Articolo metodologico

Un modello di infezione da Candida albicans articolare periprotesica nel topo

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DOI:

10.3791/65263

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2 febbraio 2024

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1School of Pharmacy, Health Science Center, Xi’an Jiaotong University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases in Northeast China, Ministry of Education, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University

In questo articolo

Sommario

L'infezione dell'articolazione periprotesica (PJI) causata da agenti patogeni pericolosi è comune in ortopedia clinica. I modelli animali esistenti non sono in grado di simulare accuratamente la situazione reale della PJI. Qui, abbiamo stabilito un modello murino di PJI associato al biofilm di Candida albicans per la ricerca e lo sviluppo di nuove terapie per la PJI.

Abstract

L'infezione dell'articolazione periprotesica (PJI) è una delle infezioni più comuni causate dalla Candida albicans (C. albicans), che preoccupa sempre più chirurghi e scienziati. Generalmente, nel sito di infezione si formano biofilm in grado di proteggere C. albicans dagli antibiotici e dalla clearance immunitaria. L'intervento chirurgico che comporta la rimozione dell'impianto infetto, lo sbrigliamento, il trattamento antimicrobico e il reimpianto è il gold standard per il trattamento della PJI. Pertanto, la creazione di modelli animali di PJI è di grande importanza per la ricerca e lo sviluppo di nuovi farmaci o terapie per la PJI. In questo studio, un filo liscio in lega di nichel-titanio, un impianto ampiamente utilizzato nelle cliniche ortopediche, è stato inserito nell'articolazione femorale di un topo C57BL/6 prima che i C. albicans venissero inoculati nella cavità articolare lungo il filo. Dopo 14 giorni, sono stati osservati biofilm maturi e spessi sulla superficie degli impianti sotto un microscopio elettronico a scansione (SEM). Una trabecola ossea significativamente ridotta è stata riscontrata nella colorazione H&E dei campioni articolari infetti. Per riassumere, è stato stabilito un modello PJI murino con i vantaggi di facilità d'uso, alto tasso di successo, alta ripetibilità e alta correlazione clinica. Si prevede che questo sarà un modello importante per gli studi clinici sulla prevenzione della PJI correlata al biofilm di C. albicans.

Introduzione

La Candida albicans (C. albicans) risiede commensamente in molte parti del corpo umano1, ed è anche il patogeno opportunista più comune che causa infezioni fungine invasive potenzialmente letali, specialmente nei pazienti immunocompromessi 2,3. C. albicans può trasformarsi tra lo stato di lievito e quello di micelio come fungo polimorfo. Lo stato del micelio mostra una maggiore virulenza, una maggiore adesione e l'invasione di cellule e tessuti 4,5. Inoltre, C. albicans può formare biofilm sulle superfici di materiali biomedici come protesi dentarie, cateteri e stent 1,6,7. La densa struttura tridimensionale dei biofilm limita l'infiltrazione di farmaci antimicotici, esprime geni resistenti ai farmaci e sottoregola il metabolismo delle cellule fungine per resistere alla clearance del sistema immunitario 6,7. Pertanto, le infezioni correlate ai biofilm sono piuttosto impegnative nelle cliniche8.

Lo Staphylococcus aureus, lo stafilococco coagulasi-negativo e l'enterobacter sono i principali agenti patogeni che causano la PJI9. Sebbene l'incidenza della PJI fungina sia relativamente bassa (circa l'1%)10, il costo del trattamento della PJI fungina è più alto11, il ciclo di trattamento è più lungo11 e il tasso di successo del trattamento è inferiorea 10 rispetto alla PJI batterica. Negli ultimi anni, l'incidenza della PJI fungina è aumentata di annoin anno. La Candida PJI rappresenta il 77%-84% della PJI fungina10,12 e la C. albicans è la più comune nella Candida (54%). Pertanto, la PJI fungina deve essere studiata.

Attualmente, la PJI viene trattata tramite chirurgia di revisione (1) rimuovendo l'impianto infetto, (2) sbrigliando, (3) trattando con antimicrobici e (4) reimpiantando. Dopo un accurato sbrigliamento, viene posizionato un antibiotico contenente cemento osseo e il paziente viene trattato con antibiotici per via sistemica per più di 6 settimane per controllare efficacemente l'infezione prima che venga posizionato un nuovo impianto13. Tuttavia, questo metodo non è in grado di eliminare completamente gli agenti patogeni nei tessuti e le infezioni ricorrenti trattate con terapia antimicrobica a lungo termine hanno un'alta probabilità di svilupparsi in ceppi resistenti ai farmaci 14,15,16.

