Articolo metodologico

Sviluppo di un sistema di dosaggio per l'alimentazione per la valutazione dell'effetto insetticida di sostanze fitochimiche su Helicoverpa armigera

DOI:

10.3791/65278

⸱

26 maggio 2023

 ,  ,  , 
1Biochemical Sciences Division, CSIR-National Chemical Laboratory, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive il saggio di alimentazione obbligata per valutare l'effetto potenzialmente tossico di un fitochimico sulle larve di insetti lepidotteri. Si tratta di un test biologico per insetti altamente scalabile, facile da ottimizzare la dose subletale e letale, l'attività deterrente e l'effetto fisiologico. Questo potrebbe essere utilizzato per lo screening di insetticidi ecologici.

Abstract

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L'Helicoverpa armigera, un insetto lepidottero, è un parassita polifago con una distribuzione mondiale. Questo insetto erbivoro è una minaccia per le piante e la produttività agricola. In risposta, le piante producono diverse sostanze fitochimiche che hanno un impatto negativo sulla crescita e sulla sopravvivenza dell'insetto. Questo protocollo dimostra un metodo di dosaggio obbligatorio per valutare l'effetto di un fitochimico (quercetina) sulla crescita, lo sviluppo e la sopravvivenza degli insetti. In condizioni controllate, i neonati sono stati mantenuti fino al secondo stadio con una dieta artificiale predefinita. A queste larve di secondo stadio è stato permesso di nutrirsi con una dieta artificiale di controllo e contenente quercetina per 10 giorni. Il peso corporeo degli insetti, lo stadio di sviluppo, il peso del frass e la mortalità sono stati registrati a giorni alterni. La variazione del peso corporeo, la differenza nel modello di alimentazione e i fenotipi di sviluppo sono stati valutati per tutto il tempo del test. Il test di alimentazione obbligatoria descritto simula una modalità naturale di ingestione e può essere scalato fino a un gran numero di insetti. Permette di analizzare l'effetto delle sostanze fitochimiche sulle dinamiche di crescita, sulla transizione evolutiva e sulla fitness generale di H. armigera. Inoltre, questa configurazione può essere utilizzata anche per valutare le alterazioni dei parametri nutrizionali e dei processi fisiologici digestivi. Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per l'alimentazione dei sistemi di analisi, che può avere applicazioni negli studi tossicologici, nello screening delle molecole insetticide e nella comprensione degli effetti chimici nelle interazioni pianta-insetto.

Introduzione

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I fattori biotici che influenzano la produttività delle colture sono principalmente agenti patogeni e parassiti. Diversi insetti nocivi causano dal 15% al 35% delle perdite di raccolto agricolo e incidono sulle pratiche di sostenibilità economica1. Gli insetti appartenenti agli ordini Coleotteri, Emitteri e Lepidotteri sono i principali ordini di parassiti devastanti. La natura altamente adattativa dell'ambiente ha favorito i lepidotteri nell'evoluzione di diversi meccanismi di sopravvivenza. Tra gli insetti lepidotteri, l'Helicoverpa armigera può nutrirsi di circa 180 colture diverse e causare danni significativi ai loro tessuti riproduttivi2. In tutto il mondo, l'infestazione da H. armigera ha provocato una perdita di circa 5 miliardi di dollari. Cotone, ceci, piselli piccione, pomodori, girasoli e altre colture ospitano H. armigera. Completa il suo ciclo di vita su diverse parti delle piante ospiti. Le uova deposte dalle falene femmine si schiudono sulle foglie, seguite dalla loro alimentazione dei tessuti vegetativi durante gli stadi larvali. Lo stadio larvale è il più distruttivo a causa della sua natura vorace e altamente adattabile 4,5. H. armigera mostra una distribuzione globale e l'invasione di nuovi territori grazie alle sue notevoli caratteristiche, come la polifagia, le eccellenti capacità migratorie, la maggiore fecondità, la forte diapausa e l'emergere di resistenza alle strategie di controllo degli insetti esistenti6.

