla fovea24,25.

A partire dal 2013, gli occhi ripresi con MMI ancorato all'OCT durante la vita erano disponibili per correlazioni clinicopatologiche dirette. La maggior parte (7 donatori su 10) ha coinvolto pazienti in uno studio di riferimento della retina (autore: K.B.F.), che ha offerto un registro di direttive avanzate per i pazienti interessati a donare i loro occhi dopo la morte per scopi di ricerca. Gli occhi sono stati recuperati e conservati dalla banca degli occhi locale, trasferiti al laboratorio e preparati allo stesso modo degli occhi del Progetto MACULA. I volumi OCT clinici pre-mortem sono stati letti senza soluzione di continuità in laboratorio, allineando così le caratteristiche patologiche osservate durante la vita con le caratteristiche osservate al microscopio26.

A partire dal 2014, la raccolta oculare prospettica è iniziata con lo screening per AMD in occhi di donatori senza anamnesi clinica ma conservati entro un limite di tempo definito (6 ore). A tale scopo, il supporto dell'occhio è stato modificato per ospitare un intero globo. Ciò ha ridotto la possibilità di distacco attorno ai bordi tagliati del punzone da 8 mm precedentemente utilizzato. Gli occhi sono stati conservati in paraformaldeide tamponata al 4% per l'immunoistochimica e trasferiti all'1% il giorno successivo per la conservazione a lungo termine. Nel 2016-2017 (pre-pandemia) sono stati recuperati 184 occhi di 90 donatori. Le statistiche e le immagini in questo report sono generate da questa serie. Durante l'era della pandemia (lockdown e conseguenze del 2020), le raccolte prospettiche per la trascrittomica e le collaborazioni IMS sono proseguite a un ritmo ridotto, utilizzando essenzialmente i metodi del 2014.

Sono disponibili altri metodi per la valutazione dell'occhio del donatore. Il Minnesota Grading System (MGS)27,28 si basa sul sistema clinico AREDS per la fotografia del fondo oculare a colori 29. I limiti di questo metodo includono la combinazione di AMD atrofica e neovascolare in uno stadio di "AMD tardiva". Inoltre, l'MGS comporta la rimozione della retina neurosensoriale prima della foto-documentazione della coroide RPE. Questo passaggio rimuove gli SDD a vari gradi30,31 e rimuove la corrispondenza spaziale della retina esterna e del suo sistema di supporto. Pertanto, gli sforzi per collegare la domanda metabolica e la segnalazione dalla retina alla patologia nella RPE-coroide possono essere ostacolati. Il sistema Utah ha implementato MMI utilizzando la fotografia a colori ex vivo e l'OCT per classificare gli occhi destinati alla dissezione in regioni per l'estrazione di RNA e proteine32. Sebbene preferibile alle estrazioni a coppa oculare intera, l'area di 3 mm di diametro a più alto rischio di progressione AMD33,34 rappresenta solo il 25% di un punch centrato sulla fovea di 6 mm di diametro. Pertanto, le tecniche in grado di localizzare i risultati in riferimento alla fovea, come il sezionamento seriale per l'immunoistochimica, sono vantaggiose.

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Protocollo

Il comitato di revisione istituzionale dell'Università dell'Alabama a Birmingham ha approvato gli studi di laboratorio, che hanno aderito alle buone pratiche di laboratorio e al livello di biosicurezza 2/2+. Tutte le banche degli occhi degli Stati Uniti sono conformi all'Uniform Anatomical Gifts Act del 2006 e alla Food and Drug Administration degli Stati Uniti. La maggior parte delle banche degli occhi statunitensi, tra cui Advancing Sight Network, sono conformi agli standard medici della Eye Bank Association of America.

La tabella dei materiali elenca le forniture e le attrezzature. Il materiale supplementare 1 fornisce una panoramica della dissezione, della fotografia del fondo oculare a colori e dell'MMI basato sull'OCT. Il materiale supplementare 2 fornisce informazioni dettagliate sull'MMI basato sullo PTOM

1. Criteri per la raccolta dei tessuti

  1. Per massimizzare la resa degli occhi AMD in uno schermo di donatori non documentati, impostare i seguenti criteri per i donatori accettabili: età ≥80 anni, bianco, non diabetico e ≤6 ore di morte per conservazione (DtoP).
    NOTA: DtoP è definito come il tempo tra la morte e quando l'occhio viene posto in un conservante fornito, in ospedale o in laboratorio.

