L'espressione genica è regolata dalle interazioni dei promotori genici con gli elementi regolatori distali. Qui, descriviamo come basso input Capture Hi-C (liCHi-C) consenta l'identificazione di queste interazioni in tipi di cellule rare, che in precedenza non erano misurabili.
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Articolo metodologico
Un flusso di lavoro integrato per studiare l'architettura del genoma spazio-temporale centrata sul promotore in popolazioni cellulari scarse
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La trascrizione genica spaziotemporale è strettamente regolata da elementi regolatori distali, come potenziatori e silenziatori, che si basano sulla vicinanza fisica con i loro promotori genici bersaglio per controllare la trascrizione. Sebbene questi elementi regolatori siano facili da identificare, i loro geni bersaglio sono difficili da prevedere, poiché la maggior parte di essi sono specifici del tipo di cellula e possono essere separati da centinaia di kilobasi nella sequenza lineare del genoma, saltando altri geni non bersaglio. Per diversi anni, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) è stato il gold standard per l'associazione di elementi regolatori distali ai loro geni bersaglio. Tuttavia, PCHi-C si basa sulla disponibilità di milioni di cellule, vietando lo studio di popolazioni cellulari rare come quelle comunemente ottenute da tessuti primari. Per superare questa limitazione, è stato sviluppato Capture Hi-C (liCHi-C) a basso input, un metodo economico e personalizzabile per identificare il repertorio di elementi regolatori distali che controllano ciascun gene del genoma. liCHi-C si basa su un framework sperimentale e computazionale simile a PCHi-C, ma impiegando cambiamenti minimi del tubo, modificando la concentrazione e i volumi del reagente e scambiando o eliminando passaggi, rappresenta una perdita minima di materiale durante la costruzione della libreria. Collettivamente, liCHi-C consente lo studio della regolazione genica e dell'organizzazione spaziotemporale del genoma nel contesto della biologia dello sviluppo e della funzione cellulare.
Introduzione
L'espressione genica temporale guida la differenziazione cellulare e, in definitiva, lo sviluppo dell'organismo, e la sua alterazione è strettamente correlata a un'ampia pletora di malattie 1,2,3,4,5. La trascrizione genica è finemente regolata dall'azione di elementi regolatori, che possono essere classificati come prossimali (cioè promotori genici) e distali (ad esempio, potenziatori o silenziatori), questi ultimi sono frequentemente situati lontano dai loro geni bersaglio e interagiscono fisicamente con ....
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Protocollo
Per garantire una perdita minima di materiale, (1) lavorare con tubi e punte a basso legame del DNA (vedere la tabella dei materiali), (2) posizionare i reagenti sulla parete del tubo invece di introdurre la punta all'interno del campione e, (3) se possibile, mescolare il campione per inversione invece di pipettare il campione su e giù, e ruotare verso il basso in seguito per recuperare il campione.
1. Fissazione cellulare
- Cellule che crescono in sospensione
- Raccogli da 50.000 a un milione di cellule e mettile in un tubo da 1,5 ml a basso legame del DNA.
NOTA: I tipi di cellule utilizzat....
- Raccogli da 50.000 a un milione di cellule e mettile in un tubo da 1,5 ml a basso legame del DNA.
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Risultati
liCHi-C offre la possibilità di generare librerie di interattomi promotori di alta qualità e risoluzione con un minimo di 50.000 cellule53. Ciò si ottiene – oltre alla drastica riduzione dei volumi di reazione e all'uso di oggetti plastici a basso legame del DNA in tutto il protocollo – rimuovendo passaggi non necessari dal protocollo originale, in cui si verificano perdite significative di materiale. Questi includono la purificazione del fenolo dopo la reticolazione, la rimozione della biotina e .......
