Articolo metodologico

Quantificazione basata sulla fluorescenza del potenziale di membrana mitocondriale e dei livelli di superossido utilizzando l'imaging dal vivo nelle cellule HeLa

DOI:

10.3791/65304

⸱

12 maggio 2023

 , 
1Department of Cell Biology, Duke University Medical Center

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa tecnica descrive un flusso di lavoro efficace per visualizzare e misurare quantitativamente il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido all'interno delle cellule HeLa utilizzando l'imaging dal vivo basato sulla fluorescenza.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I mitocondri sono organelli dinamici critici per l'omeostasi metabolica controllando la produzione di energia attraverso la sintesi di ATP. Per sostenere il metabolismo cellulare, vari meccanismi di controllo della qualità mitocondriale cooperano per mantenere una rete mitocondriale sana. Uno di questi percorsi è la mitofagia, in cui la chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) e la fosfo-ubiquitinazione parkina dei mitocondri danneggiati facilitano il sequestro dell'autofagosoma e la successiva rimozione dalla cellula tramite fusione del lisosoma. La mitofagia è importante per l'omeostasi cellulare e le mutazioni nel Parkin sono legate alla malattia di Parkinson (PD). A causa di questi risultati, c'è stata un'enfasi significativa sullo studio del danno mitocondriale e del turnover per comprendere i meccanismi molecolari e le dinamiche del controllo di qualità mitocondriale. Qui, l'imaging di cellule vive è stato utilizzato per visualizzare la rete mitocondriale delle cellule HeLa, per quantificare il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido dopo il trattamento con cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone (CCCP), un agente di disaccoppiamento mitocondriale. Inoltre, una mutazione PD-linked di Parkin (ParkinT240R) che inibisce la mitofagia Parkin-dipendente è stata espressa per determinare come l'espressione mutante influisce sulla rete mitocondriale rispetto alle cellule che esprimono Parkin wild-type. Il protocollo qui descritto descrive un semplice flusso di lavoro che utilizza approcci basati sulla fluorescenza per quantificare efficacemente il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La rete mitocondriale è una serie di organelli interconnessi che svolgono un ruolo cruciale nella produzione di energia1, nell'immunità innata2,3 e nella segnalazione cellulare 4,5. La disregolazione mitocondriale è stata associata a malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson (PD)6,7. Il PD è una malattia neurodegenerativa progressiva che colpisce i neuroni dopaminergici della substantia nigra che colpisce quasi 10 milioni di persone in tutto il mondo8. Il PD è stato geneticamente collegato alla mitofagia, una via di controllo della qualità mitocondriale necessaria per mantenere l'omeostasi cellulare che rimuove selettivamente i mitocondri danneggiati 9,10. Gli studi hanno identificato molteplici percorsi mitofagici indipendenti, tra cui la mitofagia mediata dal dominio FUN14 contenente 1 (FUNDC1), la mitofagia facilitata dalla proteina 3 interagente Bcl-2 (BNIP3), la mitofagia NIX-dipendente e la ben caratterizzata chinasi 1 (PINK1) / Parkin-regolata mitofagia10,11. PINK1 (una presunta chinasi) e Parkin (una ubiquitina ligasi E3) lavorano in tandem con i mitocondri danneggiati fosfo-ubiquitinati, che guidano la formazione di autofagosomi che inghiottono l'organello danneggiato e si fondono con i lisosomi per avviare la degradazione 12,13,14,15,16. Le mutazioni nel Parkin sono state associate a fenotipi legati alla PD come la neurodegenerazione attraverso la perdita di neuroni dopaminergici17,18.