2. Terreno di conservazione e altri preparati (laboratorio)

  1. Produrre paraformaldeide tamponata con fosfato al 4% dal 20% di stock (acquistato). Preparare 1 L aggiungendo 200 mL di paraformaldeide al 20% (fattore di diluizione 5) a 800 mL di tampone fosfato di Sorenson 0,1 M. Testare e regolare per assicurarsi che il pH sia 7,2, se necessario. Conservare a 4 °C.
  2. Erogare 30 ml di paraformaldeide tamponata con fosfato al 4% in barattoli da 40 ml.
  3. Stock etichettato 40 ml di contenitori di conservante nella banca degli occhi in modo che il tessuto possa essere recuperato in qualsiasi momento e in qualsiasi giorno.
  4. Per la conservazione degli occhi conservati, fare l'1% di paraformaldeide dalla soluzione al 4%. Preparare 1 L aggiungendo 250 mL di paraformaldeide al 4% (fattore di diluizione 4) a 750 mL di tampone fosfato di Sorenson 0,1 M. Testare e regolare il pH se necessario. Conservare a 4 °C.
    1. Preparare 1 L di una soluzione da 0,1 M dalla soluzione 0,2 M del tampone fosfato di Sorenson, pH 7,2, combinando 500 mL di acqua distillata e 500 mL di tampone Sorenson.
    2. Regolare il pH goccia a goccia usando acido cloridrico 1 N o idrossido di sodio 1 N. Conservare a 4 °C.
  5. Creare un supporto per stabilizzare gli occhi durante la dissezione. Riempire una capsula di Petri con cera dentale riscaldata fino a quando non è liquida. Quando è leggermente freddo, fare un'impressione emisferica con un grande cuscinetto a sfere, quindi congelare il piatto per facilitare la rimozione del cuscinetto a sfere.

3. Metodi della banca degli occhi

  1. Per garantire il rapido recupero dei tessuti di ricerca, recuperare rapidamente tutti i tessuti, compresi quelli destinati al trapianto.
  2. Ricevi i rinvii di morte, come richiesto dalla legge, entro 1 ora dal decesso e traccia ogni donatore con un numero di sequenza di riferimento che segue il tessuto.
  3. Per trovare casi con potenziale documentazione clinica, porre domande specifiche su AMD e malattie oculari nell'intervista di valutazione del rischio del donatore di ricerca.
  4. Per ridurre al minimo il tempo di viaggio, recuperare interi globi (distinti dalle sole cornee per il trapianto) all'interno di un'area compatta (ad esempio, città e contea suburbana adiacente).
  5. Portare due barattoli di conservante (tamponato 4% paraformaldeide) nella stanza d'ospedale del defunto per il recupero dei tessuti (invece di aspettare che il corpo venga spostato in un obitorio).
  6. Prima e durante il recupero, comunicare con gli investigatori per confermare la consegna e i tempi.
  7. Recuperare i globi in loco in ospedale, aprirli con metodi di manipolazione coerenti e immergere l'occhio aperto nel conservante (Figura 1).
    1. Tenere l'occhio del donatore asportato in posizione usando una guaina di garza stabilizzata da un emostato.
    2. Per facilitare la rimozione della cornea con un bordo largo 2 mm di sclera, utilizzare un trephine di 18 mm di diametro per segnare il globo.
    3. Per liberare la cornea con un bordo di sclera, tagliare lungo il cerchio segnato usando forbici caricate a molla con punte curve mentre stabilizza il globo con la garza tagliata dall'emostato.
    4. Sollevare la cornea dalla sclera, esponendo l'iride e il corpo ciliare.
    5. Per facilitare la penetrazione del conservante nella camera vitreale, fare una fessura lunga 2 mm nell'iride perpendicolare al margine pupillare. Porre gli occhi in barattoli di campioni con 30 ml di conservante a 4 °C e trasferirli in laboratorio su ghiaccio umido.
  8. Trasmettere elettronicamente le informazioni del donatore de-identificato dalla banca degli occhi al database del laboratorio di ricerca.
    NOTA: il database mantiene il numero di riferimento, il numero di tessuto della banca degli occhi e il numero ID del laboratorio per il monitoraggio, oltre ad altre informazioni pertinenti.