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Discussione
liCHi-C offre la capacità di generare librerie di interattomi promotori ad alta risoluzione utilizzando un framework sperimentale simile a PCHi-C ma con un numero di celle notevolmente ridotto. Ciò si ottiene notevolmente eliminando i passaggi non necessari, come la purificazione del fenolo e la rimozione della biotina. Nel classico protocollo Hi-C57 della legatura in-nucleo e nella sua successiva tecnica derivata PCHi-C, la biotina viene rimossa dai frammenti di restrizione non legati per evitare.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il resto dei membri del laboratorio Javierre per il loro feedback sul manoscritto. Ringraziamo il Programma CERCA, la Generalitat de Catalunya e la Fondazione Josep Carreras per il sostegno istituzionale. Questo lavoro è stato finanziato dal FEDER/Ministero spagnolo della Scienza e dell'Innovazione (RTI2018-094788-A-I00), dall'Associazione europea di ematologia (4823998) e dall'Associazione spagnola contro il cancro (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ è finanziato dal progetto Junior Leader della La Caixa Banking Foundation (LCF / BQ / PI19 / 11690001), LR è finanziato da una borsa di studio AGAUR FI (2019FI-B00017) e LT-D è finanziato da una borsa di studio FPI (P....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,4 mM Biotina-14-dATP | Invitrogen | 19524-016 | |
| 0,5 M EDTA pH 8,0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 1 M Tris pH 8,0 | Invitrogen | AM9855G | |
| 10x NEBuffer 2 | New England Biolabs | B7002S | Citato come tampone di restrizione 2 nel manoscritto |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 10x tampone di reazione DNA ligasi T4 | New England Biolabs | B0202S | |
| Soluzione di formaldeide al 16% (p/v), senza metanolo | Thermo Scientific | 28908 | |
| 20 mg/mL Albumina sierica bovina | New England Biolabs | B9000S | |
| 5 M NaCl | Invitrogen | AM9760G | |
| 5PRIME Phase Lock Gel Tubi luminosi | Qiuantabio | 2302820 | Per la purificazione fenolo-cloroformio nella sezione 4 (purificazione del DNA). Le provette in gel Phase Lock sono un tipo commerciale di provette appositamente progettate per massimizzare il recupero del DNA dopo la purificazione fenolo-cloroformio, evitando il trascinamento di contaminanti nella fase organica contenendo una resina di densità intermedia che si deposita tra la fase organica e quella acquosa e li isola. Le provette PLG devono essere centrifugate a 12.000 x g per 30 s prima dell'uso per garantire che la resina sia ben posizionata sul fondo della provetta |
| Adattatori e primer PCR per l'amplificazione della libreria | Tecnologie DNA integrate-Acquistate | come primer singoli con purificazione PAGE per | |
| raschiatori cellulari | Nunc | 179693 | O qualsiasi altra marca |
| Centrifuga (rotore ad angolo fisso per provette da 1,5 mL) | Qualsiasi marca | ||
| Pacchetto CHiCAGO R | 1.14.0 | ||
| Perle CleanNGS | CleanNA | CNGS-0050 | |
| dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Promega | U120A, U121A, U122A, U123A | O qualsiasi altra provetta DNA LoBind di qualsiasi altra marca |
| Eppendorf | 30108051 | 1,5 mL | |
| , 2 mL | Eppendorf | 30108078 | |
| DNA polimerasi I grande (Klenow) frammento 5000 unità/mL | New England Biolabs | M0210L | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 perline | Invitrogen | 65002 | Per il pull-down della biotina della libreria pre-catturata nella sezione 8 (pull-down della biotina) |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads | Invitrogen | 65602 | Per il pull-down della biotina della libreria post-catturata nella sezione 11 (pull-down della biotina e amplificazione PCR) |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 12321D | O qualsiasi altro magnete adatto per provette da 1,5 mlL |
| Etanolo assoluto | VWR | 20821.321 | |
