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Articolo metodologico

Un modello di infezione da Candida albicans articolare periprotesica nel topo

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DOI:

10.3791/65263

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2 febbraio 2024

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1School of Pharmacy, Health Science Center, Xi’an Jiaotong University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases in Northeast China, Ministry of Education, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University

In questo articolo

Sommario

L'infezione dell'articolazione periprotesica (PJI) causata da agenti patogeni pericolosi è comune in ortopedia clinica. I modelli animali esistenti non sono in grado di simulare accuratamente la situazione reale della PJI. Qui, abbiamo stabilito un modello murino di PJI associato al biofilm di Candida albicans per la ricerca e lo sviluppo di nuove terapie per la PJI.

Abstract

L'infezione dell'articolazione periprotesica (PJI) è una delle infezioni più comuni causate dalla Candida albicans (C. albicans), che preoccupa sempre più chirurghi e scienziati. Generalmente, nel sito di infezione si formano biofilm in grado di proteggere C. albicans dagli antibiotici e dalla clearance immunitaria. L'intervento chirurgico che comporta la rimozione dell'impianto infetto, lo sbrigliamento, il trattamento antimicrobico e il reimpianto è il gold standard per il trattamento della PJI. Pertanto, la creazione di modelli animali di PJI è di grande importanza per la ricerca e lo sviluppo di nuovi farmaci o terapie per la PJI. In questo studio, un filo liscio in lega di nichel-titanio, un impianto ampiamente utilizzato nelle cliniche ortopediche, è stato inserito nell'articolazione femorale di un topo C57BL/6 prima che i C. albicans venissero inoculati nella cavità articolare lungo il filo. Dopo 14 giorni, sono stati osservati biofilm maturi e spessi sulla superficie degli impianti sotto un microscopio elettronico a scansione (SEM). Una trabecola ossea significativamente ridotta è stata riscontrata nella colorazione H&E dei campioni articolari infetti. Per riassumere, è stato stabilito un modello PJI murino con i vantaggi di facilità d'uso, alto tasso di successo, alta ripetibilità e alta correlazione clinica. Si prevede che questo sarà un modello importante per gli studi clinici sulla prevenzione della PJI correlata al biofilm di C. albicans.

Introduzione

La Candida albicans (C. albicans) risiede commensamente in molte parti del corpo umano1, ed è anche il patogeno opportunista più comune che causa infezioni fungine invasive potenzialmente letali, specialmente nei pazienti immunocompromessi 2,3. C. albicans può trasformarsi tra lo stato di lievito e quello di micelio come fungo polimorfo. Lo stato del micelio mostra una maggiore virulenza, una maggiore adesione e l'invasione di cellule e tessuti 4,5. Inoltre, C. albicans può formare biofilm sulle superfici di materiali biomedici come protesi dentarie, cateteri e stent 1,6,7. La densa struttura tridimensionale dei biofilm limita l'infiltrazione di farmaci antimicotici, esprime geni resistenti ai farmaci e sottoregola il metabolismo delle cellule fungine per resistere alla clearance del sistema immunitario 6,7. Pertanto, le infezioni correlate ai biofilm sono piuttosto impegnative nelle cliniche8.

Lo Staphylococcus aureus, lo stafilococco coagulasi-negativo e l'enterobacter sono i principali agenti patogeni che causano la PJI9. Sebbene l'incidenza della PJI fungina sia relativamente bassa (circa l'1%)10, il costo del trattamento della PJI fungina è più alto11, il ciclo di trattamento è più lungo11 e il tasso di successo del trattamento è inferiorea 10 rispetto alla PJI batterica. Negli ultimi anni, l'incidenza della PJI fungina è aumentata di annoin anno. La Candida PJI rappresenta il 77%-84% della PJI fungina10,12 e la C. albicans è la più comune nella Candida (54%). Pertanto, la PJI fungina deve essere studiata.

Attualmente, la PJI viene trattata tramite chirurgia di revisione (1) rimuovendo l'impianto infetto, (2) sbrigliando, (3) trattando con antimicrobici e (4) reimpiantando. Dopo un accurato sbrigliamento, viene posizionato un antibiotico contenente cemento osseo e il paziente viene trattato con antibiotici per via sistemica per più di 6 settimane per controllare efficacemente l'infezione prima che venga posizionato un nuovo impianto13. Tuttavia, questo metodo non è in grado di eliminare completamente gli agenti patogeni nei tessuti e le infezioni ricorrenti trattate con terapia antimicrobica a lungo termine hanno un'alta probabilità di svilupparsi in ceppi resistenti ai farmaci 14,15,16.

La creazione di modelli animali di PJI è importante per la ricerca e lo sviluppo di nuovi farmaci o terapie per la PJI. Nello sviluppo della PJI, si formano ampi spazi morti intorno alla protesi, portando alla formazione di ematomi, che bloccano ulteriormente l'afflusso di sangue ai tessuti circostanti e compromettono l'effetto degli antibiotici 11,15. A causa della difficoltà nell'imitare l'ambiente circostante della protesi, i modelli animali tradizionali non possono simulare accuratamente la situazione reale di PJI17,18.