4. Preparazione del tessuto per la fotografia del fondo oculare a colori ex vivo

  1. Utilizzare due microscopi stereo, uno per la dissezione e uno per la fotografia del fondo oculare a colori.
    NOTA: Per la transilluminazione per visualizzare i cambiamenti pigmentari, utilizzare una base per la microscopia in campo oscuro.
  2. Rimuovere i resti del segmento anteriore (iride e lente). Per stabilizzare l'occhio durante la dissezione, posizionarlo nella capsula di Petri riempita di cera (materiale supplementare 1, vetrini 7-8). Per evitare che il corpo ciliare e la retina attaccata collassino nella cavità vitreale, ridurre al minimo la perturbazione dell'anello di vitreo spesso attaccato al corpo ciliare (base vitreale).
  3. Contrassegnare il polo superiore per l'orientamento. Posizionare il globo con il lato anteriore verso il basso nel piatto. Trova i tendini di inserimento del retto superiore e dei muscoli obliqui superiori. Utilizzando un applicatore di legno, applicare con parsimonia un inchiostro marcatore in una linea di 10 mm in direzione anteriore o posteriore (cioè perpendicolare all'inserimento tendineo del muscolo retto superiore).
  4. Prima della fotografia, riempire il fondo con tampone fosfato freddo di Sorensen.
  5. Inserire una perla di rubino di 1 mm nel fondo come barra della scala interna da visualizzare in ogni immagine27.
  6. Acquisisci immagini a colori con una fotocamera reflex a obiettivo singolo montata su un microscopio stereo dotato di un flash ad anello. Utilizzare l'illuminazione trans, epi- e flash a ciascuno dei tre ingrandimenti standard per catturare immagini destinate a evidenziare aree specifiche (materiale supplementare 1, diapositiva 11): 1) il fondo dell'equatore, 2) il polo posteriore (arcate vascolari, testa del nervo ottico, fovea) e 3) la fovea all'interno della macula lutea (macchia gialla).

5. Preparazione per la fotografia del fondo oculare a colori ex vivo

  1. Accendere la fotocamera e il monitor. Collegare l'otturatore remoto e rilasciare l'attuatore nel cavo e nel cavo di visualizzazione e nella videocamera/televisione (TV) HDMI (High-Definition Multimedia Interface).
  2. Impostare le impostazioni della fotocamera sulla funzione ISO manuale e sulla posizione di blocco dello specchio (bloccata in posizione per ridurre le vibrazioni).
    NOTA: fare riferimento al manuale utente del produttore per le impostazioni sulla fotocamera utilizzata. Impara dal display della fotocamera le impostazioni di sovra/sottoesposizione relative all'istogramma e alle letture dell'esposizione.
  3. Disporre due sorgenti luminose, ciascuna con due guide luminose flessibili posizionate perpendicolarmente l'una all'altra, per l'illuminazione nelle quattro direzioni cardinali sullo stadio del microscopio (materiale supplementare 1, pagina 10).
  4. Accendere le sorgenti luminose epi-illuminazione alla massima potenza.
    NOTA: è utile ma non necessario avere un sudario di feltro nero intorno al palco per limitare la dispersione della luce / flash per il fotografo.
  5. Al microscopio da dissezione, utilizzare una pinza per inserire il polo posteriore in un crogiolo di quarzo da 30 ml riempito con tampone. Lasciare che il tessuto affondi sul fondo. Inserire un rinforzo, come una spugna di tessuto, tra l'occhio e la parete del crogiolo per impedire il movimento. Inserire il tallone di rubino da 1 mm nel polo posteriore.
    NOTA: Il tallone può cadere nella coppa del nervo ottico.
  6. Posizionare con attenzione il globo nel crogiolo sul palco del microscopio stereoscopico e osservare il fondo oculare interno attraverso gli oculari del microscopio. Utilizzando l'ingrandimento più basso, orientare l'occhio identificando il segno di tessuto a ore 12, la testa del nervo ottico (ONH) e la fovea 5 ° sotto l'ONH. Ruotare l'occhio in modo che la fovea scenda al di sotto di una linea attraverso l'ONH di 5°.
    NOTA: Se si tratta di un occhio destro, l'ONH è a destra della fovea, come visto attraverso gli oculari del microscopio. Se si tratta di un occhio sinistro, l'ONH è a sinistra della fovea.
  7. Accendere la visualizzazione del monitor remoto dalla fotocamera. Assicurarsi che il cursore beam-splitter del microscopio sia impostato per osservare attraverso la porta fotografica e non attraverso la porta per gli oculari. A seconda del percorso della luce e dello specchio, preparati a ruotare il tessuto di 180 ° sul palco per un corretto orientamento.

