Il metodo di "mungitura del cervello" per l'isolamento di cellule staminali neurali e cellule progenitrici di oligodendrociti da ratti vivi

Sommario

Un metodo per l'isolamento di cellule staminali neurali e cellule progenitrici di oligodendrociti dal cervello di ratti vivi è presentato qui in dettaglio sperimentale. Permette di raccogliere più cellule dagli stessi animali senza comprometterne il benessere.

Abstract

Le cellule staminali neurali tessuto-specifiche (NSC) rimangono attive nel cervello postnatale dei mammiferi. Risiedono in nicchie specializzate, dove generano nuovi neuroni e glia. Una di queste nicchie è la zona subependimale (SEZ; chiamata anche zona ventricolare-subventricolare), che si trova lungo le pareti laterali dei ventricoli laterali, adiacente allo strato cellulare ependimale. Le cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) sono abbondantemente distribuite in tutto il sistema nervoso centrale, costituendo un pool di cellule progenitrici proliferative che possono generare oligodendrociti.

Sia le NSC che le OPC mostrano un potenziale di auto-rinnovamento e cicli di quiescenza/attivazione. A causa della loro posizione, l'isolamento e l'indagine sperimentale di queste cellule viene eseguita post mortem. Qui descriviamo in dettaglio la "mungitura cerebrale", un metodo per l'isolamento di NSC e OPC, tra le altre cellule, da animali vivi. Si tratta di un protocollo in due fasi progettato per l'uso nei roditori e testato nei ratti. In primo luogo, le cellule vengono "rilasciate" dal tessuto tramite iniezione intracerebroventricolare stereotassica (i.c.v.) di un "cocktail di rilascio". I componenti principali sono la neuraminidasi, che prende di mira le cellule ependimali e induce la denudazione della parete ventricolare, un anticorpo bloccante l'integrina-β1 e il fattore di crescita dei fibroblasti-2. In una seconda fase di "raccolta" vengono eseguite biopsie liquide di liquido cerebrospinale dalla cisterna magna, in ratti anestetizzati senza necessità di incisione.

I risultati qui presentati mostrano che le cellule isolate mantengono il loro profilo endogeno e che le NSC della ZES conservano la loro quiescenza. La denudazione dello strato ependimale è limitata al livello anatomico dell'iniezione e il protocollo (rilascio e raccolta) è ben tollerato dagli animali. Questo nuovo approccio apre la strada all'esecuzione di studi longitudinali sulla neurogenesi endogena e sulla gliogenesi negli animali da esperimento.

Introduzione

Le cellule staminali tessuto-specifiche sono cellule parzialmente impegnate che possono dare origine a tutte le popolazioni cellulari che costituiscono i rispettivi tessuti. Oltre ad essere multipotenti, sono cellule che si autorinnovano e sono fondamentali per mantenere l'omeostasi e la capacità rigenerativa dei tessuti¹. Alcune cellule staminali tessuto-specifiche rimangono in uno stato attivo e fortemente proliferativo, come le cellule staminali intestinali o ematopoietiche. Altri, come le cellule staminali cerebrali, rimangono in gran parte quiescenti o dormienti². Nel cervello adulto, le cellule staminali neurali (NSC) possono essere trovate in aree specializzate, spesso chiamate nicchie. Due di queste aree ben descritte esistono nella zona subependimale (SEZ) dei ventricoli laterali e nel giro dentato dell'ippocampo. La nicchia SEZ genera il maggior numero di cellule, principalmente neuroblasti che migrano verso i bulbi olfattivi e contribuiscono alla popolazione interneuronale locale; al contrario, gli oligodendroblasti generati migrano verso l'adiacente corpo calloso (CC)³. Le cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) sono cellule mitoticamente attive, ampiamente distribuite in tutto il sistema nervoso centrale, che: i) sono impegnate nella linea oligodendrogliale, ii) possono migrare verso i siti di demielinizzazione e iii) possono differenziarsi in oligodendrociti mielinizzanti. Gli OPC mostrano anche un potenziale di auto-rinnovamento e di quiescenza⁴.

Fino ad ora, l'isolamento e lo studio di NSC e OPC richiedevano la dissociazione post mortem del cervello sezionato e del tessuto del midollo spinale. Per aggirare questa limitazione sperimentale, abbiamo stabilito un metodo che consente, per la prima volta, l'isolamento di NSC e OPC cerebrali da animali vivi. Chiamiamo questo metodo "mungitura", perché consente più raccolte di cellule poiché i loro pool non sono esauriti. Il protocollo è stato sviluppato nei ratti, a causa delle loro grandi dimensioni cerebrali, prendendo di mira principalmente la ZES, o CC, e comprende due passaggi principali. In primo luogo, le NSC o OPC vengono "rimosse" dal tessuto tramite iniezione endovenosa di un "cocktail di rilascio" contenente neuraminidasi, una tossina che induce la denudazione della parete ventricolare, un anticorpo bloccante l'integrina-β1 e il fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2). Il cocktail viene iniettato stereotassicamente bilateralmente all'interno dei ventricoli laterali. Se l'uso previsto è l'isolamento delle NSC, vengono prese di mira le aree rostrali dei ventricoli laterali. Se l'obiettivo è quello di isolare gli OPC in modo più puro, il cocktail viene iniettato caudalmente nell'area della fimbria dell'ippocampo. In una seconda fase di "raccolta", vengono eseguite biopsie liquide di liquido cerebrospinale (CSF) dalla cisterna magna di ratti anestetizzati senza la necessità di un'incisione. La biopsia liquida viene miscelata con il terreno di coltura NSC e può essere mantenuta a 4 °C fino alla placcatura.