In questo articolo, un modello PJI associato al biofilm di C. albicans nei topi è stato costruito utilizzando un filo di titanio-nichel clinicamente ampiamente utilizzato per simulare impianti articolari19,20. Questo modello PJI presenta i vantaggi di un funzionamento semplice, di un alto tasso di successo, di un'elevata ripetibilità e di un'elevata correlazione clinica. Si prevede che sarà un modello importante per lo studio della prevenzione e del trattamento della PJI correlata al biofilm di C. albicans.

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Protocollo

Gli animali sono stati acquistati dall'Università di Xi'an Jiaotong. Tutte le procedure di sperimentazione animale sono state approvate dall'Institutional Animal Ethical Committee dell'Università di Xi'an Jiaotong (numero di approvazione: SCXK [Shaanxi] 2021-103). I topi sono stati tenuti per una settimana con 5 topi per gabbia. A loro è stato permesso il libero accesso al cibo e all'acqua. Gli animali sono stati mantenuti a temperatura ambiente (RT; 24 °C ± 1 °C) e ciclo luce/buio (12 h/12 h) prima dell'esecuzione dello studio.

1. Preparazione del tampone e dell'attrezzatura

  1. Coltura cellulare di C. albicans
    1. Inoculare una colonia monoclonale di C. albicans (SC5314) da un terreno di base di peptone destrosio (YPD) estratto di lievito con un'ansa di inoculazione in 5 mL di terreno liquido YPD (YPD + 50 μg/mL di carbenicillina).
    2. Agitare successivamente le cellule di C. albicans ad una velocità di 220 giri/min a 30 °C per una notte.
    3. Centrifugare la sospensione a 400 x g per 5 minuti a RT. Risospendere le cellule di C. albicans in soluzione fisiologica normale e diluire la concentrazione di cellule a 1 x 106 cellule/mL regolando visivamente la torbidità in modo che sia uguale a quella di un McFarland 0,5.
  2. Preparazione di soluzione fisiologica normale
    1. Pesare 0,9 g di cloruro di sodio e sciogliere in 100 mL di acqua deionizzata per preparare soluzione fisiologica normale allo 0,9%.
  3. Preparazione degli strumenti chirurgici
    1. Autoclavare (121 °C, 30 min) gli strumenti chirurgici (forbici, pinze, pinze emostatiche, portaaghi, aghi da sutura) e il filo in lega di titanio-nichel (circa 0,5 mm di diametro) prima dell'uso.

2. Istituzione del modello PJI del topo

  1. Dividere in modo casuale 30 topi C57BL/6 (maschi, 15-20 g) in 3 gruppi (10 topi/gruppo), vale a dire, gruppo di controllo, gruppo implantare in bianco (impianto di filo di titanio-nichel senza infezione da C. albicans ) e gruppo PJI (impianto di filo di titanio-nichel con infezione da C. albicans ).
  2. Anestetizzare i topi con l'inalazione di isoflurano all'1-4% prima di rimuovere i peli sull'arto posteriore sinistro e disinfettarli con iodio. La perdita del riflesso di raddrizzamento e l'assenza di risposta alla stimolazione delle dita dei piedi confermano la profondità dell'anestesia. Durante l'anestesia, applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza corneale e per reintegrare il calore durante l'intervento chirurgico e il recupero.
  3. Per i topi del gruppo di controllo, non fornire alcun trattamento. Fornisci loro libero accesso all'acqua e al cibo.
  4. Per i topi del gruppo implantare bianco e del gruppo PJI, praticare un'incisione longitudinale di 5 mm sul ginocchio di ciascun arto posteriore sinistro con una lama #10 o un rasoio sterile per esporre le articolazioni.
  5. Praticare un foro di 5 mm di lunghezza nel canale intramidollare femorale inserendo un ago per siringa sterile (26 G).
  6. Inserire un filo liscio in lega di nichel-titanio (0.5 mm di diametro, 5 mm di lunghezza) nel foro prima di tagliarlo con le forbici (Figura 1).
  7. Per i topi nel gruppo implantare in bianco, aggiungere 2 μL di terreno YPD lungo il filo in lega di nichel-titanio goccia a goccia prima di chiudere la ferita strato per strato utilizzando una sutura di nylon (0,15 mm di diametro).
  8. Per i topi del gruppo PJI, inoculare 2 μL di cellule di C. albicans (1 × 106 cellule/mL) nello spazio articolare dei topi lungo il filo della lega di nichel-titanio goccia a goccia prima di chiudere la ferita strato per strato utilizzando una sutura di nylon.
  9. Ospita i topi con libero accesso all'acqua e al cibo per 14 giorni. Somministrare meloxicam per iniezione sottocutanea (4 mg/kg) ogni 24 ore per un massimo di 3 giorni.
  10. Dopo 14 giorni, anestetizzare i topi con isoflurano al 3% prima di sopprimere i topi mediante lussazione cervicale.