6. Acquisizione di immagini utilizzando la fotografia del fondo oculare a colori ex vivo

  1. Con l'epi-illuminazione attivata, impostare l'ingrandimento in modo che l'intera incisione trefina di 18 mm occupi l'intero campo visivo. Aumentare l'ingrandimento in modo che sia possibile concentrarsi sul fondo della fossa foveale. Ridurre l'ingrandimento all'impostazione precedente.
  2. Regolare le impostazioni ISO nell'intervallo 1.600-3.000 in modo che i tempi di esposizione rientrino nell'intervallo centrale del misuratore sulla fotocamera.
  3. Premere il grilletto dell'otturatore remoto. Ascolta lo specchio per bloccarsi in posizione verticale. Premere nuovamente il grilletto per l'esposizione.
  4. Osservare l'immagine sul monitor, con i metadati preimpostati che mostrano rosso, verde, blu (RGB) e un istogramma a colori per l'esposizione corretta. Se l'esposizione è accettabile, procedere; In caso contrario, eliminare, rivalutare i parametri e ricreare l'immagine.
  5. Spegnere le lampade a collo d'oca per l'epi-illuminazione per evidenziare le drusen e accendere il flash, con un'esposizione di 1/4 di s, una velocità dell'otturatore della fotocamera di 1/250 s e un ISO di 100-320. Impostare la velocità del flash come predefinita o modificarla durante la configurazione iniziale della fotocamera. Acquisire un'immagine e controllare l'istogramma per una corretta esposizione.
  6. Spegnere il flash e accendere la sorgente luminosa di transilluminazione. Reimpostare l'ISO su 5.000 e assicurarsi che il tempo di esposizione non scenda al di sotto di 1/30 s a causa di potenziali vibrazioni nel sistema fotografico. Acquisire un'immagine e controllare l'istogramma per una corretta esposizione.
  7. Aumentare l'ingrandimento per visualizzare sia l'ONH che la fovea nel campo visivo. Accendere le lampade epi-illuminazione. Impostare l'intervallo ISO su 1.600-3.000. Assicurarsi che i tempi di esposizione rientrino nell'intervallo centrale della fotocamera.
  8. Spegnere le lampade epi-illuminazione e accendere il flash, con un'esposizione di 1/4 s, la velocità dell'otturatore della fotocamera preimpostata impostata su 1/250 s e l'ISO impostato su 400-800. Acquisire un'immagine e controllare l'istogramma per una corretta esposizione.
  9. Spegnere il flash e accendere la transilluminazione utilizzando la base in campo scuro. Reimpostare l'ISO su 5.000. Assicurarsi che il tempo di esposizione non sia più lento di 1/30 di s a causa delle potenziali vibrazioni nel sistema fotografico. Acquisire un'immagine e verificare la presenza di un istogramma corretto.
  10. Spegnere la transilluminazione e riaccendere le lampade di epiilluminazione.
  11. Aumentare l'ingrandimento a quello utilizzato nel passaggio 6.7. Rifocalizzare se necessario.
  12. Aumentare l'ISO nell'intervallo 3.000-6.000 e regolare il tempo di esposizione in modo che rientri nell'intervallo di esposizione corretto della fotocamera. Acquisire un'immagine.
    NOTA: il tallone rubino potrebbe non essere più visualizzato nel campo visivo. In tal caso, cattura immagini separate del tallone a questo ingrandimento come riferimento.
  13. Spegnere le lampade epi-illuminazione. Accendere il flash con un'esposizione di 1/4 s e con la velocità dell'otturatore della fotocamera a 1/250 s. Impostare la velocità del flash come predefinita o modificarla durante la configurazione iniziale della fotocamera e impostare l'ISO su 500-1.000. Acquisire l'immagine. Controllare l'istogramma per una corretta esposizione.
  14. Spegnere il flash e accendere le lampade di illuminazione trans. Reimpostare l'ISO a oltre 8.000 per consentire un tempo di esposizione più rapido con un sensore di immagine più sensibile. Assicurarsi che il tempo di esposizione non scenda al di sotto di 1/30 s a causa di potenziali vibrazioni nel sistema fotografico. Acquisire un'immagine.
  15. Esportare le immagini dalla fotocamera a un computer. Rivedere le immagini prima di rimuovere il campione dallo stadio del microscopio nel caso in cui sia necessario catturarne di nuovo.

7. Panoramica sull'acquisizione di immagini per OCT ex vivo e oftalmoscopia laser a scansione (SLO)

  1. Per l'OCT del dominio spettrale, posizionare i globi in un tampone fosfato in un supporto oculare personalizzato con una camera con una lente da 60 diottrie35. Montare il supporto oculare su una staffa su un dispositivo di imaging OCT clinico e collegarlo al punto in cui un paziente avrebbe appoggiato la fronte. Il dispositivo dello Strumento di personalizzazione di Office inserisce automaticamente una barra di scala in ogni immagine.
  2. Allo stesso tempo, utilizzando lo stesso dispositivo e con l'occhio ancora nel supporto, visualizzare i globi con un oftalmoscopio laser a scansione (SLO) utilizzando la riflettanza nel vicino infrarosso (NIR, utilizzata come immagine localizzatrice dal software di permanenza), l'autofluorescenza del fondo di eccitazione a 488 nm (FAF) e la riflettanza priva di rosso (RF).
    NOTA: L'eccitazione FAF a 787 nm in questo dispositivo è adatta solo occasionalmente perché un beam-splitter riduce la trasmissione luminosa allo SLO. Per questo motivo, viene utilizzato un secondo dispositivo per immagini FAF a 787 nm (vedi punto successivo).
  3. Separatamente, ma con l'occhio ancora nel supporto dell'occhio, visualizzare i globi con 787 nm FAF per rilevare il disturbo RPE36 utilizzando un dispositivo separato che visualizza bene questa modalità.