La creazione di modelli animali di PJI è importante per la ricerca e lo sviluppo di nuovi farmaci o terapie per la PJI. Nello sviluppo della PJI, si formano ampi spazi morti intorno alla protesi, portando alla formazione di ematomi, che bloccano ulteriormente l'afflusso di sangue ai tessuti circostanti e compromettono l'effetto degli antibiotici 11,15. A causa della difficoltà nell'imitare l'ambiente circostante della protesi, i modelli animali tradizionali non possono simulare accuratamente la situazione reale di PJI17,18.

In questo articolo, un modello PJI associato al biofilm di C. albicans nei topi è stato costruito utilizzando un filo di titanio-nichel clinicamente ampiamente utilizzato per simulare impianti articolari19,20. Questo modello PJI presenta i vantaggi di un funzionamento semplice, di un alto tasso di successo, di un'elevata ripetibilità e di un'elevata correlazione clinica. Si prevede che sarà un modello importante per lo studio della prevenzione e del trattamento della PJI correlata al biofilm di C. albicans.

Protocollo

Gli animali sono stati acquistati dall'Università di Xi'an Jiaotong. Tutte le procedure di sperimentazione animale sono state approvate dall'Institutional Animal Ethical Committee dell'Università di Xi'an Jiaotong (numero di approvazione: SCXK [Shaanxi] 2021-103). I topi sono stati tenuti per una settimana con 5 topi per gabbia. A loro è stato permesso il libero accesso al cibo e all'acqua. Gli animali sono stati mantenuti a temperatura ambiente (RT; 24 °C ± 1 °C) e ciclo luce/buio (12 h/12 h) prima dell'esecuzione dello studio.

1. Preparazione del tampone e dell'attrezzatura

  1. Coltura cellulare di C. albicans
    1. Inoculare una colonia monoclonale di C. albicans (SC5314) da un terreno di base di peptone destrosio (YPD) estratto di lievito con un'ansa di inoculazione in 5 mL di terreno liquido YPD (YPD + 50 μg/mL di carbenicillina).
    2. Agitare successivamente le cellule di C. albicans ad una velocità di 220 giri/min a 30 °C per una notte.
    3. Centrifugare la sospensione a 400 x g per 5 minuti a RT. Risospendere le cellule di C. albicans in soluzione fisiologica normale e diluire la concentrazione di cellule a 1 x 106 cellule/mL regolando visivamente la torbidità in modo che sia uguale a quella di un McFarland 0,5.
  2. Preparazione di soluzione fisiologica normale
    1. Pesare 0,9 g di cloruro di sodio e sciogliere in 100 mL di acqua deionizzata per preparare soluzione fisiologica normale allo 0,9%.
  3. Preparazione degli strumenti chirurgici
    1. Autoclavare (121 °C, 30 min) gli strumenti chirurgici (forbici, pinze, pinze emostatiche, portaaghi, aghi da sutura) e il filo in lega di titanio-nichel (circa 0,5 mm di diametro) prima dell'uso.