Protocollo

L'allevamento, il mantenimento e le procedure sperimentali degli animali sono stati condotti in conformità con l'UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986, autorizzato dal Ministero dell'Interno, e con il Decreto Presidenziale 56/2013 della Repubblica Ellenica, esaminati dagli Organi di Revisione Etica e per il Benessere degli Animali delle Università di Cambridge e Patrasso, nonché approvati e controllati dal Comitato locale per la cura e l'uso degli animali della Prefettura (Numero di protocollo: 5675/39/18-01-2021). Sono stati utilizzati ratti maschi e femmine di Sprague-Dawley, Wistar e Long-Evans, con età variabile tra i 2 e i 4 mesi e con peso corporeo compreso tra 150 g e 250 g. Il protocollo è riepilogato graficamente nella Figura 1.

1. Rilascia la preparazione del cocktail

NOTA: Preparare fresco il giorno della procedura e conservare sul ghiaccio. Le quantità sono indicate per 2 μL da iniettare per via endovenosa in ciascun ventricolo laterale. Preparare 1 μL aggiuntivo per ogni iniezione prevista.

1. Preparare 0,5 μL di neuraminidasi 500 mU da Clostridium perfringens (Clostridium welchii).
   NOTA: Conservare in formato 1 U/μL diluito in acqua sterile a -20 °C. Altri tipi di neuraminidasi non sono stati testati.
2. Preparare 1 μL contenente 1 μg di anticorpo bloccante l'integrina-β1.
   NOTA: Conservare a 4 °C.
3. Preparare 0,5 μL contenenti 0,5 μg di fattore di crescita basico dei fibroblasti (FGF-basico umano ricombinante).
   NOTA: Conservare in formato 1 μg/μL diluito in acqua sterile a -20 °C.

2. Iniezione del cocktail di rilascio

NOTA: L'intero processo può essere eseguito entro 20 minuti. Avere cura di eseguire l'intervento chirurgico in condizioni asettiche. Pulire tutte le superfici con antisettico (ad es. perossido di idrogeno al 3% o al 6%). Utilizzare strumenti, guanti, camici e teli sterilizzati in autoclave o facilmente sterili.