8. Protocollo di acquisizione delle immagini per OCT/SLO ex vivo (vedi slide in Materiale supplementare 2)

  1. Indicare il muscolo retto superiore con colorante per marcatura tissutale. Accendere il laser (freccia blu, materiale supplementare 2, pagina 1).
  2. Facendo riferimento alla pagina 2 del materiale supplementare 2, posizionare la testa dello PTOM spostando l'intera unità su due assi rispetto alla base (freccia verde) e quindi aumentando l'altezza (y) ruotando il joystick in senso orario/antiorario (cw/ccw, frecce blu). Mettere a fuoco l'immagine ruotando la manopola (freccia arancione), con la leva nera in posizione R (*). Bloccare l'unità fissando la vite a pollice (freccia viola).
  3. Inserire l'occhio nel supporto e stabilizzare dall'aspetto posteriore con distanziatori (materiale supplementare 1, pagina 13). Esercitare la minor pressione possibile per evitare di ammaccare la sclera. Orientare con il segno di tessuto per il muscolo retto superiore rivolto verso l'alto.
    NOTA: la distanza approssimativa dalla parte anteriore del supporto oculare al dispositivo OCT è di 25 mm.
  4. Aprire il software proprietario di visualizzazione e analisi per il dispositivo dello Strumento di personalizzazione di Office. Un elenco di pazienti apparirà nella colonna di sinistra. I donatori di occhi indicizzati da un numero di codice interno sono i "pazienti". Fare riferimento al manuale dell'utente del produttore.
  5. Selezionare l'icona Nuovo paziente . Completare le informazioni sui dati del paziente in base alle esigenze. Selezionare OK. Utilizzare un sistema di numerazione logicamente ordinato per i singoli occhi, come YYYYNNNL,R_agesex. Ad esempio, questo potrebbe essere 2017016R_97F.
  6. Dopo aver continuato l'immissione dei dati nella finestra seguente, premere OK. Selezionare l'operatore e studiare dal menu a discesa.
    NOTA: le informazioni immesse verranno visualizzate nei metadati esportabili.
  7. Dopo aver visualizzato una schermata vuota, toccare il pulsante giallo per avviare l'acquisizione dell'immagine.
  8. Premere IR + OCT (riflettanza nel vicino infrarosso + OCT). Consentire al laser di acquisire un'immagine SLO dal vivo del fondo oculare e della scansione B OCT.
    1. Finalizzare la corretta posizione anatomica in base all'ONH e alla fovea e utilizzare un applicatore di legno per regolare la posizione dell'occhio nel supporto. Sul pannello di controllo, ruotare il pulsante rotondo nero per regolare l'intensità.
    2. Premi lo stesso pulsante per avere una media di 9-100 fotogrammi (frecce rosse; 9 è sufficiente, 100 sembrano cremosi). Se l'unità è orientata correttamente, il fondo oculare dovrebbe essere a fuoco e la scansione B dello Strumento di personalizzazione di Office dovrebbe apparire nel terzo superiore del display (materiale supplementare 2, pagina 9, doppia freccia rossa).
    3. Nell'immagine del fondo oculare, utilizzare il cursore per spostare la linea blu per centrare la fovea (Materiale supplementare 2, pagina 9, freccia bianca). Premere Acquisisci.
      NOTA: altri pulsanti predefiniti sono Retina, EDI (off) e Line Scan.
  9. Premere RF + OCT per la prossima acquisizione. Ricontrolla la posizione per assicurarti che l'immagine non si sia spostata o degradata. Premere il pulsante nero per calcolare la media. Premere Acquisisci.
  10. Commutare il cubo interno per l'imaging ad autofluorescenza alle lunghezze d'onda di eccitazione di 488 nm e 787 nm (Materiale supplementare 2, pagina 10).
    NOTA: la posizione del cubo dopo l'interruttore.
  11. Selezionare la modalità Autofluorescenza . Ricontrollare l'allineamento. Premere Acquisisci.
  12. Per i casi sospetti di interruzione e atrofia RPE, selezionare ICGA (angiografia verde di indocianina) per l'autofluorescenza a 787 nm. Ricontrollare la posizione dell'occhio, quindi premere Acquisisci.
    NOTA: Un'immagine del fondo spesso non appare in questa modalità perché il cubo interno attenua il fascio.
  13. Riportare il cubo interno a R per l'imaging IR e rosso libero per l'acquisizione del volume.
    NOTA: la posizione del cubo dopo l'interruttore è mostrata a pagina 13 del materiale supplementare 2.
  14. Per acquisire i volumi dello Strumento di personalizzazione di Office, selezionare IR e l'impostazione del volume. Abbinare tutte le impostazioni a pagina 14 del materiale supplementare 2 attivando i pulsanti appropriati sul modulo di controllo (cubo di macula di 30°, spaziatura di 30 μm, media a seconda delle esigenze sperimentali).