2. Istituzione del modello PJI del topo

  1. Dividere in modo casuale 30 topi C57BL/6 (maschi, 15-20 g) in 3 gruppi (10 topi/gruppo), vale a dire, gruppo di controllo, gruppo implantare in bianco (impianto di filo di titanio-nichel senza infezione da C. albicans ) e gruppo PJI (impianto di filo di titanio-nichel con infezione da C. albicans ).
  2. Anestetizzare i topi con l'inalazione di isoflurano all'1-4% prima di rimuovere i peli sull'arto posteriore sinistro e disinfettarli con iodio. La perdita del riflesso di raddrizzamento e l'assenza di risposta alla stimolazione delle dita dei piedi confermano la profondità dell'anestesia. Durante l'anestesia, applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza corneale e per reintegrare il calore durante l'intervento chirurgico e il recupero.
  3. Per i topi del gruppo di controllo, non fornire alcun trattamento. Fornisci loro libero accesso all'acqua e al cibo.
  4. Per i topi del gruppo implantare bianco e del gruppo PJI, praticare un'incisione longitudinale di 5 mm sul ginocchio di ciascun arto posteriore sinistro con una lama #10 o un rasoio sterile per esporre le articolazioni.
  5. Praticare un foro di 5 mm di lunghezza nel canale intramidollare femorale inserendo un ago per siringa sterile (26 G).
  6. Inserire un filo liscio in lega di nichel-titanio (0.5 mm di diametro, 5 mm di lunghezza) nel foro prima di tagliarlo con le forbici (Figura 1).
  7. Per i topi nel gruppo implantare in bianco, aggiungere 2 μL di terreno YPD lungo il filo in lega di nichel-titanio goccia a goccia prima di chiudere la ferita strato per strato utilizzando una sutura di nylon (0,15 mm di diametro).
  8. Per i topi del gruppo PJI, inoculare 2 μL di cellule di C. albicans (1 × 106 cellule/mL) nello spazio articolare dei topi lungo il filo della lega di nichel-titanio goccia a goccia prima di chiudere la ferita strato per strato utilizzando una sutura di nylon.
  9. Ospita i topi con libero accesso all'acqua e al cibo per 14 giorni. Somministrare meloxicam per iniezione sottocutanea (4 mg/kg) ogni 24 ore per un massimo di 3 giorni.
  10. Dopo 14 giorni, anestetizzare i topi con isoflurano al 3% prima di sopprimere i topi mediante lussazione cervicale.

3. Valutazione del modello PJI

  1. Valutazione delle infezioni nei principali organi
    1. Raccogli i reni, il fegato e la milza dai topi dopo l'eutanasia.
    2. Aggiungere 500 μL di soluzione fisiologica normale sterile in ciascun organo e macinare i tessuti su un omogeneizzatore a 4 °C.
    3. Aggiungere 100 μL dell'omogenato preparato nella fase 3.1.2 su una piastra YPD prima di distribuirlo uniformemente con un'asta piegata.
    4. Posizionare le piastre YPD capovolte in un incubatore a 37 °C per 48 ore.
    5. Osserva e conta visivamente il numero di colonie.
  2. Osservazione di C. albicans e biofilm sugli impianti
    1. Tagliare con cura la pelle sopra l'articolazione dei topi con le forbici prima di raccogliere l'impianto con una pinzetta.
    2. Tenere gli impianti immersi in una soluzione di glutaraldeide al 2,5% per il fissaggio a 4 °C per 48 ore.
    3. Sciacquare gli impianti con PBS sterile tre volte prima di immergerli in una soluzione di acido osmio all'1% per 3 ore.
    4. Sciacquare gli impianti con PBS sterile tre volte prima di immergerli in soluzioni di etanolo al 50%, 70%, 80%, 90% e 100% per 15 minuti per la disidratazione.
    5. Tenere gli impianti immersi nel terz-butanolo per 30 minuti tre volte prima di liofilizzare gli impianti.
    6. Fissare i campioni dell'impianto allo stadio del campione, rivestire l'impianto con oro (rivestimento da 10 nm) e osservarlo al microscopio elettronico a scansione (SEM) sotto vuoto elevato e 1,5 kV.
  3. Analisi patologica dei tessuti femorali
    1. Raccogli i tessuti femorali con le forbici dopo l'eutanasia dei topi.
    2. Immergere i tessuti femorali in una soluzione di paraformaldeide al 4% per il fissaggio a 4 °C per 48 ore.
    3. Mettere i tessuti del femore in formalina al 10% per 1 settimana.
    4. Disidratare i tessuti del femore immergendoli in soluzioni di etanolo al 50%, 70%, 80%, 90% e 100% rispettivamente per 15 minuti.
    5. Incorporare i tessuti disidratati del femore in paraffina prima di sezionare i tessuti in campioni da 4 μm utilizzando un microtomo.
    6. Colorare le sezioni del femore con ematossilina ed eosina seguendo un protocollo standard prima dell'analisi patologica21.

Risultati

Il trasferimento dei campioni su un terreno di coltura e il conteggio delle colonie dopo l'incubazione notturna sono comunemente usati per valutare la carica patogena locale vicino alla lesione22,23. Nel nostro studio, la coltura microbica di campioni di fegato, rene e milza è risultata negativa, indicando che il modello in questo studio ha portato solo a un'infezione locale invece che a un'infezione sistemica nei topi23.