Qui viene descritto un protocollo in cui le cellule HeLa, cellule immortalizzate utilizzate di routine derivate dal cancro cervicale, vengono utilizzate per studiare il ruolo del Parkin nel mantenimento della salute della rete mitocondriale. Le cellule HeLa esprimono livelli trascurabili di Parkin endogeno e pertanto richiedono l'espressione esogena di Parkina19. Per studiare il ruolo del Parkin nella salute della rete mitocondriale, le cellule HeLa sono trasfettate con Parkin di tipo selvatico (ParkinWT), un mutante Parkin (ParkinT240R) o un vettore di controllo vuoto. ParkinT240R è una mutazione autosomica recessiva del parkinsonismo giovanile che influenza l'attività della parkina E3 ligasi, riducendo significativamente l'efficienza della via mitofagia20. Le cellule HeLa sono soggette a concentrazioni lievi (5 μM) o gravi (20 μM) di cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone (CCCP), un agente di disaccoppiamento mitocondriale. Il trattamento con gravi concentrazioni di CCCP viene utilizzato di routine per indurre la mitofagia mediata dal Parkina in varie linee cellulari, come HeLa e le cellule COS-721,22,23.

Dopo il trattamento, il protocollo impiega l'imaging dal vivo della rete mitocondriale utilizzando due coloranti fluorescenti mitocondriali attualmente disponibili. La tetrametilrhodamina, estere etilico, perclorato (TMRE) è un colorante cationico che fluoresce in base al potenziale di membrana mitocondriale24, mentre MitoSOX è un indicatore di superossido mitocondriale in cui l'intensità di fluorescenza è una funzione della concentrazione di superossido25. Infine, il protocollo delineato utilizza una quantificazione basata sulla fluorescenza e un flusso di lavoro semplice per quantificare efficacemente il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido con un margine minimo per i pregiudizi dell'utente. Sebbene questo protocollo sia stato progettato per studiare la funzione mitocondriale nelle cellule HeLa, può essere adattato per ulteriori linee cellulari e tipi di cellule primarie per caratterizzare quantitativamente la salute della rete mitocondriale.

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Protocollo

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1. Preparazione di campioni biologici

NOTA: eseguire i seguenti passaggi utilizzando una tecnica sterile in un armadio di biosicurezza. Spruzzare la superficie dell'armadio e tutti i materiali con etanolo al 70%.

  1. Coltura e trasfezione delle cellule HeLa
    1. Coltura di 30.000 cellule HeLa nel mezzo di coltura modificato di Dulbecco (DMEM) contenente 4,5 g/L di glucosio integrato con il 10% di siero bovino fetale e l'1% di soluzione di L-glutammina (HeLa media; vedi Tabella dei materiali). Placcare le celle su piastre di imaging con fondo di vetro da 35 mm (vedi Table of Materials) contenenti 2 mL di mezzo HeLa preriscaldato. Mantenere le colture HeLa al 5% di CO2 e 37 °C26,27.
    2. Il giorno dopo la placcatura, ispezionare le stoviglie di imaging da 35 mm utilizzando un microscopio ottico per assicurarsi che le cellule siano ~ 50% -60% confluenti. Una volta confluenti, trasfettare le cellule HeLa con il vettore YFP (yellow fluorescent protein) vuoto, YFP-ParkinWT o YFP-ParkinT240R (Figura 1A).
    3. Preparare due miscele separate in provette sterili per microcentrifuga per ogni trasfezione. Mescolare picchiettando il tubo o pipettando delicatamente su e giù.
      1. Nel tubo 1, mescolare 200 μL di mezzi sierici ridotti (vedere Tabella dei materiali) con 2 μg di DNA plasmide.
      2. Nella provetta 2, mescolare 200 μL di mezzo sierico ridotto con 6 μL di reagente di trasfezione (vedere Tabella dei materiali)28.
    4. Incubare i tubi per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Aggiungere il tubo 2 al tubo 1, mescolare mediante pipettaggio su e giù e incubare per 20 minuti a RT.
    5. Aggiungere i complessi di trasfezione a goccia ai piatti di imaging esistenti contenenti le colture cellulari HeLa, garantendo una distribuzione uniforme sull'intero piatto. Posizionare le piastre di imaging nell'incubatore al 5% di CO2 e 37 °C durante la notte.
      NOTA: Etichettare ogni piatto con il plasmide trasfettato appropriato. Per ogni esperimento, etichettare i tre piatti YFP-ParkinWT (dimetilsolfossido [DMSO; vedi Tabella dei materiali], 5 μM CCCP e 20 μM CCCP). Ripetere l'etichettatura con le tre parabole YFP-ParkinT240R e le tre parabole vettoriali YFP vuote.
  2. Preparazione di CCCP e coloranti fluorescenti
    ATTENZIONE: I coloranti fluorescenti sono spesso sensibili alla luce. Conservare i coloranti al buio utilizzando fogli di alluminio o tubi da centrifuga marrone per ridurre l'esposizione alla luce.
    1. Produrre una scorta di lavoro di 5 mM di CCCP (vedere Tabella dei materiali) sciogliendo 5 mg di CCCP in 4,89 mL di DMSO. Fare uno stock di lavoro di 20 mM di CCCP sciogliendo 5 mg di CCCP in 1,22 mL di DMSO.
    2. Diluire 10 μL di una soluzione madre MitoTracker Deep Red da 1 mM (vedere la tabella dei materiali) in 390 μL di DMSO per ottenere un materiale di lavoro da 25 μM.
    3. Sciogliere 50 μg di MitoSOX Red25 (vedere Tabella dei materiali) in 13 μL di DMSO per creare un materiale di lavoro di 5 mM.
    4. Sciogliere 10 mg di TMRE24 (vedere Tabella dei materiali) in 19,4 mL di DMSO per ottenere una soluzione madre da 1 mM. Diluire il TMRE aggiungendo 10 μL di 1 mM di TMRE in 990 μL di DMSO per ottenere un materiale di lavoro di 10 μM.

