Una tecnica tridimensionale per la visualizzazione dei cambiamenti ultrastrutturali mitocondriali nelle cellule tumorali pancreatiche

Summary

Questo protocollo descrive come ricostruire le creste mitocondriali per ottenere immagini 3D con elevata precisione, alta risoluzione e throughput elevato.

Abstract

Comprendere le caratteristiche dinamiche dell'ultrastruttura dell'organello cellulare, che non è solo ricca di informazioni sconosciute ma anche sofisticata da una prospettiva tridimensionale (3D), è fondamentale per gli studi meccanicistici. La microscopia elettronica (EM) offre una buona profondità di imaging e consente la ricostruzione di pile di immagini ad alta risoluzione per studiare la morfologia ultrastrutturale degli organelli cellulari anche su scala nanometrica; pertanto, la ricostruzione 3D sta acquisendo importanza grazie ai suoi incomparabili vantaggi. La microscopia elettronica a scansione (SEM) fornisce una tecnologia di acquisizione delle immagini ad alta produttività che consente di ricostruire grandi strutture in 3D dalla stessa regione di interesse in sezioni consecutive. Pertanto, l'applicazione del SEM nella ricostruzione 3D su larga scala per ripristinare la vera ultrastruttura 3D degli organelli sta diventando sempre più comune. In questo protocollo, suggeriamo una combinazione di sezione ultrasottile seriale e tecniche di ricostruzione 3D per studiare le criste mitocondriali nelle cellule tumorali pancreatiche. I dettagli di come vengono eseguite queste tecniche sono descritti in questo protocollo in modo dettagliato, incluso il metodo osmio-tiocarboidrazide-osmio (OTO), l'imaging seriale a sezione ultrasottile e il display di visualizzazione.

Introduction

I mitocondri sono uno degli organelli più importanti della cellula. Servono come hub centrale della bioenergetica cellulare e del metabolismo ^1,2 e svolgono un ruolo critico nel cancro³. Il cancro del pancreas (PC) è uno dei tumori più difficili^{da trattare 4} a causa della sua rapida diffusione e dell'alto tasso di mortalità. La disfunzione mitocondriale, causata principalmente da cambiamenti nella morfologia mitocondriale 3,5,6,7^, è stata collegata ai meccani....

Protocol

1. Preparazione del materiale

1. Coltura 2 x 10⁶ cellule Panc02 in 12 ml di terreno DMEM (10% siero fetale bovino e 100 U/mL di penicillina-streptomicina), e mantenere a 37 °C e 95% di umidità in un'atmosfera di 5% di anidride carbonica e 95% di aria per 48 ore.
2. Raccogliere le cellule Panc02, centrifugare a 28 x g per 2 minuti, quindi eliminare il surnatante. Assicurarsi che il campione sia di dimensioni adeguate (1 x 10⁷ celle), altrimenti i seguenti passaggi di fissazione e disidratazione non funzioneranno bene.
3. Aggiungere 1 mL di glutaraldeide al 2,5% come fissativo per fissare le cellule fr....

Results

Durante la coltura cellulare (Figura 1A), abbiamo prima diviso le cellule tumorali pancreatiche in un gruppo di controllo coltivato con terreno di coltura completo, un gruppo (1S,3R)-RSL3⁴⁸ (RSL3, un attivatore della ferroptosi, 100 nM) e un gruppo RSL3 (100 nM) più ferrostatina-1⁴⁹ (Fer-1, un inibitore della ferroptosi, 100 nM). Attraverso le fasi sperimentali di cui sopra, il microscopio elettronico a scansione ha acquisito 38 (Figura supplem.......

Discussion

Il metodo qui presentato è un'utile guida passo-passo per applicare la tecnica di ricostruzione 3D, che prevede l'applicazione della microscopia elettronica e della tecnologia di elaborazione delle immagini all'impilamento e alla segmentazione di immagini tomografiche 2D generate da sezioni seriali ultrasottili. Questo protocollo evidenzia una limitazione delle immagini 2D che può essere affrontata dalla visualizzazione 3D dell'ultrastruttura dell'organello, che presenta i vantaggi di una forte riproducibilità delle stru.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
Acetone	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging		2020.2
Acido aspartico	MCE	HY-42068
Aquila modificata di Dulbecco' s medium	Gibco	11995115
Etanolo	Merck	100983
Ferrostatin-1	MCE	HY-100579
Siero fetale bovino	Gibco	10437010
Microscopio elettronico a scansione a emissione di campo	HITACHI	SU8010
Glutaraldeide	Alfa Aesar	A10500.22
Piombo nitrato	SANTA CRUZ	sc-211724
Tetrossido di osmio	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	Collezione europea di colture cellulari autenticate
Penicillina-streptomicina	Biosharp	BL505A
Soluzione salina tamponata con fosfato	Biosharp	BL302A
Pon 812 Resina epossidica	SPI CHEM	GS02660
Ferrocianuro di potassio	Macklin	P816416
Tiocarbobidrazide	Merck	223220
Ultramicrotomo	LEICA	EMUC7
Acetato di uranile	RHAWN	R032929