Le immagini SEM degli impianti sono mostrate nella Figura 2. Nessun C. albicans ha aderito o colonizzato sulla superficie del filo in lega di nichel-titanio nel gruppo implantare grezzo. Tuttavia, è stato osservato un biofilm maturo e spesso sulla superficie del filo di lega di nichel-titanio nel gruppo PJI, indicando il successo della costruzione del modello PJI correlato al biofilm di C. albicans nei topi 14 giorni dopo l'intervento chirurgico23.

La colorazione H&E dei tessuti femorali è mostrata nella Figura 3. Nel gruppo di controllo è stata osservata una struttura trabecolare ossea chiara e completa, mentre nel gruppo implantare blank sono stati osservati alcuni difetti del tessuto trabecolare osseo nei tessuti femorali (Figura 3, frecce gialle). Nel gruppo PJI, il numero di trabecole ossee è diminuito significativamente di23. Questi risultati indicano che il modello PJI associato al biofilm di C. albicans nei topi è stato stabilito con successo con una significativa lesione patologica del tessuto femorale.

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Figura 1: Procedura di impianto. Il quadrato rosso nel pannello di sinistra mostra il sito chirurgico in cui è inserito il filo liscio in lega di nichel-titanio. Il pannello a destra mostra una porzione di femore (cerchio rosso) con il filo di nichel. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Immagini SEM della superficie dell'impianto nei gruppi blank e PJI. Gli ingrandimenti 1000x (barra della scala = 500 μm) e 5000x (barra della scala = 100 μm) sono mostrati come immagini rappresentative. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Mo et al.23. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Colorazione H&E del tessuto femorale. Nella figura sono mostrate immagini H&E rappresentative dell'impianto, del modello PJI e dei gruppi di controllo. Il gruppo di controllo mostra una struttura trabecolare ossea chiara e completa. Il gruppo implantare in bianco mostrava alcuni difetti del tessuto trabecolare osseo nei tessuti femorali (frecce gialle). Tuttavia, il numero di trabecole ossee è diminuito nel gruppo PJI. Gli ingrandimenti mostrati sono 200x (barra graduata = 150 μm) e 400x (barra scala = 75 μm). Questa cifra è stata modificata con il permesso di Mo et al.23. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

L'infezione causata dalla contaminazione degli strumenti chirurgici o dell'ambiente chirurgico durante l'intervento chirurgico è la causa principale della maggior parte delle infezioni implantari 24,25,26,27. Pertanto, in questo studio è stato costruito un modello di PJI correlato al biofilm di C. albicans del topo. Rispetto al modello PJI tradizionale in cui sono state utilizzate particelle sterili di acciaio inossidabile sospese in soluzione salina come impianto, in questo studio è stato utilizzato un filo in lega di nichel-titanio, un materiale implantare comunemente usato, per simulare il contatto tra C. albicans, materiali implantari e osso, che è più simile alla situazione nelle cliniche.

Il modello PJI descritto in questo articolo può simulare perfettamente l'ambiente fisiologico della PJI nelle cliniche. Questo modello può essere utilizzato solo per studiare l'infezione durante l'impianto invece di una successiva infezione trasmissibile per via ematica.

C. albicans può essere inoculato in due modi. Uno è l'inoculazione diretta di C. albicans nel sito dell'impianto durante l'intervento chirurgico28 e l'altro è la coltura degli impianti con C. albicans per un periodo di tempo in modo che si formino biofilm maturi sulla superficie dell'impianto prima dell'impianto chirurgico29. Il primo metodo è stato scelto in questo studio per il suo accurato numero di inoculazione di agenti patogeni, che ha portato a differenze minime tra i gruppi e a una valutazione più obiettiva dei trattamenti successivi. Inoltre, il primo metodo è più coerente con la situazione clinica.

In questo protocollo, l'inserimento dell'impianto è difficile da eseguire. L'operatore deve esercitarsi più volte per assicurarsi che l'impianto venga inserito nell'articolazione invece che per via sottocutanea o intramuscolare. Inoltre, il numero di inoculazione di C. albicans è vitale per la ripetibilità del modello PJI. C. albicans deve essere accuratamente miscelato tramite vortice per garantire l'accuratezza del numero di inoculazione. Inoltre, il C. albicans deve essere aggiunto lungo il filo di lega per simulare la via di infezione nella situazione clinica.