2. Trattamento CCCP ed etichettatura mitocondriale con sonde fluorescenti in cellule HeLa

ATTENZIONE: Eseguire rapidamente i seguenti passaggi per assicurarsi che le cellule HeLa non siano fuori dall'incubatore per un periodo prolungato.

  1. Il giorno dopo la trasfezione, aggiungere 2 μL di CCCP da 5 o 20 mM (concentrazione finale: 5 μM e 20 μM, rispettivamente) a ciascuna piastra sperimentale. Per le piastre di controllo, aggiungere 2 μL di DMSO. Riportare le piastre nell'incubatore al 5% di CO2 e 37 °C per 1,5 ore (Figura 1A).
    NOTA: Il trattamento CCCP è per un totale di 2 ore. Tuttavia, i mitocondri sono marcati con sonde fluorescenti durante gli ultimi 30 minuti del trattamento CCCP.
  2. Dopo 1,5 ore, rimuovere le piastre dall'incubatore e aggiungere sonde fluorescenti alle piastre di imaging. Riportare le piastre nell'incubatore al 5% di CO2 e 37 °C per 30 minuti (Figura 1A).
    1. Esperimento TMRE: aggiungere 2 μL di MitoTracker da 25 μM (concentrazione finale: 25 nM) e 2 μL di TMRE da 10 μM (concentrazione finale: 10 nM).
    2. Esperimento MitoSOX: aggiungere 2 μL di MitoTracker da 25 μM (concentrazione finale: 25 nM) e 1 μL di MitoSOX da 5 mM (concentrazione finale: 2,5 μM).
  3. Dopo il trattamento CCCP di 2 ore, preparare le cellule HeLa per l'imaging (Figura 1A,B).
    1. Esperimento TMRE: le cellule HeLa sono immediatamente pronte per l'immagine; assicurarsi che la TMRE rimanga nei terreni di coltura cellulare HeLa.
    2. Esperimento MitoSOX: lavare le cellule 3 volte con 2 ml di mezzo HeLa preriscaldato per rimuovere il colorante MitoSOX libero. Aggiungere 2 ml di fluido preriscaldato. Le cellule HeLa sono ora pronte per l'immagine.
      NOTA: Lavare le cellule HeLa con mezzi HeLa freschi e preriscaldati che contengono la stessa concentrazione di DMSO o CCCP della condizione sperimentale; non includono MitoSOX o MitoTracker.