Diverse molecole chimiche da terpeni, flavonoidi, alcaloidi, polifenoli, glucosidi cianogenici e molti altri sono ampiamente utilizzate per il controllo dell'infestazione da H. armigera 7. Tuttavia, l'applicazione frequente di molecole chimiche ha effetti negativi sull'ambiente e sulla salute umana a causa dell'acquisizione dei loro residui. Inoltre, mostrano un effetto dannoso su vari predatori di parassiti, con conseguente squilibrio ecologico 8,9. Pertanto, è necessario studiare opzioni sicure ed ecologiche per le molecole chimiche di controllo dei parassiti.

Le molecole insetticide naturali prodotte dalle piante (sostanze fitochimiche) possono essere utilizzate come una promettente alternativa ai pesticidi chimici. Queste sostanze fitochimiche includono vari metaboliti secondari appartenenti alle classi alcaloidi, terpenoidi e fenolici 7,10. La quercetina è uno dei flavonoidi (composti fenolici) più abbondanti presenti in vari cereali, verdure, frutta e foglie. Mostra attività alimentare deterrente e insetticida contro gli insetti; Inoltre, non è dannoso per i nemici naturali dei parassiti11,12. Pertanto, questo protocollo dimostra il test di alimentazione utilizzando la quercetina per valutare il suo effetto tossico su H. armigera.

Sono stati sviluppati vari metodi di analisi biologica per valutare l'effetto di molecole naturali e sintetiche sull'alimentazione, la crescita, lo sviluppo e i modelli comportamentali di un insetto13. I metodi comunemente usati includono il saggio del disco fogliare, il saggio di alimentazione a scelta, il saggio di alimentazione a gocce, il saggio di contatto, il saggio di copertura della dieta e il saggio di alimentazione obbligata13,14. Questi metodi sono classificati in base a come i pesticidi vengono applicati agli insetti. Il test di alimentazione obbligata è uno dei metodi più comunemente usati, sensibili, semplici e adattabili per testare i probabili insetticidi e la loro dose letale14. In un saggio di alimentazione obbligata, la molecola di interesse viene miscelata con una dieta artificiale. Ciò fornisce coerenza e controllo sulla composizione della dieta, generando risultati robusti e riproducibili. Variabili importanti che influenzano i saggi di alimentazione sono lo stadio di sviluppo dell'insetto, la scelta dell'insetticida, i fattori ambientali e la dimensione del campione. Anche la durata del test, l'intervallo tra due registrazioni di dati, la frequenza e la quantità di alimentazione dietetica, la salute degli insetti e l'abilità di manipolazione degli operatori possono influenzare l'esito dei test di alimentazione14,15.

Questo studio mira a dimostrare il test di alimentazione obbligata per valutare l'effetto della quercetina sulla sopravvivenza e sulla fitness di H. armigera . La valutazione di vari parametri, come il peso corporeo dell'insetto, il tasso di mortalità e i difetti dello sviluppo, fornirà approfondimenti sugli effetti insetticidi della quercetina. Nel frattempo, la misurazione dei parametri nutrizionali, tra cui l'efficienza della conversione degli alimenti ingeriti (ECI), l'efficienza della conversione degli alimenti digeriti (ECD) e la digeribilità approssimativa (AD), evidenzierà gli attributi antifeedant della quercetina.

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Protocollo

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Le larve di H. armigera sono state acquistate dall'ICAR-National Bureau of Agricultural Insect Resources (NBAIR), Bangalore, India. Per il presente studio sono state utilizzate un totale di 21 larve di secondo stadio.

1. Preparazione di una dieta artificiale a base di ceci

NOTA: Un elenco di ingredienti necessari per la preparazione di una dieta artificiale è menzionato nella Tabella 1.

  1. Pesare tutte le frazioni separatamente in un becher, come elencato nella Tabella 1, e preparare una miscela omogenea utilizzando una spatola/agitatore magnetico.
  2. Far bollire la frazione C a circa 100 °C nel microonde per 5 minuti, aggiungerla alla frazione A e mescolare accuratamente.
  3. Dopo aver mescolato accuratamente, lasciare raffreddare un po' la frazione miscelata prima di aggiungere la frazione B (la frazione B contiene componenti termolabili).
  4. Versare in una capsula di Petri trasparente di polistirolo di 150 mm x 150 mm.

