Qui, descriviamo in dettaglio il protocollo per quantificare la lunghezza dei telomeri utilizzando la rilevazione chemiluminescente non radioattiva, con particolare attenzione all'ottimizzazione di vari parametri prestazionali del kit di analisi della lunghezza dei telomeri TAGGG, come le quantità tampone e le concentrazioni della sonda.
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Articolo metodologico
Ottimizzazione dei parametri prestazionali del saggio di lunghezza dei telomeri TAGGG
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I telomeri sono sequenze ripetitive presenti alle estremità cromosomiche; Il loro accorciamento è una caratteristica delle cellule somatiche umane. L'accorciamento si verifica a causa di un problema con la replicazione finale e l'assenza dell'enzima telomerasi, che è responsabile del mantenimento della lunghezza dei telomeri. È interessante notare che i telomeri si accorciano anche in risposta a vari processi fisiologici interni, come lo stress ossidativo e l'infiammazione, che possono essere influenzati a causa di agenti extracellulari come inquinanti, agenti infettivi, nutrienti o radiazioni. Pertanto, la lunghezza dei telomeri funge da eccellente biomarcatore dell'invecchiamento e di vari parametri fisiologici di salute. Il kit di analisi della lunghezza dei telomeri TAGGG viene utilizzato per quantificare le lunghezze medie dei telomeri utilizzando il test TRF (telomere restriction fragment) ed è altamente riproducibile. Tuttavia, è un metodo costoso e, a causa di ciò, non viene utilizzato di routine per grandi numeri di campioni. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per una misurazione ottimizzata ed economica della lunghezza dei telomeri utilizzando Southern blots o analisi TRF e rilevamento basato sulla chemiluminescenza non radioattiva.
Introduzione
I telomeri sono le sequenze ripetitive di DNA presenti alla fine dei cromosomi. Hanno ripetizioni in tandem di TTAGGG e mantengono l'integrità del genoma proteggendo il cromosoma sia dallo sfilacciamento che dal problema della replicazione finale, il che significa che parte della sporgenza 3' non può essere replicata dalla DNA polimerasi 1,2. I telomeri corti portano ad anomalie cromosomiche nelle cellule, a causa delle quali le cellule vengono arrestate permanentemente in uno stadio chiamato senescenza replicativa3. I telomeri corti causano anche una miriade di altri problemi, come la ....
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Protocollo
NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su tutti i reagenti utilizzati nel protocollo riportato di seguito. La Tabella 1 elenca i reagenti prodotti in laboratorio insieme ai volumi ottimizzati e la Tabella 2 mostra le concentrazioni operative dei reagenti disponibili in commercio.
1. Coltura cellulare
- Mantenere le cellule la cui lunghezza dei telomeri deve essere misurata (qui erano le cellule A2780, che è una linea cellulare di adenocarcinoma ovarico) nel mezzo completo di Dulbecco con il mezzo di aquila modificato (DMEM) integrato con siero bovino f....
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Risultati
Il DNA genomico estratto (gDNA), che è stato eseguito su un gel di agarosio all'1%, ha mostrato una buona integrità, come mostrato nella Figura 1B, indicando che il campione potrebbe essere utilizzato per un'ulteriore elaborazione a valle dei FRF. Il saggio TRF è stato quindi effettuato modificando i volumi di soluzioni richieste in ogni fase (vedi Tabella 1 e Tabella 2). Il segnale TRF era chiaramente visibile (Figura 3). Perta.......
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Discussione
Descriviamo una procedura dettagliata per un metodo non radioattivo, basato sulla chemiluminescenza per la misurazione della lunghezza dei telomeri utilizzando Southern blotting. Il protocollo è stato testato per consentire l'uso giudizioso di diversi reagenti senza compromettere la qualità dei risultati. Il buffer di preibridazione e ibridazione può essere riutilizzato fino a cinque volte. La concentrazione enzimatica può variare tra 10-20 U per 1,5-2 μg di DNA genomico senza influenzare i risultati. Diversi altri compo.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare la signora Prachi Shah per averci aiutato inizialmente con l'ottimizzazione del protocollo. Vorremmo ringraziare il Dr. Manoj Garg per aver fornito la linea cellulare di cancro ovarico A2780. EK è supportato da una sovvenzione di ricerca del Dipartimento di Biotecnologia (n. BT / RLF / Re-entry / 06 / 2015), Dipartimento di scienza e tecnologia (ECR / 2018 / 002117) e NMIMS Seed Grant (IO 401405).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cell Line | |||
| A2780 (linea cellulare di adenocarcinoma ovarico) | Ricevuto in regalo | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (per imaging e reticolazione UV) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Versione 1.3 | ||
| Materiali | |||
| Acido acetico | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarosio | MP | 180720 | |
| Amfotericina B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | ||
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Acido etilendiammina tetraacetico | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Membrana in nylon | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillina | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodio dodecil solfato | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomicina | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Carta Whatman | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Kit di analisi della lunghezza dei telomeri | 12209136001 | |
| Soluzione bloccante 10x | Telo TAGGG Kit di analisi della lunghezza dei telomeri | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Tampone di rilevamento 10x | Telo TAGGG Kit di analisi della lunghezza dei telomeri | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Kit di analisi della lunghezza dei telomeri | 12209136001 | |
| Tampone di digestione | Telo TAGGG Kit di analisi della lunghezza dei telomeri | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Kit di analisi della lunghezza dei telomeri | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternativa al kit) | NEB | R0155T | |
| Colorante di caricamento | BIOLABS | N3231S Tampone | |
| acido maleico 10x | Telo TAGGG Kit di analisi della lunghezza dei telomeri | 12209136001 | |
| Sonda | Telo TAGGG Kit di analisi della lunghezza dei telomeri | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Kit di analisi della lunghezza dei telomeri | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternativa al kit) | NEB | R0167L | |
| Substrato | Telo TAGGG Kit di analisi della lunghezza dei telomeri | 12209136001 | |
| Tampone di lavaggio | Telo TAGGG Kit di analisi della lunghezza dei telomeri | 12209136001 |
Riferimenti
- Greider, C. W. Telomere length regulation. Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al.
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Ristampe e permessi
