Il presente protocollo descrive una tecnologia di marcatura al microscopio elettronico clonabile per rilevare proteine marcate con metallotioneina nelle cellule utilizzando una nuova tecnica di sintesi di nanoparticelle d'oro basata sul meccanismo di soppressione dell'autonucleazione.
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Articolo metodologico
Sintesi diretta di nanoparticelle d'oro EM-visibili nelle cellule per l'analisi della localizzazione delle proteine con ultrastruttura ben conservata
In questo articolo
Sommario
Abstract
Analizzare la localizzazione precisa delle molecole proteiche nelle cellule con risoluzione ultrastrutturale è di grande importanza per lo studio di vari processi fisiologici o patologici in tutti gli organismi viventi. Pertanto, lo sviluppo di tag clonabili che possono essere utilizzati come sonde di microscopia elettronica è di grande valore, così come le proteine fluorescenti hanno svolto un ruolo cruciale nel campo dell'imaging ottico. Recentemente è stato scoperto il meccanismo di soppressione dell'autonucleazione (ANSM), che consente la sintesi specifica di nanoparticelle d'oro (AuNP) su tag ricchi di cisteina, come metallotioneina (MT) e proteina antigelo (AFP).
Sulla base dell'ANSM, è stata sviluppata una tecnologia di marcatura al microscopio elettronico, che consente la rilevazione specifica di proteine marcate in cellule procariotiche ed eucariotiche con un'efficienza di marcatura senza precedenti. Questo studio illustra un protocollo per la rilevazione di proteine di fusione MTn (una variante MT ingegnerizzata priva di residui aldeidico-reattivi) in cellule di mammifero con ultrastruttura ben conservata. In questo protocollo, il congelamento ad alta pressione e la fissazione del congelamento-sostituzione sono stati eseguiti utilizzando fissativi non aldeidici (come acido tannico, acetato di uranile) per preservare l'ultrastruttura quasi nativa ed evitare danni all'attività del tag causati dalla reticolazione aldeidica.
Una semplice reidratazione in un solo passaggio è stata utilizzata prima della sintesi AuNP basata su ANSM. I risultati hanno mostrato che le proteine marcate hanno preso di mira vari organelli, tra cui le membrane e il lume del reticolo endoplasmatico (ER), e le matrici mitocondriali sono state rilevate con elevata efficienza e specificità. Questa ricerca fornisce ai biologi un protocollo robusto per affrontare una vasta gamma di questioni biologiche a livello di singola molecola in contesti ultrastrutturali cellulari.
Introduzione
Nell'era postgenomica, lo sviluppo della proteina fluorescente verde (GFP) come reporter a singola molecola per la microscopia ottica ha rivoluzionato il campo della moderna ricerca sulle scienze della vita 1,2. Per decenni, la microscopia elettronica (EM) è stata un potente strumento per osservare intuitivamente l'ultrastruttura cellulare con risoluzione su scala nanometrica3; Tuttavia, l'identificazione precisa e la localizzazione delle molecole proteiche rimangono impegnative.
La tecnica di marcatura EM più comunemente usata è la tecnica di marcatura al mi....
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Protocollo
Tutti i materiali di consumo utilizzati in questo esperimento sono elencati nella tabella dei materiali. Il flusso di lavoro dettagliato del protocollo corrente è illustrato nella Figura 1.
1. Coltura cellulare su dischi di zaffiro
- Trasferire dischi di zaffiro da 3 mm x 0,16 mm in una provetta da centrifuga da 2 ml contenente 1 ml di etanolo e sonicare in un pulitore ad ultrasuoni per 10 minuti.
- Bruciare ogni disco di zaffiro in una fiamma di lampada ad alcool fino a quando non ci sono depositi visibili sulla superficie.
NOTA: Attraverso il metodo di cui ....
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Risultati
La tecnica di sintesi AuNP basata su ANSM è uno strumento estremamente utile per marcare e rilevare proteine marcate con MT con TEM26. Per convalidare la sua robustezza nelle cellule di mammifero, sono state generate tre linee cellulari stabili che esprimono EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn o Mito-acGFP-MTn nelle cellule Hela. KDEL è una sequenza canonica di ritenzione/recupero del reticolo endoplasmatico C-terminale (ER), che mantiene la proteina di fusione EGFP-MTn-KDEL all'interno del lume ER o del.......
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Discussione
Lo studio presenta qui una robusta tecnologia di etichettatura EM clonabile per la visualizzazione di singole molecole di molecole proteiche all'interno dell'ambiente cellulare con risoluzione ultrastrutturale. Le AuNP sintetizzate direttamente su tag ricchi di cisteina geneticamente codificati forniscono una localizzazione univoca e precisa delle proteine bersaglio. La tecnica di congelamento ad alta pressione e di congelamento preserva in modo eccellente l'ultrastruttura dei campioni biologici. Nel complesso, la tecnol.......
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Dichiarazioni
L'autore non dichiara conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Il protocollo qui descritto è stato derivato dall'articolo pubblicato da Jiang et al. (2020). Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del MOST (973 Programmi n. 2011CB812502 e 2014CB849902) e dal sostegno finanziario del governo municipale di Pechino.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vettore in alluminio da 0,025 mm/0,275 mm | Beijing Wulundes Biotech Ltd., o Ufficio tecnico di M. Wohlwend | ||
| 0,2 M Tampone | Sciogliere HEPES (0,2 M) in 980 mL di ddH2O, quindi aggiungere 10 mL di 100 mM di MgCl2 e 10 mL di 100 mM CaCl2 (concentrazione finale 1 mM), rispettivamente, regolare il pH a 5,5 | ||
| Microprovette MaxyClear con chiusura a scatto da 1,5 mL | Axygen Scientific | MCT150C | |
| Microprovette con tappo a vite in polipropilene da 2 mL | Biologix | 81-0204 | |
| Griglia esagonale in rame da 200 mesh | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoetanolo | Amresco | 0482-250ML | |
| Piastre per colture cellulari da 35 mm | Corning | ||
| Provette da centrifuga in polipropilene da 50 mL | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Macchina automatizzata per la sostituzione del congelamento | Leica | AFS2 | |
| Portacampioni personalizzati da 3,05 mm x 0,66 mm per HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamina | TCI | P0147 | |
| Dulbecco' s modificato Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Siero fetale bovino | GBICO | 10099-141C | |
| Capsula di inclusione a fondo piatto | Tedpella inc | ||
| Schiuma cryobox | |||
| Formvar 15/95 resina | Microscopia elettronica Scienze | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| Macchina HPF | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Scienze della microscopia elettronica | 19110 | |
| PBS-A tampone | Dissolvere NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L di ddH2O, regolare a pH 7,4 | ||
| Carta da filtro qualitativa (velocità media) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Dischi in zaffiro | Beijing Wulundes Biotech Ltd., o Ufficio di ingegneria di M. Wohlwend | ||
| Penna resistente ai solventi | Microscopia elettronica Scienze | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resina | SPI Inc | 02659-AB | |
| Elettrone di trasmissione microscopia | FEI | Tecnai G2 spirito | |
| Tripsina-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Pinzetta | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Acetato di uranile | Microscopia elettronica Scienze | 22400 |
Riferimenti
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120, 4247-4260 (2007).
- Masters, B. R.
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Ristampe e permessi
