Method Article

Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale

DOI:

10.3791/65265

⸱

May 19th, 2023

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1Division for Health Service Promotion, The University of Tokyo, 2Department of Diabetes and Metabolic Diseases, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3The University of Tokyo Excellent Young Researcher Program, The University of Tokyo

In This Article

Summary

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Questo protocollo descrive l'isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino per ottenere preadipociti e ottenere la differenziazione degli adipociti in vitro. L'uso di un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi riduce la variazione sperimentale e aumenta la riproducibilità.

Abstract

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Lo studio in vitro della differenziazione degli adipociti bianchi, marroni e beige consente lo studio delle funzioni autonome cellulari degli adipociti e dei loro meccanismi. Le linee cellulari di preadipociti bianchi immortalizzati sono pubblicamente disponibili e ampiamente utilizzate. Tuttavia, l'emergere di adipociti beige nel tessuto adiposo bianco in risposta a segnali esterni è difficile da ricapitolare nella misura completa utilizzando linee cellulari di adipociti bianchi disponibili al pubblico. L'isolamento della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino viene comunemente eseguito per ottenere preadipociti primari ed eseguire la differenziazione degli adipociti. Tuttavia, la tritatura e la digestione della collagenasi del tessuto adiposo a mano possono provocare variazioni sperimentali ed è soggetta a contaminazione. Qui, presentiamo un protocollo semi-automatico modificato che utilizza un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi per ottenere un più facile isolamento della SVF, con l'obiettivo di ridurre la variazione sperimentale, ridurre la contaminazione e aumentare la riproducibilità. I adipociti ottenuti e gli adipociti differenziati possono essere utilizzati per analisi funzionali e meccanicistiche.

Introduction

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La biologia del tessuto adiposo ha attirato un'attenzione sempre maggiore a causa della crescente prevalenza dell'obesità e del diabete di tipo 2 a livello globale1. Gli adipociti immagazzinano l'energia in eccesso sotto forma di goccioline lipidiche, che vengono rilasciate per fame. Inoltre, il tessuto adiposo mantiene l'omeostasi energetica sistemica fungendo da organo endocrino e comunicando con altri tessuti 2,3. Curiosamente, sia l'eccesso di tessuto adiposo (obesità) che la perdita adiposa (lipodistrofia) sono legati all'insulino-resistenza e al diabete1. G....

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Protocol

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Tutti gli esperimenti sugli animali descritti in questo protocollo sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Tokyo ed eseguiti secondo le linee guida istituzionali dell'Università di Tokyo.

1. Preparazione della soluzione enzimatica e del mezzo

  1. Mettere entrambi i lati del tessuto adiposo bianco inguinale (lato destro e sinistro, circa 150 mg) da un topo di 7-8 settimane e 2,5 ml di soluzione enzimatica nel tubo C del dissociatore.
  2. Ricostituire l'enzima D con 3 ml di terreno di aquila modificato (DMEM)/F12 di Dulbecco senza siero fetale bovino (FBS) o....

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Results

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Questo protocollo produce adipociti completamente differenziati e carichi di lipidi 7 giorni dopo aver indotto la differenziazione degli adipociti. Il grado di differenziazione degli adipociti può essere valutato mediante la colorazione rosso olio di trigliceridi e lipidi (Figura 1A), o l'analisi dell'espressione dell'mRNA utilizzando qPCR-RT di geni adipocitari, come il regolatore principale dell'adipogenesi Pparg e il suo target Fabp4 (Figura 1B).

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Discussion

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Qui, abbiamo descritto un protocollo per l'isolamento della SVF dal tessuto adiposo murino per ottenere preadipociti ed eseguire la differenziazione degli adipociti in vitro. L'uso di un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi ha ridotto la variazione sperimentale, diminuito il rischio di contaminazione e aumentato la riproducibilità. Sebbene questa procedura sia un passaggio critico all'interno del protocollo presentato, il processo è altamente automatizzato e non è necessaria l'ottimizzazion.......

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Disclosures

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Nessuno degli autori ha un interesse finanziario concorrente relativo a questo lavoro.

Acknowledgements

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Gli autori desiderano ringraziare Takahito Wada e Saiko Yoshida (The University of Tokyo, Tokyo, Giappone) per la loro assistenza sperimentale. Questo lavoro è stato finanziato dalle seguenti sovvenzioni a Y.H.: borsa di ricerca dell'Università di Tokyo Excellent Young Researcher Program; Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, numero di sovvenzione 19K17976; sovvenzione per il Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) della Japan Foundation for Applied Enzymology, numero di sovvenzione 17F005; borsa di studio della Fondazione per la Ricerca Farmacologica; sovvenzione della Mochida Memorial Foundation f....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Piastra da 100 mmCorning430167
Piastra a 12 pozzettiCorning3513
Piastra da 60 mmIWAKI3010-060
Kit di dissociazione del tessuto adiposo, topo e rattoMiltenyi Biotec130-105-808contenuto: Enzima D, Enzima R, Enzima A e tampone A
Filtro cellulare 70 &; mBD falcon#352350
Piastre rivestite di collagene, 100 mmBD#356450
Piastre rivestite di collagene, 60 mmBD#354401
Collagene I Coat Micropiastra a 6 pozzettiIWAKI4810-010
DesametasoneWako041-18861
Pinze da dissezioneN/AN/Aautoclave prima dell'uso
Forbici da dissezione, smussate/affilateN/AN/Aautoclave prima dell'uso
Forbici da dissezione, affilate/affilateN/AN/Aautoclave prima dell'uso
DMEM/F-12, integratore GlutaMAXGibco10565-042
Siero fetale bovino (FBS)N/AN/A
gentleMACS C TubesMilteny Biotec130-093-237
delicatoMACSOcto dissociatore con riscaldatoriMiltenyi Biotec130-096-427
Humulin R Iniezione U-100Eli Lilly872492
IndometacinaSigmaI7378-5G
Isobutilmetilxantina (IBMX)Sigma17018-1G
Lipofectamina 2000Life Technologies11668-019
Neomicina SolfatoFujifilm146-08871 
Opti-MEMInvitrogen 31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40)Add gene#1780
PBS compresseTakaraT900
Platinum-E (Plat-E) Retrovirale Packaging Lineacell biolabRV-101
PolybreneNacalai Tesque12996-81
Power Sybr Green Master MixApplied Biosystems4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master MixTOYOBO#FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250)QIAGEN74106
RosiglitazoneWako180-02653
T3SigmaT2877-100mg
Tripsina-EDTA (0,05%)Gibco25200-056
cellulare

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  2. Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science.

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Stromal Vascular FractionAdipocyte DifferentiationTissue DissociatorCollagenase DigestionWhite Adipose TissueBrown AdipocytesBeige AdipocytesCell CultureOil Red O StainingmRNA Expression Analysis

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