  15. Si noti che la vista del fondo di riflettanza nel vicino infrarosso è coperta da linee blu di scansione B. Ricontrollare la posizione dello Strumento di personalizzazione di Office nel terzo superiore della finestra di destra. Premere Acquisisci sul modulo di controllo e attendere 5 minuti per il completamento della scansione del volume. Al termine dell'acquisizione dell'imaging, selezionare EXIT. Le immagini verranno salvate (freccia rossa).
    NOTA: le linee blu delimitano in micrometri le distanze mostrate nella vista precedente. Le scansioni iniziano la numerazione dal basso (inferiore) e procedono verso l'alto. Notare la progressione della linea rossa.
  16. Consentire al computer di elaborare le immagini acquisite, che appariranno sullo schermo (Materiale supplementare 2, pagina 16).
  17. Quando si esegue l'imaging degli occhi di un donatore, non modificare la posizione della staffa di montaggio tra gli occhi. Se l'occhio sinistro viene fotografato per primo, i risultati verranno visualizzati nella colonna OD (occhio destro). Fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare tutte le immagini, quindi selezionare Exchange OS/OD. Le immagini verranno spostate nella colonna del sistema operativo.
  18. Premere Seleziona > finestra > database. Lo schermo predefinito è il pannello 6 con l'aggiunta dell'occhio donatore ripreso nella colonna di destra (materiale supplementare 2, pagina 18). Fare clic con il pulsante destro del mouse sul paziente nel menu a discesa, scegliere Batch ed esportare il file E2E.
  19. Individuare la cartella predeterminata creata sul desktop per i trasferimenti di file. Selezionare OK. La cartella contiene i file E2E da copiare su un disco rigido esterno e archiviare.
  20. Portare l'occhio nel suo supporto all'oftalmoscopio laser a scansione, che viene utilizzato principalmente per l'autofluorescenza a 787 nm.
    NOTA: fare riferimento alla guida per l'utente del produttore per l'acquisizione e l'archiviazione delle immagini.
  21. Accendere il computer e il laser.
  22. Selezionare l'icona Nuovo paziente . Completare i dati del paziente secondo necessità.
  23. Per mantenere lo stesso foglio dati dell'occhio, premere OK. Poiché la curva a C rimane la stessa, premere Continua.
  24. Selezionare Modalità studio e immettere la password, se necessario. Mantenere la curva a C a 7,7 mm. Premere OK.
  25. Selezionate Continua (Continue) per verificare la curva a C. Selezionare l'indicatore giallo per avviare la fotocamera.
  26. Selezionare la posizione R . Allineare e orientare il globo. Selezionare la modalità IR per mettere a fuoco e orientare come sopra.
  27. Orientare la testa della telecamera spostando l'intera unità su due assi rispetto alla base (materiale supplementare 2, pagina 28, freccia verde) e quindi sollevando l'altezza (y) dell'unità (frecce blu). Mettere a fuoco l'immagine ruotando la manopola (freccia arancione). La leva nera è in posizione R (*). Dopo che questa testa è in posizione, bloccare l'unità ruotando la vite a pollice (freccia viola).
  28. Si noti che la schermata viene visualizzata come mostrato a pagina 29 del materiale supplementare 2.
  29. Spostare la manopola del selettore da R ad A. Selezionare ICGA (per ottenere un'autofluorescenza di 787 nm) in blu, intensità del 100%, un campo visivo di 30° e imaging monofase.
    NOTA: Come il colorante verde indocianina, la melanina è eccitata dalla luce di lunghezza d'onda di 787 nm.
  30. Si noti che la schermata viene visualizzata come mostrato a pagina 31 del materiale supplementare 2. Premere il disco nero per calcolare la media, quindi selezionare Acquisisci.
  31. Scegliere Finestra > database. Selezionare Importa file E2E dal dispositivo SLO; Questi file vengono memorizzati su un disco rigido esterno e caricati sul desktop.
  32. Seleziona Apri. Verificare che gli indicatori siano quelli predefiniti e selezionare OK.
  33. Si noti che il paziente ha ora due schede: una che mostra le immagini acquisite dallo SLO (freccia blu) e l'altra scheda che mostra le immagini acquisite dal dispositivo OCT (freccia rossa) (materiale supplementare 2, pagina 34).
  34. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine a 786 nm (ICGA) ed esportare l'immagine in un file denominato SLO 786 sul desktop.
  35. Per salvare l'immagine SLO di autofluorescenza a 786 nm, selezionare il paziente e fare clic con il pulsante destro del mouse per esportare le immagini come file RAW (per i file .vol) in una cartella sul desktop.
  36. Per esportare immagini dal dispositivo dello Strumento di personalizzazione di Office per trasferirle al computer di archiviazione, copiate/incollate da RAWEXPORT in una cartella denominata RAW.