1. Anestetizzare l'animale da esperimento mediante inalazione di isoflurano (2,5% per induzione e 2% per mantenimento). Confermare la profondità dell'anestesia controllando il riflesso corneale, la reazione agli stimoli (test di pizzicamento degli arti posteriori e della coda) e la modalità di respirazione.
   NOTA: Le procedure chirurgiche possono essere eseguite in anestesia generale indotta da anestesia iniettabile intraperitoneale (ad es. ketamina [40 mg/kg] e xilazina [10 mg/kg]). L'anestesia profonda è stata confermata controllando il riflesso corneale, la reazione agli stimoli (test di pizzicamento degli arti posteriori e della coda) e la modalità di respirazione.
2. Somministrare analgesia per via sottocutanea (ad es. 0,3 mg/mL di buprenorfina) dopo l'induzione dell'anestesia.
3. Montare il ratto sul telaio stereotassico.
4. Radere il pelo della testa con un rasoio e pulire la pelle con un antisettico, come una soluzione di iodio povidone al 10% e poi alcool. Applicare l'antisettico tre volte utilizzando tamponi di cotone sterili. Strofinare con movimenti circolari per 3-5 secondi ogni volta. Applicare un unguento per gli occhi per prevenire la secchezza.
5. Fai un'incisione di 2 cm nella pelle della testa lungo la linea mediana usando un bisturi sterile.
6. Pulisci meticolosamente il cranio utilizzando tamponi sterili e soluzione fisiologica sterile.
7. Identificare il bregma utilizzando il bordo dell'ago di una siringa Hamilton da 10 μL montata sul dispositivo stereotassico. Impostare il bregma come "punto 0,0".
   NOTA: Il bregma è identificato come il punto di intersezione tra la sutura sagittale e quella coronale. Maggiori dettagli possono essere trovati nell'atlante del cervello dei ratti di Paxinos e Watson⁵.
8. Spostare il dispositivo alle coordinate anteroposteriore (AP) = 0,3 mm, laterale (L) = +1,2 mm (per puntare la SEZ) o AP = 1,5 mm, L = +2,0 mm (per mirare alla CC).
9. Praticare un foro di 1 mm utilizzando un trapano dentale.
   NOTA: Quando si perfora a mano, fare attenzione a non ferire la superficie corticale. L'emorragia non dovrebbe essere considerevole. Eliminare il sangue con soluzione fisiologica e applicare pressione per fermare l'emorragia più persistente.
10. Caricare 4 μL del cocktail di rilascio nella siringa Hamilton da 10 μL.
11. Abbassare l'ago (preferibilmente smussato o conico) della siringa Hamilton in modo da entrare in contatto con la dura.
12. Inserire l'ago alla profondità desiderata (D = 3,5 mm).
    NOTA: Versare soluzione fisiologica sulla superficie della dura per mantenere il tessuto idratato.
13. Infondere 2 μL del cocktail di rilascio alla velocità di 1 μL/min.
14. Lasciare l'ago in posizione per altri 2 minuti prima di un recupero lento per evitare che il cocktail di rilascio emerga.
15. Ripetere i passaggi 2.8-2.14 per l'altro emisfero alle coordinate AP = 0.3 mm, L = -1.2 mm (per puntare alla SEZ) o AP = 1.5 mm, L = -2.0 mm (per puntare al CC).
16. Suturare l'incisione con nylon 5-0 (diametro 0,1 mm) e pulire l'area suturata con antisettico.
17. Rimuovere la maschera che fornisce l'anestetico e trasferire l'animale nell'area di monitoraggio post-operatoria.
    NOTA: Il recupero dall'anestesia e il mantenimento dell'incubito devono avvenire entro 5-10 minuti e il recupero completo (comportamento normale) entro 25 minuti.
    1. Monitorare attentamente il recupero (movimento vivido e ininterrotto, accesso frequente all'acqua) in uno spazio ben riscaldato (24-25 °C), tranquillo e senza lettiera di piccole particelle, che possono ostruire le vie aeree. Riportare l'animale in compagnia dei suoi compagni di gabbia (non a nuovi animali) solo dopo aver confermato il completo recupero.
    2. Monitorare l'animale presso la struttura di mantenimento per almeno 48 ore dopo l'intervento. Affrontare i segni di dolore (occultamento della testa, postura anomala della testa o del corpo, ipersensibilità e ipereccitabilità alla manipolazione) somministrando analgesia (ad es. 0,3 mg/mL di buprenorfina, per via sottocutanea). Indirizzare gli animali con pelo scolorito o eretto al veterinario responsabile.

3. Biopsia liquida del liquido cerebrospinale (CSF)

NOTA: L'intero processo può essere eseguito entro 10 minuti. La biopsia liquida qui descritta viene eseguita 3 giorni dopo l'iniezione del cocktail di rilascio, ma può essere eseguita esattamente allo stesso modo ogni volta che è necessario. Avere cura di eseguire l'intervento chirurgico in condizioni asettiche. Pulire tutte le superfici con antisettico (ad es. perossido di idrogeno al 3% o al 6%). Utilizzare strumenti, guanti, camici e teli sterilizzati in autoclave o facilmente sterili.