2. Preparazione di una dieta artificiale contenente quercetina

  1. Pesare la quantità appropriata (1.000 ppm) di quercetina idrato (vedi Tabella dei materiali) e scioglierla correttamente nel volume minimo di solventi organici, come etanolo (2 mg/mL), dimetilsolfossido (DMSO; 30 mg/mL) o dimetilformammide (DMF). Qui, il DMSO viene utilizzato per sciogliere la quercetina.
  2. Aggiungere la quercetina disciolta nella frazione B, seguita dall'aggiunta nella miscela delle frazioni A e C (il volume di acqua ridotto dalla frazione B è uguale al volume di DMSO aggiunto).
  3. Aggiungere un volume uguale di solvente organico utilizzato per sciogliere la quercetina nella dieta di controllo.
    NOTA: La Figura 1 mostra la rappresentazione schematica della preparazione di diete artificiali e contenenti quercetina.

3. Allevamento e mantenimento della coltura di H. armigera

NOTA: Utilizzare materiali adeguatamente puliti e sterilizzati per l'allevamento e la manutenzione degli insetti. Maneggiare gli insetti con cura seguendo tutte le pratiche operative standard relative alla sterilità e alla sicurezza 16,17,18.

  1. Conservare le uova di H. armigera nella camera di riproduzione (barattolo di plastica coperto da un panno di mussola) mantenendo le condizioni descritte al punto 3.3. Quindi, trasferisci delicatamente i neonati appena emersi usando un pennello fine su una dieta artificiale a base di ceci appena preparata.
  2. Utilizzare una dieta artificiale per l'allevamento delle larve e una soluzione di saccarosio al 20% (p/v) con multivitaminico all'1% (p/v) (vedi tabella dei materiali) per le falene adulte19,20.
    NOTA: Poiché le larve di H . armigera mostrano una tendenza cannibale, è necessario allevare ciascuna larva in una fiala separata.
  3. Mantenere la temperatura a 25 ± 1 °C e l'umidità relativa al 70% nella stanza di coltura degli insetti, con un fotoperiodo di 16 h luce:8 h buio21.
  4. Allevare una generazione di insetti in laboratorio per l'omogeneità e poi usarla per l'analisi dell'alimentazione.
  5. Facoltativamente, aumentare la temperatura della stanza di coltura degli insetti a 28 °C per accelerare la crescita di larve e pupe22.

4. Impostazione per il saggio di alimentazione

  1. Raccogliere larve di 21 secondi per ogni serie (controllo e trattamento) e tenerle lontane dalla dieta, per circa 1-3 ore.
  2. Tagliare la dieta di controllo e contenente quercetina in piccoli pezzi, registrare il peso della dieta somministrata e il corpo dell'insetto e trasferire con cura gli insetti in fiale di coltura. Lascia che gli insetti si nutrano con la rispettiva dieta.
    NOTA: Questo deve essere considerato come il giorno 0 del test di alimentazione.
  3. Registrare il peso del corpo dell'insetto, la dieta somministrata, la dieta non consumata e il frass a giorni alterni (giorni 2, 4, 6, 8 e 10) fino al 10° giorno del test.
  4. Dopo il 10° giorno, mantienili nutriti con la rispettiva dieta per osservare ulteriori cambiamenti evolutivi e morfologici.
    NOTA: Lo sviluppo cambia attraverso: (1) intermedi larvali-pupali, come la metà posteriore del corpo delle pupe con chiazze larvali della cuticola, una capsula cranica e zampe toraciche; (2) prepupe con corpo completamente annerito; (3) pupe sottodimensionate con restringimento del corpo; (4) pupa-falena intermedie-falene con la vecchia pelle pupale. I cambiamenti morfologici includono adulti di falena malformati con corpi anormali, ali contorte e zampe articolate. Questi cambiamenti vengono poi confrontati con gli insetti nutriti con la dieta di controllo.
  5. Congelare gli insetti il giorno 10 se non è richiesto lo studio dei difetti di sviluppo e morfologici.
    NOTA: Prima di congelare le larve, è necessario tenerle private della dieta per almeno 3 ore per rimuovere la dieta residua dal tratto digestivo.