9. Revisione dell'imaging

  1. Assemblare le immagini (colore, file .vol, immagini SLO) in cartelle per ciascun donatore con sottocartelle per ciascun occhio e indicizzare le cartelle consecutivamente per ID laboratorio.
  2. Registrare le impronte tissutali (qualità, patologia) in un database per un rapporto standardizzato.
  3. Esaminate i volumi dello Strumento di personalizzazione di Office esportati con un plug-in ImageJ interno.
    1. Trova il centro della fovea, che può essere riconosciuto dal centro del tuffo foveale, dall'aumento verso l'interno delle bande retiniche esterne o dal punto più sottile. Nella maggior parte dei casi, questi coincideranno, ma non sempre, poiché ciò dipende dalla conservazione foveale, dalla variabilità individuale e dalla presenza di patologia.
    2. Trova una scansione standard nella perifovea superiore (2 mm / 67 scansioni B nella direzione superiore, cioè aumentando i numeri di scansione).
    3. Salvate una pila .tif dell'intero volume per una rapida consultazione futura.
    4. Scorrere il volume dello Strumento di personalizzazione di Office nella sua interezza, a partire dalla scansione 1 (inferiore), registrando i numeri di scansione in cui vengono riconosciute le caratteristiche.
    5. Controllare l'area peripapillare oltre alla macula.
      NOTA: L'atrofia corioretinica peripapillare negli occhi più anziani include un caratteristico deposito laminare basale e neovascolarizzazione. Questa è un'area comune di cambiamento pigmentario negli occhi miopi e nel glaucoma, così come nell'invecchiamento e nell'AMD37.
  4. Ispezionare le fotografie a colori e, se possibile, collegare eventuali risultati a quelli visti dallo Strumento di personalizzazione di Office.
    NOTA: in generale, è più facile vedere prima la maggior parte dei risultati per OCT. Le fotografie a colori forniscono un'ampia visione dell'area al di fuori dell'area sullo SLO, pigmentazione coroideale tra cui nevi, presenza di eme ed essudati duri e pigmento nero nell'AMD neovascolare. Il pigmento scuro nella fovea può rappresentare melanosomi sciolti dal segmento anteriore e deve essere lavato via delicatamente con tampone usando una pipetta.
  5. Ispezionare le immagini SLO e, se possibile, collegare eventuali risultati a quelli visualizzati dallo Strumento di personalizzazione di Office.
  6. Salva le scansioni B standard alla fovea e alla perifovea, le scansioni B extra con patologia notevole o altre caratteristiche e le immagini SLO in un rapporto patologico.
  7. Classificare gli occhi come segue: Insignificante, Discutibile, AMD precoce-intermedia, AMD atrofica, AMD neovascolare, Altro, Sconosciuto, Non graduabile, Non registrato. "Discutibile" viene usato se non è chiaro se i cambiamenti sono abbastanza gravi per un'altra categorizzazione. "Not Gradable" è riservato agli occhi privi di utili scansioni OCT, come quelli con retine gravemente distaccate. "Non registrato" è riservato agli occhi che vengono elaborati immediatamente dopo la ricezione senza fotografia.
  8. Utilizzare questi criteri per AMD: grave cambiamento di RPE con depositi di drusenoidi drusen o sottoretinici, con o senza segni di neovascolarizzazione, come fluido o fibrosi, e senza evidenza di altre cause (aggiornato da Curcio et al.10 per accogliere SDD).
    NOTA: La diagnosi finale è confermata dall'analisi istologica.

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Risultati

La tabella 1 mostra che durante il 2016-2017 sono stati recuperati 184 occhi di 94 donatori bianchi non diabetici di età >80 anni. Il tempo medio di morte alla conservazione è stato di 3,9 ore (intervallo: 2,0-6,4 ore). Dei 184 occhi esaminati, 75 (40,2%) avevano una certa AMD. Sono state identificate le seguenti categorie: Insignificante (39,7%), Discutibile (11,4%), AMD precoce-intermedia (22,8%), Atrofica (7,6%), Neovascolare (9,8%), Altro (8,7%) e Sconosciuta/Non registrata/Non graduabile (<1%)...