1. Anestetizzare l'animale mediante inalazione di isoflurano (2,5% per induzione e 2% per mantenimento). Confermare la profondità dell'anestesia controllando la cornea
   il riflesso, la reazione agli stimoli (test di pizzicamento degli arti posteriori e della coda) e la modalità di respirazione.
   NOTA: Le procedure chirurgiche possono essere eseguite in anestesia generale indotta da anestesia iniettabile intraperitoneale (ad es. ketamina [40 mg/kg] e xilazina [10 mg/kg]). Tuttavia, questo non è consigliabile in quanto la procedura è breve, soprattutto se le biopsie verranno eseguite più volte in giorni consecutivi.
2. Somministrare analgesia per via sottocutanea (ad es. 0,3 mg/mL di buprenorfina) dopo l'induzione dell'anestesia.
3. Montare l'animale da esperimento sul telaio stereotassico. Utilizzare le barre auricolari per fissare la testa senza ostacolare il movimento rotatorio verso la parte anteriore e posteriore.
4. Stabilizzare la testa con un angolo di 40° verso il basso in modo da ottenere una buona estensione della parte posteriore del collo.
   NOTA: Un modo per farlo è utilizzare la barra della bocca del dispositivo⁶.
5. Radere il pelo nella zona del collo usando un rasoio e pulire la pelle con un antisettico, come una soluzione di iodio povidone al 10% e poi alcool. Applicare l'antisettico tre volte utilizzando tamponi di cotone sterili. Strofinare con movimenti circolari per 3-5 secondi ogni volta.
6. Con la punta del dito, trova l'area depressiva a forma di rombo posizionata tra la protuberanza occipitale e la colonna vertebrale dell'atlante⁶.
7. Disegna un punto (ad esempio, usando un pennarello).
8. Fissare una siringa da 1 mL o 0,5 mL sul telaio stereotassico.
   NOTA: Si consiglia di utilizzare siringhe con aghi non staccabili in quanto producono una migliore aspirazione e hanno un volume morto inferiore.
9. Portare l'ago nel punto di contatto con la pelle in corrispondenza del punto di riferimento.
10. Con un paio di pinze, sollevare la pelle abbassando la siringa attraverso gli strati cutanei.
11. Recuperare leggermente lo stantuffo per generare una pressione negativa nella siringa.
12. Ricominciare a immergere l'ago molto lentamente fino a quando nella siringa non compare del liquido cerebrospinale.
13. Sistemare l'ago in questa posizione e consentire il lento flusso del liquido cerebrospinale.
    NOTA: L'ago può essere abbassato o sollevato leggermente se il flusso del liquido cerebrospinale è molto lento.
14. Iniziare a rimuovere il liquido cerebrospinale lentamente (con incrementi di 40 μL/min) fino a 120 μL.
15. Recuperare lentamente la siringa.
16. Somministrare per via intraperitoneale 1 ml di siero normale per supportare il rifornimento di liquidi dell'animale da esperimento.
17. Miscelare la biopsia liquida (CSF) con 400 μL di terreno NSC e mantenere la provetta per microcentrifuga a 4 °C fino al successivo utilizzo.
    NOTA: Le biopsie liquide devono essere processate entro 3 ore se non congelate.
18. Rimuovere la maschera che fornisce l'anestetico e trasferire l'animale nell'area di monitoraggio post-operatoria.
    NOTA: Il recupero dall'anestesia e il mantenimento dell'incubito devono avvenire entro 5-10 minuti e il recupero completo (comportamento normale) entro 25 minuti.
    1. Monitorare attentamente il recupero (movimento vivido e ininterrotto, accesso frequente all'acqua) in uno spazio ben riscaldato (24-25 °C), tranquillo e senza lettiera di piccole particelle, che possono ostruire le vie aeree. Restituire l'animale alla compagnia dei suoi compagni di gabbia (non ai nuovi animali) solo dopo che è stato confermato il completo recupero.
    2. Monitorare l'animale presso la struttura di mantenimento per almeno 48 ore dopo l'intervento. Se si osservano segni di dolore (occultamento della testa, postura anomala della testa o del corpo, ipersensibilità e ipereccitabilità alla manipolazione), somministrare analgesia (ad es. 0,3 mg/mL di buprenorfina per via sottocutanea). Indirizzare gli animali con pelo scolorito o eretto al veterinario responsabile.

4. Processamento di tessuti per immunofluorescenza

1. L'eutanasia dell'animale mediante infusione intracardiaca di 20 mL di soluzione fisiologica ghiacciata, seguita da 50 ml di paraformaldeide ghiacciata al 4% (PFA; in soluzione salina tamponata con fosfato) [PBS] di pH = 7,4).
2. Sezionare il tessuto cerebrale.
   1. Separa la testa dal corpo usando le forbici per fare un taglio nella zona cervicale. Usa le forbici per rimuovere la pelle e poi taglia l'osso del cranio lungo la linea mediana sagittale, con le punte delle forbici rivolte verso l'alto per non danneggiare il tessuto cerebrale. Cerca di continuare a tagliare il più possibile, superando la linea mediana coronale.
   2. Utilizzare le pinze per rimuovere le ossa, partendo dalle ossa sopraoccipitali e parietali e infine dalle ossa frontali.
   3. Una volta che il tessuto cerebrale è stato rivelato, usa la pinza o una spatola per sollevarlo dal cranio. Per facilitare questo, taglia i nervi alla base del cervello e i bulbi olfattivi, se non lo desideri.
3. Post-fissare il tessuto per una notte in PFA al 2% a 4 °C.
4. Crioproteggere il tessuto con saccarosio al 30% (in PBS) per almeno 48 ore a 4 °C fino a quando il tessuto non affonda sul fondo.
5. Congelare il tessuto a -80 °C.
6. Tagliare il tessuto cerebrale in sezioni coronali spesse 14 μm con un criostato.
7. Eseguire la colorazione in immunofluorescenza utilizzando protocolli standard ^3,7
   1. Incubare le sezioni con tampone bloccante (3% albumina sierica bovina [BSA], 0,1% Triton X-100, in PBS) per 2 ore a temperatura ambiente.
   2. Eseguire il recupero dell'antigene (ebollizione per 15 minuti in tampone citrato 10 mM, pH = 6,0, utilizzando barattoli di vetro).
      NOTA: Questo passaggio è facoltativo, ma necessario per gli antigeni nucleari.
   3. Portare a temperatura ambiente e incubare con anticorpi primari contro la proteina acida fibrillare gliale (GFAP), la doppia cortina (Dcx), S100β e la β-catenina (vedere la tabella dei materiali) nel tampone bloccante per una notte a 4 °C.
   4. Incubare per 2 ore con anticorpi secondari in PBS con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per la controcolorazione nucleare a temperatura ambiente (vedere la tabella dei materiali).
   5. Montare i vetrini coprioggetti.