| FBS, qualificato | Gibco | 10270-106 | O qualsiasi altra marca |
| Glycine | Fisher BioReagents | BP381-1 | |
| GlycoBlue Coprecipitante | Invitrogen | AM9515 | Utilizzato per la coprecipitazione del DNA nella sezione 4 (purificazione del DNA) |
| HiCUP | 0.8.2 | ||
| HindIII, 100 U/µ L | New England Biolabs | R0104T | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ML | |
| Klenow EXO- 5000 unità/mL | New England Biolabs | M0212L | |
| Puntali filtranti a bassa ritenzione ( 10 µ L, 20 & micro; L, 200 & micro; L e 1000 µ L) | ZeroTip | PMT233010, PMT252020, PMT231200 PMT252000 | |
| M220 Ultrasuoni focalizzati | Covaris | 500295 | |
| Micro TUBE AFA Fiber Tappo a scatto pre-fessurato 6 fiale da 16 mm | Covaris | 520045 | Per la sonicazione nella sezione 6 (sonicazione) |
| NheI-HF, 100 U/µ L | New England Biolabs | R3131M | |
| Acqua di biologia molecolare priva di nucleasi | Primer Sigma-Aldrich | W4502 | |
| PCR per controlli di qualità | Strisce integrate di DNA | Technologies-PCR | |
| e tappi | Agilent Technologies | 410022, 401425 | |
| Fenolo: Cloroformio: Alcool isoamilico 25:24:1, Saturo con 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Phusion Master Mix PCR ad alta fedeltà con tampone HF New | England Biolabs | M0531L | Per l'amplificazione della libreria nelle sezioni 9 (coda dATP, legatura dell'adattatore e amplificazione PCR) e 11 (pull-down della biotina e amplificazione PCR) |
| Cocktail di inibitori della proteasi (senza EDTA) | Roche | 11873580001 | |
| Proteinasi K, ricombinante, Grado PCR | Roche | 3115836001 | |
| Qubit 1x dsDNA Kit ad alta sensibilità | Invitrogen | Q33230 | Per la quantificazione del DNA dopo la precipitazione nella sezione 4 (purificazione del DNA) |
| Provette per saggi Qubit | Invitrogen | Q32856 | |
| rCutsmart | tampone New England Biolabs | B6004S | |
| RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | O qualsiasi altra marca |
| SDS - Soluzione 10% per biologia molecolare | PanReac AppliChem | A0676 | |
| Acetato di sodio pH 5,2 | Sigma-Aldrich | S7899-100ML | |
| Libreria SureSelect personalizzata 3-5,9 Mb | Agilent Technologies | 5190-4831 | Sistema di acquisizione di mouse o uomo progettato su misura, utilizzato per l'acquisizione |
| SureSelect Target Enrichment Box 1 | Agilent Technologies | 5190-8645 | Utilizzato per il |
| kit di arricchimento target captureSureSelect ILM PE Adattatore completo | Agilent Technologies | 931107 | Utilizzato per la cattura |
| T4 DNA ligasi 1 U/µ L | Invitrogen | 15224025 | Per la legatura nella sezione 3 (legatura e decrosslink) |
| T4 DNA ligasi 2000000/mL | New England Biolabs | M0202T | Per la legatura nella sezione 9 (dATP-tailing, legatura dell'adattatore e amplificazione PCR) |
| T4 DNA polimerasi 3000 unità/mL | New England Biolabs | M0203L | |
| T4 PNK 10000 unità/mL | Strumento New England Biolabs | M0201L | |
| Tapestation 4200 | Agilent Technologies | Per l'elettroforesi automatizzata nella sezione 9 (coda dATP, legatura dell'adattatore e amplificazione PCR) and sezione 11 (pull-down della biotina e amplificazione PCR). Qualsiasi altro sistema di elettroforesi automatizzato è valido | |
| Reagenti Tapestation | Agilent Technologies | 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, | Per l'elettroforesi automatizzata nella sezione 9 (dATP-tailing, legatura dell'adattatore e amplificazione PCR) and sezione 11 (pull-down della biotina e amplificazione PCR). Qualsiasi altro sistema di elettroforesi automatizzato è valido |
| Triton X-100 per la biologia molecolare | PanReac AppliChem | A4975 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML |
Riferimenti
- Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
- Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H. Pr....
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Ristampe e permessi