3. Configurazione dell'acquisizione di immagini al microscopio confocale

NOTA: Immagini delle cellule HeLa utilizzando un microscopio confocale (vedi Tabella dei materiali) dotato di un obiettivo ad immersione in olio con apertura numerica (NA) 63x/1,40 e di una camera ambientale (vedi Tabella dei materiali).

  1. A 1 h prima dell'imaging, accendere la CO2 aprendo la valvola del serbatoio. Premere il pulsante On per accendere il controller ambientale per il microscopio. Utilizzare le frecce Su e Giù sul touchpad per regolare la temperatura a 37 °C e il CO2 al 5%. Premere Imposta al termine.
    NOTA: Assicurarsi che le porte della camera ambientale siano chiuse e attendere che le condizioni si stabilizzino.
  2. Impostazioni laser
    1. Accendere il laser a luce bianca (WLL) e impostare la potenza del laser all'85% e il controllo dell'eccitazione alla massima potenza. Fare clic sulla scheda Acquisisci, selezionare Aggiungi laser e, nella finestra di dialogo visualizzata, impostare WLL su On. Fare clic sul pulsante di accensione laser e immettere 85%. Fare clic sul pulsante Controllo eccitazione e selezionare Potenza massima dal menu a discesa (Figura 2A).
    2. Esperimento TMRE: Impostare gli spettri di eccitazione ed emissione per YFP, MitoTracker e TMRE.
      1. Per YFP, impostare il laser di eccitazione su 514 nm e la finestra degli spettri di emissione su 524-545 nm. Nella scheda Acquisisci, fai clic sul pulsante Aggiungi nuova impostazione; quindi, fai clic su Aggiungi laser e trascinalo in Impostazione 1. Fate doppio clic sulla linea di eccitazione e immettete 514 come lunghezza d'onda nella finestra di dialogo. Fare doppio clic sul rilevatore corrispondente e immettere 524 per l'inizio e 545 per la lunghezza d'onda finale.
      2. Per MitoTracker Deep Red, impostare il laser di eccitazione su 641 e la finestra degli spettri di emissione su 650-750 nm. Nella scheda Acquisisci, fai clic sul pulsante Aggiungi laser e trascinalo in Impostazione 1. Fate doppio clic sulla linea di eccitazione e immettete 641 come lunghezza d'onda nella finestra di dialogo. Fare doppio clic sul rilevatore corrispondente e immettere 650 per l'inizio e 750 per la lunghezza d'onda finale.
      3. Per TMRE, impostare il laser di eccitazione su 555 nm e la finestra degli spettri di emissione su 557-643 nm. Nella scheda Acquisisci, fai clic sul pulsante Aggiungi nuova impostazione; quindi, fai clic sul pulsante Aggiungi laser e trascinalo in Impostazione 2. Fate doppio clic sulla linea di eccitazione e immettete 555 come lunghezza d'onda nella finestra di dialogo. Fare doppio clic sul rilevatore corrispondente e immettere 557 per l'inizio e 643 per la lunghezza d'onda finale.
    3. Esperimento MitoSOX: Impostare gli spettri di eccitazione ed emissione per YFP, MitoTracker e MitoSOX (Figura 2B).
      1. Per YFP, impostare il laser di eccitazione su 507 nm e la finestra degli spettri di emissione su 517-540 nm. Nella scheda Acquisisci, fai clic sul pulsante Aggiungi nuova impostazione; quindi, fai clic sul pulsante Aggiungi laser e trascinalo in Impostazione 1. Fate doppio clic sulla linea di eccitazione e immettete 507 come lunghezza d'onda nella finestra di dialogo. Fare doppio clic sul rilevatore corrispondente e immettere 517 per l'inizio e 540 per la lunghezza d'onda finale.
      2. Per MitoSOX, impostare il laser di eccitazione su 547 nm e la finestra degli spettri di emissione su 564-636 nm. Nella scheda Acquisisci , fai clic sul pulsante Aggiungi nuova impostazione ; quindi, fai clic sul pulsante Aggiungi laser e trascinalo in Impostazione 2. Fate doppio clic sulla linea di eccitazione e immettete 547 come lunghezza d'onda nella finestra di dialogo. Fare doppio clic sul rilevatore corrispondente e immettere 564 per l'inizio e 636 per la lunghezza d'onda finale.
      3. Per MitoTracker Deep Red, impostare il laser di eccitazione su 641 nm e la finestra degli spettri di emissione su 652-742 nm. Nella scheda Acquisisci, fai clic sul pulsante Aggiungi nuova impostazione; fai clic sul pulsante Aggiungi laser e trascinalo in Impostazioni 3. Fate doppio clic sulla linea di eccitazione e immettete 641 come lunghezza d'onda nella finestra di dialogo. Fare doppio clic sul rilevatore corrispondente e immettere 652 per l'inizio e 742 per la lunghezza d'onda finale.
  3. Impostazioni di acquisizione delle immagini (Figura 2C)
    1. Impostare il formato su 1.024 x 1.024, la velocità di scansione su 600 Hz e la media di linea su 3.
      1. Selezionare la scheda Acquisizione e fare clic sul pulsante Formato . Dal menu a discesa, seleziona 1.024 x 1.024. Fai clic sul pulsante Velocità e seleziona 600 dal menu a discesa. Quindi, fai clic sul pulsante Media linea e, dal menu a discesa, seleziona 3.
      2. Attivare la scansione bidirezionale e impostare il fattore di fase e di zoom rispettivamente su 22,61 e 1,50.
        1. Nella scheda Acquisizione, impostare il pulsante Bidirezionale su Attivato. Fare clic sull'impostazione Fase X e impostarla su 22.61. Fare clic sull'impostazione Fattore di zoom e impostarla su 1,50.