5. Processamento di cellule isolate per immunofluorescenza

1. Placcare le cellule in piastre a 96 pozzetti compatibili per la microscopia, rivestite con poli-D-lisina (100 μg/mL).
2. Fissare le celle in PFA ghiacciato al 2% per 10 minuti e lavarle 3 volte con PBS.
3. Eseguire l'immunofluorescenza utilizzando le procedure standard^3,7 per PDGFRα, GFAP^, Dcx, SOX2 e ID3 (vedere la tabella dei materiali).
4. Tenere le celle in PBS + NaN₃ (0,1%) a 4 °C al buio.

6. Microscopia e analisi delle immagini

1. Acquisisci immagini utilizzando l'epifluorescenza o la microscopia confocale ed esegui la conta cellulare utilizzando strumenti software standard per l'analisi delle immagini, come i contatori di cellule.

Risultati

Rilascio e raccolta di NSC
Le NSC della ZES sono separate dal liquido cerebrospinale solo dal monostrato di cellule ependimali, sebbene rimangano in contatto diretto con il contenuto ventricolare attraverso processi monociliati intercalanti ^8,9. La neuraminidasi agisce in modo specifico sulle cellule ependimali attraverso la scissione dei residui di acido sialico e può indurre la denudazione della parete ventricolare. Questo porta al raggruppamento dei neuroblasti sulla superficie del ventricolo^10,11. Inoltre, è stato osservato un flusso di neuroblasti nel liquido cerebrospinale dopo l'iniezione in i.c.v. di un anticorpo bloccante l'integrina-β1, probabilmente a causa dell'allentamento delle giunzioni cellulari inter-ependimali¹². Queste osservazioni hanno portato allo sviluppo di un protocollo che consente l'isolamento delle cellule staminali e progenitrici del cervello attraverso la compromissione controllata dell'integrità delle pareti del ventricolo laterale. In una prima fase, il rilascio dal parenchima e il successivo flusso di NSC o OPC all'interno del liquido cerebrospinale sono indotti tramite iniezione endovenosa del cocktail di rilascio. Il cocktail viene iniettato stereotassicamente a una velocità di 1 μL/min, bilateralmente (2 μL per iniezione) nei ventricoli laterali (coordinate che mirano alle NSC SEZ: AP = 0,3 mm, L = ± 1,2 mm, D = 3,5 mm; coordinate che puntano alle CC OPC: AP = 1,5 mm, L = ± 2 mm, D = 3,5 mm). La seconda fase ("raccolta") prevede l'esecuzione di biopsie liquide del liquido cerebrospinale dalla cisterna magna. I ratti devono essere anestetizzati e la biopsia può essere eseguita con siringhe da 1 ml. L'uso del dispositivo stereotassico consente un successo quasi completo nel recupero di circa 100 μL di liquido cerebrospinale, senza la necessità di incisioni. La biopsia liquida viene aggiunta al terreno di coltura ghiacciato e viene mantenuta a 4 °C fino alla placcatura per <3 ore (il terreno di coltura NSC contiene terreno Eagle modificato di Dulbecco [DMEM], integratore di B27 [2%], integratore di N2 [1%], FGF2 [20 ng/mL] e fattore di crescita epidermico [EGF; 20 ng/mL]).

Esame istologico dell'area periventricolare dopo l'iniezione del cocktail di rilascio
Una prima coorte di esperimenti ha rivelato che quando si iniettano più di 3 μL di liquido, i ventricoli potrebbero essere danneggiati a causa di lesioni meccaniche non specifiche (Figura 2B,C). L'iniezione lenta di 2 μL di cocktail di rilascio ha portato alla comparsa di cluster di neuroblasti immunopositivi Dcx sulla superficie ventricolare. Questi ammassi sono rimasti visibili anche a 8 mesi dall'iniezione (Figura 2D). Poiché il metodo era destinato a studi longitudinali, finalizzati al follow-up a lungo termine degli animali, è stato valutato il danno tissutale causato dal cocktail di rilascio. L'immunocolorazione è stata eseguita su sezioni cerebrali criostatiche spesse 14 μm per marcatori di cellule ependimali, come S100β e β-catenina¹³, ed è stata valutata l'integrità complessiva dello strato ependimale. I siti di denudazione dello strato ependimale erano presenti solo in prossimità del livello rostrocaudale delle iniezioni, con una graduale diminuzione delle perturbazioni dello strato ependimale rilevate nelle aree più posteriori e più anteriori della ZES (Figura 2E,F) e divenendo assenti dopo una distanza di ±2 mm dal sito di iniezione. I risultati sopra menzionati mostrano che la denudazione parziale dello strato ependimale causata dall'iniezione endovenosa del cocktail di rilascio è focale, trattenuta in prossimità del sito di iniezione, e lascia intatto il resto dello strato ependimale periventricolare.