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Discussione

Utilizzando un approccio di screening basato sulla popolazione durante un periodo di 16 mesi nell'era pre-COVID, è stato possibile procurarsi 75 occhi di donatori con AMD. Tutti sono stati recuperati con un breve DtoP e messi in scena utilizzando MMI ancorato OCT. Il criterio di età (>80 anni) è al di fuori della fascia di età tipica per i recuperi di tessuto destinati a cornee trapiantabili. Nonostante l'età avanzata, i nostri criteri hanno portato gli occhi in tutte le fasi di AMD. Molti fenotipi RPE sono comuni a tutt...

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Dichiarazioni

C.A.C. riceve supporto alla ricerca da Heidelberg Engineering e fornisce consulenza per Apellis, Astellas, Boehringer Ingelheim, Character Bioscience e Osanni. T.A. riceve supporto per la ricerca da Novartis e fornisce consulenza per Roche, Novartis, Bayer, Nidek e Apellis. K.B.F. è consulente di Genentech, Zeiss, Heidelberg Engineering, Allergan, Bayer e Novartis.

Ringraziamenti

Ringraziamo Heidelberg Engineering per la strumentazione e il design del titolare oculare originale, Richard F. Spaide MD per l'introduzione all'imaging multimodale basato su OCT, Christopher Girkin MD per aver facilitato l'accesso ai dispositivi di imaging clinico e David Fisher per la Figura 1. Il recupero degli occhi dei donatori umani per la ricerca è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH) R01EY06019 (C.A.C.), P30 EY003039 (Pittler), R01EY015520 (Smith) R01EY027948 (C.A.C., T.A.) R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) e U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, T.A.), EyeSight Foundation of Alabama, International Retinal Research Foundation (C.A.C.), Arnold and Mabel Beckman Initiative for Macular Research (C.A.C.) e Research to Prevent Blindness AMD Catalyst (Schey).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Becher, 250 mLFisher# 02-540K
Bottiglie, 1 L, Pyrex Fisher10-462-719stoccaggio per conservante
Bunsen bruciatore o fonte di caloreEisco# 17-12-818Per sciogliere la cera
Fotocamera, digitaleNikon D7200D7200
Computer e archiviazioneAppleiMac Pro; 14 TB disco rigido esternoContenitore di archiviazione immagini
, isolatoFisher# 02-591-45Per ghiaccio
bagnatoContenitori, 2 per donatore, 40 mlFisherSameco Bio-Tite  40 ml # 13-711-86Per conservante
Crogiolo, quarzo 30 mlFisher# 08-072DContenere il globo per la fotografia
Cilindro, laureato, 250 mlFisher# 08-549G
Prodotti per la pulizia disinfettante   https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Supporto per occhi con lente e staffa di montaggiocontatto J. Messingerjeffreymessinger@uabmc.edumodifica personalizzata del design originale Heidelberg Engineering
Maschere di protezione del visoFisher# 19-910-667
Pinze, Harmon FixRobozRS-8247
, Micro AdsonRoboz# Pinze RS-5232
, TessutoRoboz# RS-5172
Capsula di Petri in vetro, KimaxFisher# 23064
Guanti Diamond GripFisher# MF-300
Camici GenProFisher# 19-166-116
Software di modifica delle immaginiAdobePhotoshop 2021, Creative Suite
KimWipesFisher# 06-666
Lampade, 3 colli d'oca SchottImaging# A20800
Microscopio, stereoNikonSMZ 1000per
dissezione Microscopio, stereoOlympus SZX9fotografia del fondo oculare a colori
Paraformaldeide, 20% EMS# 15713-Sper conservante; diluito per
pHmetroFisher# 01-913-806
Tampone fosfato, Sorenson' s, 0,2 M pH 7,2 EMS# 11600-10
Flash anulareB & H Foto VideoSigma EM-140 DG 
Perlina di rubino, diametro 1 mmMeller Optics# MRB10MD
Occhiali di sicurezza 3MFisher# 19-070-940
Oftalmoscopio laser a scansioneHeidelberg EngineeringHRA2
Forbici, molla curvaRoboz# RS-5681
Contenitore per oggetti taglientiFisher# 1482763
Cavo per otturatore, dispositivo OCT remotoNikonMC-DC2
Spectral DomainHeidelberg EngineeringSpectralis HRA& OCThttps://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Cuscinetto a sfere in acciaio inossidabile, diametro 25,4 mmMcMaster-Carr# 9529K31
Colorante per marcatura tissutale, neroCancer Diagnostics Inc# 0727-1
Lame per affettare tessutiThomas Scientific# 6767C18
Trephine, MonitorStratis Healthcare# 6718L
(HDMI) e cavo per fotocamera digitaleB& H Photo VideoBH # COHD18G6PROBper la visualizzazione dal vivo e la visualizzazione remota della fotocamera
Cera, rosa dentaleEMS # 72670
Applicatori in legnoPuritan# 807-12
# # Pinze TV da 18 mm di diametro

Riferimenti

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