4. Acquisizione di immagini

ATTENZIONE: Lo sperimentatore deve esprimere un giudizio visivo per selezionare le cellule in base al segnale di fluorescenza YFP. Evita i pixel sovrasaturi, in quanto possono influenzare significativamente la quantificazione dell'intensità della fluorescenza. Usa una tabella di ricerca sopra/sotto che indica la saturazione dei pixel per evitare di acquisire immagini sature.

  1. Fare clic su Impostazione di interesse e premere Fast Live per fornire un'anteprima in tempo reale dell'immagine a fluorescenza.
  2. Regolare il guadagno e l'intensità facendo doppio clic sul rilevatore corrispondente. Nella finestra di dialogo visualizzata, regolate il Guadagno utilizzando il dispositivo di scorrimento. Per modificare l'intensità, fare doppio clic sulla linea di eccitazione e utilizzare le frecce su e giù nella finestra popup per modificare l'intensità. Fare clic su Interrompi per terminare l'anteprima.
    1. Esperimento TMRE : Immagine prima della piastra di controllo DMSO . Regolare il guadagno e l'intensità del segnale TMRE (Impostazione 2) in modo che l'intensità della rete mitocondriale sia appena al di sotto della saturazione; Mantieni costante il guadagno e l'intensità per l'esperimento. Regolare il guadagno e l'intensità del MitoTracker e YFP (impostazione 1) in modo che la rete mitocondriale sia visibile ma debole.
    2. Esperimento MitoSOX: immagine prima della piastra di controllo DMSO. Regolare il guadagno e l'intensità del segnale MitoSOX (Impostazione 2) in modo che la fluorescenza sia visibile ma debole; Mantieni costante il guadagno e l'intensità per l'esperimento. Regolare il guadagno e l'intensità di YFP (Impostazione 1) e MitoTracker (Impostazione 3) in modo che la rete mitocondriale sia visibile ma debole.
      NOTA: Registrare il guadagno e l'intensità di TMRE e MitoSOX, poiché questi valori devono rimanere costanti durante l'esperimento. I segnali di fluorescenza di YFP e MitoTracker non sono quantificati in questo protocollo. Pertanto, il guadagno e l'intensità possono essere regolati per ogni immagine. È più efficace avere le impostazioni di guadagno e intensità in cui le cellule sono facili da vedere ma ancora deboli, per garantire che le cellule non siano esposte a intensità laser eccessive che causano danni cellulari o fotosbiancamento.
  3. Una volta completate le impostazioni di guadagno e intensità, fai clic su Avvia per acquisire un'immagine. Acquisire immagini di 20 cellule per condizione sperimentale (ad esempio, cinque immagini con quattro cellule per immagine; Figura 2D).