5. Registrazione e analisi dei dati

  1. Nel software GraphPad Prism (vedi Tabella dei materiali), scegli una tabella di dati XY dalla finestra di dialogo "Benvenuto o Nuova tabella" e inserisci il numero di insetti che replicano i valori fianco a fianco nelle sottocolonne. Quindi, dare il nome del titolo all'asse X come numero di giorni e, nei gruppi A e B, dare il nome del titolo rispettivamente come trattamento di controllo e quercetina. Tenere sotto controllo il peso corporeo di ogni insetto e trattarlo per generare il grafico del peso corporeo.
    NOTA: L'analisi in GraphPad può variare in base alle dimensioni del campione e al numero di trattamenti.
  2. Confrontare il peso corporeo dell'insetto tra il gruppo di controllo e quello di trattamento utilizzando un test t di Student (α = 0,05).
  3. Conta le larve e le pupe vive e morte il giorno 10 per tracciare una curva di Kaplan-Meier per la percentuale di sopravvivenza utilizzando il software grafico.
  4. Conta il numero di pupe e calcola la percentuale di impupamento usando la formula data:
  5. Percentuale di impupamento (%) = (numero di pupe formate/numero totale di larve) x 100
  6. Confrontare lo sviluppo larvale in termini di indici nutrizionali23 utilizzando le seguenti formule, ECI (%) = (aumento di peso delle larve/peso del mangime consumato) x 100
    ECD (%) = (aumento di peso delle larve/[peso del mangime consumato - peso del frass]) x 100
    AD (%) = ([peso del mangime consumato - peso del frass]/peso del mangime consumato) x 100

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Risultati

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Le larve di insetti alimentate con una dieta contenente 1.000 ppm di quercetina hanno mostrato una significativa diminuzione del peso corporeo di ~57% rispetto al gruppo di controllo (Figura 2A). La riduzione del peso corporeo ha comportato una riduzione delle dimensioni corporee delle larve trattate con quercetina (Figura 2B). È stata osservata una notevole riduzione del tasso di alimentazione delle larve alimentate con quercetina rispetto al controllo (

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Discussione

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I saggi biologici di laboratorio sono utili per prevedere i risultati e produrre dati comparativi sulla tossicità di diversi composti in un breve periodo a un costo ragionevole. Il biosaggio di alimentazione aiuta a interpretare le interazioni tra insetticida e insetticida e insetticidi per piante e insetticidi. Si tratta di un metodo efficace per misurare la tossicità di una varietà di sostanze che semplifica notevolmente il processo di determinazione della dose letale 50 (LD50), della concentrazione letale 5...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno dichiarato alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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SM, YP e VN riconoscono la borsa di studio assegnata dalla Commissione per le sovvenzioni universitarie, Governo dell'India, Nuova Delhi. RJ ringrazia il Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), India, e il CSIR-National Chemical Laboratory, Pune, India, per il sostegno finanziario ai sensi dei codici di progetto MLP036626, MLP101526 e YSA000826.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Agar AgarHimediaRM666Agente solidificante
Acido ascorbicoHimediaCMS1014Fonte di vitamina C
Bengal GramNANAFonte di proteine e carboidrati
CaseinaSigmaC-5890Fonte proteica
ColesteroloSisco Research Laboratories34811Fonte
Cloruro di colinaHimediaGRM6824sale di ammonio
DMSOSigma67-68-5Solvente
GraphPad Prism v8.0https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm
Metil ParabeneHimediaGRM1291Agente antimicotico
Capsula multivitaminicaGalaxoSmithKlineNAFonte vitaminica
QuercetinaSigmaQ4951-10GAcido sorbico fitochimico
HimediaM1880Agente antimicrocauzione
StreptomicinaHimediaCMS220Capsula di
vitamina ENukind HealthcareNAFonte di vitamina E
Estratto di lievitoHimediaRM027Fonte di aminoacidi
di acidi grassi antibiotica

Riferimenti

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