La contrattilità dell'actomiosina svolge un ruolo importante nella morfogenesi cellulare e tissutale. Tuttavia, è difficile manipolare la contrattilità dell'actomiosina in vivo in modo acuto. Questo protocollo descrive un sistema optogenetico che inibisce rapidamente la contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 negli embrioni di Drosophila , rivelando l'immediata perdita di tensione epiteliale dopo l'inattivazione dell'actomiosina in vivo.
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Articolo metodologico
Inibizione optogenetica della contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 accoppiata alla misurazione della tensione epiteliale negli embrioni di Drosophila
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le forze contrattili generate dall'actina e dalla miosina II non muscolare ("contrattilità dell'actomiosina") sono fondamentali per i cambiamenti morfologici di cellule e tessuti su più scale di lunghezza, come la divisione cellulare, la migrazione cellulare, il ripiegamento epiteliale e la morfogenesi ramificata. Una comprensione approfondita del ruolo della contrattilità dell'actomiosina nella morfogenesi richiede approcci che consentano la rapida inattivazione dell'actomiosina, che è difficile da ottenere utilizzando approcci genetici o farmacologici convenzionali. Il protocollo presentato dimostra l'uso di un sistema di dimerizzazione optogenetica basato su CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, per inibire la contrattilità dell'actomiosina negli embrioni di Drosophila con precisi controlli temporali e spaziali. In questo sistema, CRY2 è fuso con la forma negativa dominante di Rho1 (Rho1DN), mentre CIBN è ancorato alla membrana plasmatica. La dimerizzazione mediata dalla luce blu di CRY2 e CIBN provoca una rapida traslocazione di Rho1DN dal citoplasma alla membrana plasmatica, dove inattiva l'actomiosina inibendo Rho1 endogeno. Inoltre, questo articolo presenta un protocollo dettagliato per l'accoppiamento dell'inattivazione dell'actomiosina mediata da Opto-Rho1DN con l'ablazione laser per studiare il ruolo dell'actomiosina nella generazione di tensione epiteliale durante la formazione del solco ventrale di Drosophila . Questo protocollo può essere applicato a molti altri processi morfologici che coinvolgono la contrattilità dell'actomiosina negli embrioni di Drosophila con modifiche minime. Nel complesso, questo strumento optogenetico è un potente approccio per analizzare la funzione della contrattilità dell'actomiosina nel controllo della meccanica tissutale durante il rimodellamento dinamico dei tessuti.
Introduzione
La contrattilità dell'actomiosina, la forza contrattile esercitata dalla miosina II non muscolare (di seguito «miosina») sulla rete di F-actina, è una delle forze più importanti nel modificare la forma delle cellule e nel guidare la morfogenesi a livello tissutale 1,2. Ad esempio, l'attivazione della contrattilità dell'actomiosina nel dominio apicale delle cellule epiteliali provoca una costrizione apicale, che facilita una varietà di processi morfogenetici, tra cui il ripiegamento epiteliale, l'estrusione cellulare, la delaminazione e la guarigione delle ferite 3,4,5,6,7
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Protocollo
1. Impostazione dell'incrocio genetico e preparazione del bicchiere per la raccolta degli ovuli
- Selezionare le femmine (vergini) della linea optogenetica UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) su un pad di CO2 sotto stereomicroscopio e allestito un incrocio con mosche maschi della linea driver GAL4 materna 67 Sqh-mCherry; 15 E-caderina-GFP.
NOTA: Il 67 e il 15 stanno per Tubulina-GAL4 materna inserita rispettivamente nel secondo (II) e nel terzo (III) cromosomi52. La linea GAL4 utilizzata in questo protocollo esprime anche la catena leggera regolatrice della miosina marcata con mCherry Sqh (Spag....
