Quantificazione basata sulla fluorescenza del potenziale di membrana mitocondriale e dei livelli di superossido utilizzando l'imaging dal vivo nelle cellule HeLa

Summary

Questa tecnica descrive un flusso di lavoro efficace per visualizzare e misurare quantitativamente il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido all'interno delle cellule HeLa utilizzando l'imaging dal vivo basato sulla fluorescenza.

Abstract

I mitocondri sono organelli dinamici critici per l'omeostasi metabolica controllando la produzione di energia attraverso la sintesi di ATP. Per sostenere il metabolismo cellulare, vari meccanismi di controllo della qualità mitocondriale cooperano per mantenere una rete mitocondriale sana. Uno di questi percorsi è la mitofagia, in cui la chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) e la fosfo-ubiquitinazione parkina dei mitocondri danneggiati facilitano il sequestro dell'autofagosoma e la successiva rimozione dalla cellula tramite fusione del lisosoma. La mitofagia è importante per l'omeostasi cellulare e le mutazioni nel Parkin sono legate alla malattia di Parkinson (PD). A causa di questi risultati, c'è stata un'enfasi significativa sullo studio del danno mitocondriale e del turnover per comprendere i meccanismi molecolari e le dinamiche del controllo di qualità mitocondriale. Qui, l'imaging di cellule vive è stato utilizzato per visualizzare la rete mitocondriale delle cellule HeLa, per quantificare il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido dopo il trattamento con cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone (CCCP), un agente di disaccoppiamento mitocondriale. Inoltre, una mutazione PD-linked di Parkin (Parkin^T240R) che inibisce la mitofagia Parkin-dipendente è stata espressa per determinare come l'espressione mutante influisce sulla rete mitocondriale rispetto alle cellule che esprimono Parkin wild-type. Il protocollo qui descritto descrive un semplice flusso di lavoro che utilizza approcci basati sulla fluorescenza per quantificare efficacemente il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido.

Introduction

La rete mitocondriale è una serie di organelli interconnessi che svolgono un ruolo cruciale nella produzione di energia¹, nell'immunità innata^2,3 e nella segnalazione cellulare ^4,5. La disregolazione mitocondriale è stata associata a malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson (PD)^6,7. Il PD è una malattia neurodegenerativa progressiva che colpisce i neuroni dopaminergici della substantia nigra che colpisce quasi 10 milioni di persone in tutto il mondo....

Protocol

1. Preparazione di campioni biologici

NOTA: eseguire i seguenti passaggi utilizzando una tecnica sterile in un armadio di biosicurezza. Spruzzare la superficie dell'armadio e tutti i materiali con etanolo al 70%.

1. Coltura e trasfezione delle cellule HeLa
   1. Coltura di 30.000 cellule HeLa nel mezzo di coltura modificato di Dulbecco (DMEM) contenente 4,5 g/L di glucosio integrato con il 10% di siero bovino fetale e l'1% di soluzione di L-glutammina (HeLa media; vedi Tabella dei materiali). Placcare le celle su piastre di imaging con fondo di vetro da 35 mm (vedi Table of Materials

Results

In questo protocollo, la quantificazione basata sulla fluorescenza è stata utilizzata per misurare il potenziale di membrana e i livelli di superossido della rete mitocondriale dopo il trattamento con CCCP (Figura 1). Questo flusso di lavoro ha utilizzato cellule HeLa, una linea cellulare immortalizzata derivata dal cancro cervicale. Le cellule HeLa sono abitualmente utilizzate per studiare la biologia mitocondriale e sono relativamente piatte, rendendo facile visualizzare la rete mitocondri.......

Discussion

Il flusso di lavoro qui descritto può essere utilizzato per quantificare il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido in modo robusto e riproducibile utilizzando l'imaging basato sulla fluorescenza³⁰. Ci sono importanti limitazioni tecniche da considerare quando si progettano questi esperimenti. Le cellule HeLa sono state trasfettate con un vettore YFP vuoto, YFP-Parkin^WT o YFP-Parkin^T240R. Il vettore YFP vuoto è stato utilizzato come controllo per co.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sostanze chimiche, peptidi e proteine ricombinanti
CCCP (cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone)	Sigma-Aldrich	C2759
DMEM (1x) con 4,5 g/L di glucosio	Gibco	11-965-084
DMSO, anidro	ThermoFisher Scientific	D12345
Siero fetale bovino	Hyclone	SH3007103
FuGENE 6 (reagente di trasfezione)	Promega	E2691
GlutaMAX 100x (soluzione di L-glutammina)	Gibco	35-050-061
Hoescht 33342	ThermoFisher Scientific	62249
MitoSOX  Rosso	ThermoFisher Scientific	M36008
MitoTracker Rosso Intenso	ThermoFisher Scientific	M7514
Opti-MEM (terreni di siero ridotto)	ThermoFisher scientific	31985070
Tetrametilrodamina, estere etilico, perclorato (TMRE)	ThermoFisher Scientific	T669
Modelli sperimentali: Organismi/Ceppi
HeLa-M (Homo sapiens)	A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)	N/A
DNA ricombinante
EYFP Vettore vuoto	N/A	N/A
YFP-Parkin T240R	Questo documento	è stato generato mediante mutagenesi sito-specifica da YFP-Parkin
YFP-Parkin WT	Addgene; PMID:19029340	RRID:Addgene_23955
Software e algoritmi
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	https://www.adobe.com/products/illustrator	(Schindelin, 2012)
Excel (software per fogli di calcolo)	Microsoft Office
ImageJ		https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistico Software di analisi)	Software GraphPad	https://www.graphpad.com
Altro
Piatto da 35 mm, Vetrino coprioggetti n. 1,5, diametro vetro 20 mm, incubatore a	MatTek	P35G-1,5-20-C
(camera ambientale)		Okolab
DMiL	Leica	N/A
LIGHTNING Software di deconvoluzione	Leica	N/A
STELLARIS 8 microscopio confocale	Leica	N/A