5. Quantificazione dell'intensità di fluorescenza con ImageJ

NOTA: i file di imaging vengono salvati come ".lif" e sono compatibili con ImageJ29. I tipi di file compatibili con ImageJ sono specificati sul loro sito Web. Potrebbe essere necessario convertire il tipo di file se è incompatibile.

  1. Creare e salvare un'area di interesse (ROI).
    1. In ImageJ, fare clic su File | Novità | Immagine. Nella finestra di dialogo visualizzata, fare clic su OK.
    2. Fate clic sul pulsante Strumento rettangolo (Rectangle Tool) e disegnate una casella da 6 micron x 6 micron. Apri il gestore ROI facendo clic su Analizza | Strumenti | ROI Manager e attendere che venga visualizzata una finestra di dialogo con il gestore ROI (Figura 3A). Aggiungere il ROI rettangolare al gestore facendo clic su Aggiungi nella finestra di dialogo del gestore. Salva il ROI selezionando Altro, quindi fai clic sul pulsante Salva e OK.
  2. Misurare l'intensità della fluorescenza.
    1. Nell'immagine J, fare clic su File e selezionare Apri. Nella finestra di dialogo, selezionare i file di imaging per l'esperimento e fare clic su Apri.
    2. Attendere che venga visualizzata la finestra Opzioni di importazione dei bioformati (Figura 3B). Selezionare Dividi canali e fare clic su Apri.
      NOTA: la funzione di divisione dei canali consente di aprire ciascun canale dell'immagine come finestra separata. L'ordine dei canali corrisponde all'ordine di acquisizione.
      1. Esperimenti TMRE : YFP (Setting 1) è il primo canale (c = 0); MitoTracker (Impostazione 1) è il secondo canale (c = 1); e TMRE (Impostazione 2) è il terzo canale (c = 2).
      2. Esperimenti MitoSOX : YFP (Setting 1) è il primo canale (c = 0); MitoSOX (Setting 2) è il secondo canale (c = 1); e MitoTracker (Impostazione 3) è il terzo canale (c = 2).
    3. Regolare la luminosità selezionando Immagine | Regola | Luminosità (Figura 3C).
      NOTA: non premere Imposta o Applica per assicurarsi che la luminosità dell'immagine non venga alterata in modo permanente. Occasionalmente, l'intensità della fluorescenza non è visibile nei canali TMRE o MitoSOX. Regola la luminosità per consentire una visualizzazione più semplice. La modifica della luminosità non influisce sui valori grezzi di intensità della fluorescenza.
    4. Fare clic su Analizza e selezionare Imposta misure. Selezionare le caselle Area e Valore grigio medio e fare clic su OK (Figura 3D).
      NOTA: il valore medio di grigio è l'intensità di fluorescenza.
    5. Aprire il ROI Manager e caricare il ROI salvato nel passaggio 5.1 facendo clic su Analizza | Strumenti | Responsabile ROI. In Gestione ROI, fai clic su Altro, quindi su Apri dall'elenco visualizzato e seleziona il ROI salvato.
    6. Misurare l'intensità di fluorescenza di cinque regioni casuali in una singola cella selezionando il ROI salvato dal gestore del ROI e spostare il ROI in una posizione casuale all'interno di una cella (Figura 3E). Misurare l'intensità della fluorescenza premendo M. Ripetere questo passaggio con altre quattro aree non sovrapposte. Quando viene visualizzata una finestra di dialogo con l'area e i valori di grigio medi (Figura 3F), copiare e incollare i valori in un foglio di calcolo per l'analisi.
      1. Esperimento TMRE : selezionare l'immagine (c = 2).
      2. Esperimento MitoSOX : selezionare l'immagine (c = 2).
    7. Ottenere i valori medi di intensità di fluorescenza. Utilizzando un software per fogli di calcolo (vedere Tabella dei materiali), calcolare la media dei cinque valori di grigio medi. Ripetere questo processo per ogni cella.