Profilo del marcatore e comportamento in vitro delle cellule raccolte
Successivamente, sono stati valutati il comportamento in vitro e il profilo marcatore delle cellule isolate tramite il protocollo di mungitura. La resa cellulare media di ogni biopsia liquida è di circa 300 ± 45 cellule (per biopsia di 100 μL)⁷. Le biopsie di mungitura hanno portato a colture NSC con un potenziale di passaggio medio di 3,17 ± 0,45. Le cellule isolate da ratti iniettati con soluzione salina potrebbero essere passate in media 1,92 ± 0,76 volte; al contrario, quelli isolati tramite mungitura hanno raggiunto addirittura nove passaggi (p = 0,038, test t) (Figura 3A)⁷. La capacità media di passaggio delle colture standard post-mortem derivate da neurosfera SEZ è superiore a 12 passaggi nelle nostre mani. Poiché è stato dimostrato che il potenziale di espansione in vivo delle NSC ZES, come rivelato dagli esperimenti di mappatura del destino cellulare in vivo ¹⁴, è limitato, la mungitura produce cellule con un comportamento in vitro significativamente diverso da quello delle cellule nelle colture standard, anche se molto più vicino al comportamento delle NSC endogene. Le cellule raccolte sono state piastrate su pozzetti rivestiti di poli-D-lisina, dove sono cresciuti sia come monostrati aderenti che più raramente come neurosfere (Figura 3B). Le cellule appena isolate (raccolte 3 giorni dopo l'iniezione e fissate 24 ore dopo la placcatura) che erano immunopositive per il marcatore astrogliale GFAP erano anche immunopositive per ID3, un marcatore di quiescenza, e avevano la caratteristica per la morfologia bipolare del NSC (Figura 3C). Inoltre, come riportato in precedenza⁷, un confronto immunocitochimico più dettagliato di cellule derivate da biopsia e di cellule derivate da post-mortem degli stessi animali, a 3 giorni dall'iniezione (alla ricerca di astrociti GFAP+, neuroblasti Dcx+, progenitori oligodendrociti PDGFRa+ e cellule SOX2+ della linea neurale) ha mostrato che il profilo delle cellule raccolte era simile a quello delle cellule SEZ endogene (Figura 3D). In particolare, quando le cellule derivate dalla biopsia e dai tessuti sono state confrontate in condizioni diverse (ad esempio, iniezione di un cocktail di rilascio con e senza FGF2), è stato riscontrato che il fattore di crescita ha provocato un concomitante e significativo aumento della presenza di cellule SOX2+, nonché una significativa diminuzione della presenza di neuroblasti Dcx+ in entrambi i campioni (Figura 3D). Questi dati hanno confermato che qualsiasi cambiamento che appare nel profilo delle popolazioni endogene di NSC si rispecchia nei campioni di cellule generate dalla mungitura.