3. Valutazione del modello PJI

  1. Valutazione delle infezioni nei principali organi
    1. Raccogli i reni, il fegato e la milza dai topi dopo l'eutanasia.
    2. Aggiungere 500 μL di soluzione fisiologica normale sterile in ciascun organo e macinare i tessuti su un omogeneizzatore a 4 °C.
    3. Aggiungere 100 μL dell'omogenato preparato nella fase 3.1.2 su una piastra YPD prima di distribuirlo uniformemente con un'asta piegata.
    4. Posizionare le piastre YPD capovolte in un incubatore a 37 °C per 48 ore.
    5. Osserva e conta visivamente il numero di colonie.
  2. Osservazione di C. albicans e biofilm sugli impianti
    1. Tagliare con cura la pelle sopra l'articolazione dei topi con le forbici prima di raccogliere l'impianto con una pinzetta.
    2. Tenere gli impianti immersi in una soluzione di glutaraldeide al 2,5% per il fissaggio a 4 °C per 48 ore.
    3. Sciacquare gli impianti con PBS sterile tre volte prima di immergerli in una soluzione di acido osmio all'1% per 3 ore.
    4. Sciacquare gli impianti con PBS sterile tre volte prima di immergerli in soluzioni di etanolo al 50%, 70%, 80%, 90% e 100% per 15 minuti per la disidratazione.
    5. Tenere gli impianti immersi nel terz-butanolo per 30 minuti tre volte prima di liofilizzare gli impianti.
    6. Fissare i campioni dell'impianto allo stadio del campione, rivestire l'impianto con oro (rivestimento da 10 nm) e osservarlo al microscopio elettronico a scansione (SEM) sotto vuoto elevato e 1,5 kV.
  3. Analisi patologica dei tessuti femorali
    1. Raccogli i tessuti femorali con le forbici dopo l'eutanasia dei topi.
    2. Immergere i tessuti femorali in una soluzione di paraformaldeide al 4% per il fissaggio a 4 °C per 48 ore.
    3. Mettere i tessuti del femore in formalina al 10% per 1 settimana.
    4. Disidratare i tessuti del femore immergendoli in soluzioni di etanolo al 50%, 70%, 80%, 90% e 100% rispettivamente per 15 minuti.
    5. Incorporare i tessuti disidratati del femore in paraffina prima di sezionare i tessuti in campioni da 4 μm utilizzando un microtomo.
    6. Colorare le sezioni del femore con ematossilina ed eosina seguendo un protocollo standard prima dell'analisi patologica21.

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Risultati

Il trasferimento dei campioni su un terreno di coltura e il conteggio delle colonie dopo l'incubazione notturna sono comunemente usati per valutare la carica patogena locale vicino alla lesione22,23. Nel nostro studio, la coltura microbica di campioni di fegato, rene e milza è risultata negativa, indicando che il modello in questo studio ha portato solo a un'infezione locale invece che a un'infezione sistemica nei topi23.

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Discussione

L'infezione causata dalla contaminazione degli strumenti chirurgici o dell'ambiente chirurgico durante l'intervento chirurgico è la causa principale della maggior parte delle infezioni implantari 24,25,26,27. Pertanto, in questo studio è stato costruito un modello di PJI correlato al biofilm di C. albicans del topo. Rispetto al modello PJI tradizionale in cui sono state utilizzate part...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Ringraziamenti

Siamo grati per il sostegno finanziario della Natural Science Foundation della provincia dello Shaanxi (numero di sovvenzione 2021SF-118) e della National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzione 81973409, 82204631).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,5 Mactutrius turbidibrisShanghai Lujing Technology Co., Ltd5106063
4 gradi C frigoriferoElectrolux (China) Electric Co., LtdESE6539TA
AgarBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-023
Bilance analiticheShimadzuATX124
Autoclavi SterilizzatoreSANYOMLS-3750
CarbenicillinAmrescoC0885
Eclipse Ci Nikon microscopio ottico verticale NikonEclipse Ts2-FL
GlucosioMacklin 
Anello di inoculazioneThermo Scientific251586
IsofluranoRWD20210103
NaClXi'an Jingxi Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd20180108
ParaformaldeideBeyotime BiotechnologyP0099
PeptoneBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-001
Macchina per anestesia multicanale per piccoli animali RWD R550 RWDR550
SEMHitachiTM-1000
Incubatore di temperaturaShanghai Zhichu Instrument Co., LtdZQTY-50N
Generatore di acqua ultrapuraHeal ForceNW20VF
Macchina ad ultrasuoniDo-ChromDS10260D
Estratto di lievitoThermo Scientific  OssoidiLP0021B
D823520

Riferimenti

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