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Risultati
Negli embrioni non stimolati sottoposti a costrizione apicale, Sqh-mCherry si è arricchito nella regione medioapicale delle cellule mesodermiche ventrali, mentre CRY2-Rho1DN-mCherry era citosolico (Figura 1A). L'ablazione laser all'interno del dominio di costrizione ha portato a un rapido rinculo del tessuto lungo l'asse A-P (Figura 1B,C). Negli embrioni stimolati, il segnale CRY2-Rho1DN-mCherry è diventato localizzato sulla membrana plasmatica,.......
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Discussione
Questo protocollo descriveva l'uso combinato dell'optogenetica e dell'ablazione laser per sondare i cambiamenti nella tensione tissutale immediatamente dopo l'inattivazione della contrattilità dell'actomiosina. Lo strumento optogenetico qui descritto sfrutta la forma negativa dominante di Rho1 (Rho1DN) per inibire in modo acuto la contrattilità endogena dell'actomiosina Rho1 e Rho1-dipendente. Una precedente caratterizzazione di Opto-Rho1DN nel contesto della formazione di solchi ventrali di Drosophila ha dimost.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che possa essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Ann Lavanway per il supporto all'imaging. Gli autori ringraziano il laboratorio Wieschaus e il laboratorio De Renzis per la condivisione dei reagenti e il Bloomington Drosophila Stock Center per gli stock di mosche. Questo studio è supportato da NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 e American Cancer Society Institutional Research Grant #IRG-82-003-33 a BH.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra con fondo in vetro da 35 mm | MatTek | P35G-1.5-10-C | Utilizzata per la preparazione dei campioni |
| Piastra Petri da 60 mm e 15 mm con coperchio | Falcon | 351007 | Utilizzata per la preparazione |
| dei campioni Panno nero per coprire il microscopio | Online | NA | Utilizzato per evitare la stimolazione luminosa indesiderata |
| Clorox Ultra Germicadal Bleach (8,25% ipoclorito di sodio) | VWR | 10028-048 | Utilizzato per la decorinazione degli embrioni |
| CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | Utilizzato per il set-up incrociato |
| ddH2O | NA | NA | Utilizzato per la preparazione dei campioni |
| Dumont Style 5 pinzette | VWR | 102091-654 | Utilizzato per la preparazione dei campioni |
| Strumento per ciglia (realizzato in zibellino rosso puro #2) | VWR | 22940-834 | Utilizzato per la preparazione dei campioni |
| FluoView (Software) | Olympus | NA | Utilizzato per l'acquisizione di immagini e la stimolazione optogenetica |
| Olio di alocarburi 27 | Sigma Aldrich | H8773-100ML | Utilizzato per la visualizzazione dello stadio embrionale |
| ImageJ/FIJI | NIH | NA | Utilizzato per l'analisi delle immagini |
| MATLAB | MathWorks | NA | Utilizzato per l'analisi delle immagini |
| Stereoscopio Nikon SMZ-745 | Nikon | NA | Utilizzato per la preparazione dei campioni |
| Microscopio multifotone Olympus FVMPE-RS con laser ultraveloci a doppia linea InSight DS per l'imaging multifotone simultaneo a doppia lunghezza d'onda, un obiettivo a immersione in acqua 25x/NA1.05 (XLPLN25XWMP2) e un'unità di stimolazione IR/VIS per fotoattivazione/stimolazione. Questo sistema è inoltre dotato di un filtro TRITC (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M) e un'unità di illuminazione a fluorescenza che emette luce bianca. | Olympus | NA | Utilizzato per l'acquisizione di immagini e la stimolazione optogenetica |
| SP Bel-Art Scatola di conservazione per congelatore in polipropilene da 100 posti (scatola nera a prova di luce per il trasferimento dei campioni) | VWR | 30621-392 | Utilizzato per evitare la stimolazione luminosa indesiderata |
| Schermo filtrante UV per FM1403 Fluores (schermo in plastica rosso-arancio) | Bolioptics | FM14036151 | Utilizzato per evitare la stimolazione |
| luminosa indesiderataLampada frontale VITCHELO V800 con luci LED bianche e rosse | Amazon | NA | Utilizzato per evitare stimoli luminosi indesiderati |
Riferimenti
- Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
- Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis.
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Ristampe e permessi