Figura 1: Riepilogo grafico della mungitura. Una sezione coronale di un emisfero cerebrale con i principali punti di riferimento anatomici (il ventricolo laterale, il corpo calloso sovrastante e la commessura anteriore sottostante [tratti di sostanza bianca in grigio] e la zona subependimale alle pareti laterali [in blu]). Il cocktail di rilascio viene iniettato nel ventricolo laterale, portando alla compromissione dell'integrità del tessuto e al rilascio di cellule staminali neurali cerebrali postnatali nel liquido cerebrospinale, da cui possono essere raccolte tramite biopsie liquide. Abbreviazioni: SEZ = zona subependimale; LV = ventricolo laterale; liquido cerebrospinale = liquido cerebrospinale; pbNSCs = cellule staminali neurali cerebrali postnatali; β1-int = integrina beta1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Valutazione istologica degli effetti delle iniezioni in c.v. (A-D) Immagini a basso ingrandimento della metà dorsale del ventricolo laterale dopo immunocolorazione per Dcx (in rosso, per contrassegnare i neuroblasti). (A) Il semplice inserimento di una siringa di Hamilton per via endovenosa non disturba la citoarchitettura della ZES, mentre l'iniezione per via endovenosa di 10 mL (velocità di infusione di 1 mL/min) provoca gravi danni alla parete ventricolare indipendentemente dal suo contenuto. (B) soluzione salina e (C) cocktail di rilascio. (D) L'iniezione di 2 μL del cocktail di rilascio porta ad una compromissione controllata della parete ventricolare, osservata anche a 8 mesi dall'intervento. I dettagli ad ingrandimento più elevato della parete della ZES a 7 e 14 giorni dopo l'iniezione sono mostrati rispettivamente in (E) e (F). C'è una struttura disorganizzata, con i neuroblasti Dcx+ (in verde) che riposano sulla superficie della parete e le altre cellule della nicchia (Sox2+, in bianco) che riposano più in profondità. Il tessuto periventricolare è danneggiato a livello rostrocaudale dell'iniezione a 2 mesi (in G), mentre il tessuto è intatto a livello più caudale (in H) nello stesso animale. La parete ventricolare viene valutata mediante immunocolorazione per i marcatori ependimali S100β e β-catenina. Il dettaglio dell'architettura tipica della parete è mostrato in (I). La colorazione nucleare viene eseguita utilizzando DAPI (mostrato in blu). Barre di scala = 300 μm (A-C,G,H, inserti), 150 μm (D), 30 μm (E,F) e 50 μm (I). Questa figura è modificata da McClenahan et ^al.13. Abbreviazioni: SEZ = zona subependimale; i.c.v = intracerebroventricolare; Dcx = doppia cortina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Valutazione delle cellule isolate tramite mungitura. (A) Grafico che mostra il numero massimo di passaggi ottenuti per campione di biopsia liquida da animali iniettati con soluzione salina (barre grigie, totale di 12 campioni) o dopo la mungitura (barre nere, totale di 29 campioni, cocktail di rilascio con neuraminidasi e anticorpo bloccante l'integrina-β1). (B) Immagine rappresentativa al microscopio confocale di cellule primarie ottenute tramite mungitura, a 3 giorni dall'iniezione, immunocolorate contro GFAP e ID3. (C,D) Immagini in campo chiaro di cellule isolate 3 giorni dopo l'iniezione, piastrate su pozzetti rivestiti di poli-D-lisina e lasciate crescere in mezzo di proliferazione NSC per 7 giorni. (E) Grafico che mostra il profilo del tipo cellulare delle cellule isolate tramite mungitura della ZES e della popolazione endogena di NSC della ZES dagli stessi animali da esperimento. Le frazioni SOX2+ e Dcx+ sono aumentate e diminuite in modo significativo, rispettivamente, dopo la co-iniezione di FGF2. (Analisi ANOVA unidirezionale per marcatore, seguita da analisi post hoc; n = 4-6 animali per gruppo sperimentale.) Barre di scala = 100 μm (C,D) e 10 μm (B). Questa figura è modificata da McClenahan et ^al.13. Abbreviazioni: SEZ = zona subependimale; DPI = giorni dopo l'iniezione; NSC = cellule staminali neurali; Dcx = doppia cortina; GFAP = proteina acida fibrillare gliale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Le cellule staminali e progenitrici sono relativamente scarse nel tessuto cerebrale dei mammiferi. Inoltre, le NSC sono localizzate in aree inaccessibili per biopsie facili e sicure (pareti ventricolari, ippocampo). Pertanto, l'unico modo per lavorare sperimentalmente con tali cellule, finora, è stato il loro isolamento post mortem. Un metodo che consente la raccolta singola o ripetuta di NSC e OPC da ratti vivi, chiamato mungitura, è descritto qui passo dopo passo. Il metodo si basa su due caratteristiche chiave: i) le NSC o OPC sono separate dal monostrato di cellule ependimali dal liquido cerebrospinale, che scorre all'interno del sistema ventricolare del cervello; ii) le cellule ependimali e i progenitori neurali mantengono il contatto tra loro e con altri tipi di cellule vicine tramite integrine. Pertanto, il cocktail di rilascio iniettato in aree specifiche dei ventricoli per consentire il disimpegno delle NSC, o OPC, dal parenchima cerebrale contiene neuraminidasi, una tossina che prende di mira e uccide specificamente le cellule ependimali^10,11 e un anticorpo bloccante l'integrina-β1. Contiene anche FGF2, in quanto questo fattore di crescita è essenziale per la sopravvivenza e il mantenimento delle NSC nella nicchia e nella coltura^15,16. E'^{stato precedentemente dimostrato} 7 che questo protocollo è ben tollerato dagli animali; in questo rapporto, viene inoltre confermato che il danno alle cellule ependimali, indotto dal cocktail di rilascio come prerequisito per il rilascio di NSC/OPC nel liquido cerebrospinale, è limitato intorno al livello rostrocaudale dell'iniezione. Questo è stato di fondamentale importanza, poiché il protocollo dovrebbe preservare la funzione omeostatica del cervello, compresa la nicchia delle cellule staminali stesse, e non dovrebbe compromettere il benessere a lungo termine degli animali. L'iniezione stereotassica del cocktail di rilascio è di lieve gravità e non ha mai provocato la morte. Inoltre, l'esecuzione di biopsie liquide dalla cisterna magna è una procedura rapida e minimamente invasiva che può essere ripetuta più volte consecutivamente.

È importante sottolineare che i campioni di NSC isolati tramite mungitura riflettono da vicino il pool endogeno di NSC. Il profilo dei progenitori della ZES può essere influenzato dall'iniezione i.c.v. di FGF2. Quando ciò accade, il profilo delle cellule derivate dalla mungitura viene influenzato allo stesso modo. Inoltre, precedenti lavori sperimentali hanno indicato che le NSC isolate tramite mungitura della ZES hanno un limitato potenziale di auto-rinnovamento, un comportamento simile a quello delle NSC endogene come rivelato con strategie in vivo, transgeniche, di destino cellulare^14,17. Le NSC cerebrali postnatali sono mantenute in quiescenza, raramente transitano verso l'attivazione mitotica per generare progenie neurogena e gliogenica^18,19,20. In questo caso, viene fornita la prova che la frazione di cellule derivate dalla mungitura che esprimono GFAP e che dovrebbero includere NSC in buona fede co-esprimono ID3, un marcatore di NSC quiescenti²¹. La presenza arricchita di NSC quiescenti, che vengono poi piastrate nel terreno NSC tipicamente utilizzato per la coltura di NSCs isolate post-mortem, sembra limitare il potenziale di espansione delle NSC raccolte (ad esempio, un processo cruciale se le cellule dovessero essere utilizzate per trapianti autologhi). Questo perché questi terreni sono progettati specificamente per la sopravvivenza e l'espansione mitotica delle NSC attivate; pertanto, la generazione di protocolli che consentano l'attivazione mitotica efficiente e rapida delle NSC quiescenti aumenterà il valore e la portata d'uso della mungitura.