I biofilm sono stati rilevati 7 giorni dopo l'infezione batterica, dopodiché i biofilm sono gradualmente aumentati e hanno raggiunto un plateau il 14° giorno30. Pertanto, il successo del modello PJI stabilito è stato ispezionato il 14° giorno. La colonizzazione di C. albicans e la formazione di biofilm sulla superficie dell'impianto sono state ispezionate dal SEM. Le lesioni tissutali intorno all'impianto causate da infezione locale sono state valutate mediante analisi patologica dopo colorazione H&E. Gli studi hanno dimostrato che l'osteolisi periprotesica è una caratteristica importante a causa della PJI31. Pertanto, questi indicatori sono anche vitali nella valutazione dei metodi terapeutici per la prevenzione e il trattamento della PJI32.

La coltura microbica è comunemente usata per rilevare l'infezione microbica nelle cliniche e nei laboratori. Pertanto, in questo studio, è stata eseguita la coltura microbica dell'impianto, dei tessuti intorno agli impianti, del fegato e di altri organi vitali. Per l'impianto, sono stati applicati gli ultrasuoni per rimuovere il C. albicans aderente alla superficie del filo in lega di titanio-nichel. Successivamente, i C. albicans sono stati arricchiti mediante centrifugazione prima della coltura microbica. Tuttavia, è stato riscontrato un risultato negativo, incoerente con il risultato SEM (Figura 2). Il risultato del SEM ha mostrato che C. albicans ha aderito alla superficie del filo di lega titanio-nichel. Pertanto, il risultato della coltura microbica è stato un falso negativo, che può essere attribuito alla stretta adesione di C. albicans al filo di lega titanio-nichel; Gli ultrasuoni non sono riusciti a esfoliare con successo il C. albicans dall'impianto. Allo stesso modo, anche la coltura microbica dei tessuti intorno agli impianti e agli organi vitali è risultata negativa. Ci sono due possibili ragioni: (1) Il numero di C. albicans inoculati in questo studio è stato di soli 2000 CFU, che potrebbe essere troppo piccolo per invadere il tessuto circostante e il sistema durante il periodo sperimentale; (2) La sensibilità del metodo per l'estrazione e la separazione degli agenti patogeni dai tessuti è bassa. Un rapporto pubblicato in precedenza suggerisce che la coltura microbica potrebbe facilmente mostrare risultati falsi negativi e trattamenti ritardati33. La colorazione di Grocott-Gomori può essere utilizzata per determinare la formazione di ife nell'osso e nell'articolazione32. Può anche essere utile aumentare la quantità di inoculo, prolungare la durata dell'esperimento o mantenere i topi in uno stato immunodepresso prima dell'intervento chirurgico32. Tuttavia, va notato che l'infezione di lunga durata può portare a un'infezione profonda o addirittura a un'infezione sistemica. Pertanto, il periodo sperimentale dovrebbe essere progettato in base allo scopo specifico.

In sintesi, questo studio ha creato un modello murino di successo di PJI associato al biofilm di C. albicans , che può essere di grande importanza per la ricerca sulla prevenzione e il trattamento della PIJ associata al biofilm di C. albicans .

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Ringraziamenti

Siamo grati per il sostegno finanziario della Natural Science Foundation della provincia dello Shaanxi (numero di sovvenzione 2021SF-118) e della National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzione 81973409, 82204631).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,5 Mactutrius turbidibrisShanghai Lujing Technology Co., Ltd5106063
4 gradi C frigoriferoElectrolux (China) Electric Co., LtdESE6539TA
AgarBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-023
Bilance analiticheShimadzuATX124
Autoclavi SterilizzatoreSANYOMLS-3750
CarbenicillinAmrescoC0885
Eclipse Ci Nikon microscopio ottico verticale NikonEclipse Ts2-FL
GlucosioMacklin 
Anello di inoculazioneThermo Scientific251586
IsofluranoRWD20210103
NaClXi'an Jingxi Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd20180108
ParaformaldeideBeyotime BiotechnologyP0099
PeptoneBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-001
Macchina per anestesia multicanale per piccoli animali RWD R550 RWDR550
SEMHitachiTM-1000
Incubatore di temperaturaShanghai Zhichu Instrument Co., LtdZQTY-50N
Generatore di acqua ultrapuraHeal ForceNW20VF
Macchina ad ultrasuoniDo-ChromDS10260D
Estratto di lievitoThermo Scientific  OssoidiLP0021B
D823520

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