    8. Analizzare e confrontare i valori di grigio medi TMRE o MitoSOX in condizioni sperimentali utilizzando un programma software statistico (vedi Tabella dei materiali; Figura 4 e Figura 5). Presenta i dati come grafici a barre o diagrammi di violino.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo protocollo, la quantificazione basata sulla fluorescenza è stata utilizzata per misurare il potenziale di membrana e i livelli di superossido della rete mitocondriale dopo il trattamento con CCCP (Figura 1). Questo flusso di lavoro ha utilizzato cellule HeLa, una linea cellulare immortalizzata derivata dal cancro cervicale. Le cellule HeLa sono abitualmente utilizzate per studiare la biologia mitocondriale e sono relativamente piatte, rendendo facile visualizzare la rete mitocondri...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il flusso di lavoro qui descritto può essere utilizzato per quantificare il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido in modo robusto e riproducibile utilizzando l'imaging basato sulla fluorescenza30. Ci sono importanti limitazioni tecniche da considerare quando si progettano questi esperimenti. Le cellule HeLa sono state trasfettate con un vettore YFP vuoto, YFP-ParkinWT o YFP-ParkinT240R. Il vettore YFP vuoto è stato utilizzato come controllo per co...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno interessi concorrenti da dichiarare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo i membri del laboratorio Evans per il loro attento feedback su questo manoscritto. Questo lavoro è supportato da Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars e Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. La Figura 1A è stata realizzata utilizzando BioRender.com.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sostanze chimiche, peptidi e proteine ricombinanti
CCCP (cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone) Sigma-AldrichC2759
DMEM (1x) con 4,5 g/L di glucosioGibco11-965-084
DMSO, anidroThermoFisher ScientificD12345
Siero fetale bovinoHycloneSH3007103
FuGENE 6 (reagente di trasfezione)PromegaE2691
GlutaMAX 100x (soluzione di L-glutammina) Gibco 35-050-061
Hoescht 33342ThermoFisher Scientific62249
MitoSOX  Rosso ThermoFisher ScientificM36008
MitoTracker Rosso IntensoThermoFisher ScientificM7514
Opti-MEM (terreni di siero ridotto)ThermoFisher scientific31985070
Tetrametilrodamina, estere etilico, perclorato (TMRE) ThermoFisher ScientificT669
Modelli sperimentali: Organismi/Ceppi
HeLa-M (Homo sapiens)A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)N/A
DNA ricombinante
EYFP Vettore vuotoN/AN/A
YFP-Parkin T240RQuesto documentoè stato generato mediante mutagenesi sito-specifica da YFP-Parkin
YFP-Parkin WTAddgene; PMID:19029340RRID:Addgene_23955
Software e algoritmi
Adobe IllustratorAdobe Inc.https://www.adobe.com/products/illustrator(Schindelin, 2012)
Excel (software per fogli di calcolo)Microsoft Office 
ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft ExcelMicrosoft Officehttps://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistico Software di analisi)Software GraphPadhttps://www.graphpad.com
Altro
Piatto da 35 mm, Vetrino coprioggetti n. 1,5, diametro vetro 20 mm, incubatore aMatTekP35G-1,5-20-C
(camera ambientale)Okolab
DMiLLeicaN/A
LIGHTNING Software di deconvoluzioneLeicaN/A
STELLARIS 8 microscopio confocaleLeicaN/A
https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel, gabbia non rivestitoMicroscopio invertito https://www.oko-lab.com/cage-incubator

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
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