Nel complesso, questi dati indicano che la mungitura consente il campionamento di NSC e OPC cerebrali postnatali (a seconda del livello rostrocaudale di iniezione del cocktail di rilascio) da ratti vivi. Questo lavoro indica la fattibilità di condurre biopsie liquide successive nello stesso animale, anche a lunghi periodi di tempo significativi dopo l'iniezione del cocktail di rilascio (quindi, per pianificare ed eseguire studi sperimentali longitudinali), poiché i neuroblasti rimangono raggruppati sulle pareti ventricolari anche a 8 mesi dall'iniezione. Tali metodi sono di fondamentale importanza perché consentono di studiare gli eventi all'interno dei singoli animali con conseguente riduzione del rumore biologico generato dalla variazione fisiologica. Questo, a sua volta, porta a una maggiore precisione e all'implementazione dei principi delle "3R" (sostituzione, riduzione e perfezionamento). I futuri passi chiave per il miglioramento del metodo saranno la determinazione del numero massimo e del periodo di tempo in cui le biopsie liquide possono essere eseguite dopo una procedura di rilascio, anche se l'esecuzione di ulteriori procedure di rilascio dovrebbe essere fattibile, se necessario.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
release
β Anticorpo bloccante 1-integrina	BD Biosciences	#555002	purificato NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Qualsiasi corpo con attività bloccante dovrebbe essere appropriato.
Neuraminidasi da Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Le neuraminidasi provenienti da altre fonti (ad esempio, da Vibrio cholerae) non sono state testate.
FGF-basico umano ricombinante (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	mantenuto come 1 μ g/μ L stock, diluito in acqua sterile a -20 ° C
Procedure chirurgiche
10 µ Siringa a L	Hamilton	#80330	Modello 701 RN, ago rimovibile piccolo, calibro 26s, 2 pollici, tipo di punta 2
Siringhe da insulina BD Micro-fine da 1 mL BD	biosciences	04085-00	29 G x 12,7 mm
TAGLIO BETADINE. SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU:
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenofina 0,3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
monitoraggio omeoretermico	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1.000 mg/g vapore per inalazione, liquido	Vetpharma Salute degli animali	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU:	Ketamina 100 mg/mL
Sutura in nylon, Ethilon	Ethicon	D9635	Trasparente, misura 5-0
Trimmer chirurgici senza fili ricaricabili	Stoelting	Articolo: 51472
Lame per bisturi, sterili	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.; 8-pollici Tamponi	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotassico ad alta velocità	trapano Foredom	1474w/o1464
Stoelting' s Kit di strumenti stereotassici	Stoelting	Articolo: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xilazina, 25 mL<
strong>Manipolazione di tessuti e cellule e immunocolorazioni
96 pozzetti piastre appropriate per microscopia	Greiner	#655866	Supplemento
	B27 per micropiastre a stella ScreenThermoFisher Scientific	A1486701
Albumina sierica bovina (BSA)	Merck	P06-1391100	Frazione V, shock termico
Citrato	Merck	71497	Citrato di sodio monobasico
Criostato	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Colorazione nucleare, Diluizione: 1/1.000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	Alto glucosio, piruvato
d'asino anti-capra	Biotium	20016 o 20106 o 20048	Diluizione: 1/1.000
asino anti-topo	Biotium	20014 o 20105 o 20046	Diluizione: 1/1.000
asino anti-coniglio	Biotium	20015 o 20098 o 20047	Diluizione: 1/1.000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (o bFGF)	Peprotech	100-18B
capra anti-GFAP	Abcam	ab53554	Diluizione: 1/500
capra anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Diluizione: 1/200
topo anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Diluizione: 1/200
topo anti-S100β	Sigma	S2532	Diluizione: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Terreno di montaggio
Integratore di N2	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1,0 mg/mL
di coniglio anti-Doublecortina (DCX)	Abcam	ab18723	Diluizione: 1/500
coniglio anti-PDGFR&alfa;	Abcam	ab51875	Diluizione: 1/200
coniglio anti-β- catenina	Abcam	ab16051	Diluizione: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopia e analisi delle immagini
Microscopio confocale	Leica	SP6 e SP8
Analisi delle immagini	NIH, USA	ImageJ
Analisi delle immagini	Leica	LasX