Articolo metodologico

Un flusso di lavoro integrato per studiare l'architettura del genoma spazio-temporale centrata sul promotore in popolazioni cellulari scarse

DOI:

10.3791/65316

⸱

21 aprile 2023

 ,  ,  ,  , 
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'espressione genica è regolata dalle interazioni dei promotori genici con gli elementi regolatori distali. Qui, descriviamo come basso input Capture Hi-C (liCHi-C) consenta l'identificazione di queste interazioni in tipi di cellule rare, che in precedenza non erano misurabili.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La trascrizione genica spaziotemporale è strettamente regolata da elementi regolatori distali, come potenziatori e silenziatori, che si basano sulla vicinanza fisica con i loro promotori genici bersaglio per controllare la trascrizione. Sebbene questi elementi regolatori siano facili da identificare, i loro geni bersaglio sono difficili da prevedere, poiché la maggior parte di essi sono specifici del tipo di cellula e possono essere separati da centinaia di kilobasi nella sequenza lineare del genoma, saltando altri geni non bersaglio. Per diversi anni, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) è stato il gold standard per l'associazione di elementi regolatori distali ai loro geni bersaglio. Tuttavia, PCHi-C si basa sulla disponibilità di milioni di cellule, vietando lo studio di popolazioni cellulari rare come quelle comunemente ottenute da tessuti primari. Per superare questa limitazione, è stato sviluppato Capture Hi-C (liCHi-C) a basso input, un metodo economico e personalizzabile per identificare il repertorio di elementi regolatori distali che controllano ciascun gene del genoma. liCHi-C si basa su un framework sperimentale e computazionale simile a PCHi-C, ma impiegando cambiamenti minimi del tubo, modificando la concentrazione e i volumi del reagente e scambiando o eliminando passaggi, rappresenta una perdita minima di materiale durante la costruzione della libreria. Collettivamente, liCHi-C consente lo studio della regolazione genica e dell'organizzazione spaziotemporale del genoma nel contesto della biologia dello sviluppo e della funzione cellulare.

Introduzione

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L'espressione genica temporale guida la differenziazione cellulare e, in definitiva, lo sviluppo dell'organismo, e la sua alterazione è strettamente correlata a un'ampia pletora di malattie 1,2,3,4,5. La trascrizione genica è finemente regolata dall'azione di elementi regolatori, che possono essere classificati come prossimali (cioè promotori genici) e distali (ad esempio, potenziatori o silenziatori), questi ultimi sono frequentemente situati lontano dai loro geni bersaglio e interagiscono fisicamente con loro attraverso il looping della cromatina per modulare l'espressione genica 6,7,8.

L'identificazione delle regioni regolatorie distali nel genoma è una questione ampiamente condivisa, poiché queste regioni ospitano specifiche modificazioni degli istoni 9,10,11 e contengono specifici motivi di riconoscimento dei fattori di trascrizione, fungendo da piattaforme di reclutamento per loro12,13,14. Inoltre, nel caso di enhancer e super-enhancers 15,16, hanno anche una bassa occupazione nucleosomica 17,18 e sono trascritti in eRNA non codificanti 19,20.

Tuttavia, i geni bersaglio di ciascun elemento regolatore distale sono più difficili da prevedere. Il più delle volte, le interazioni tra gli elementi regolatori distali e i loro bersagli sono specifiche del tipo cellulare e dello stimolo 21,22, si estendono su centinaia di kilobasi, collegando altri geni in qualsiasi direzione 23,24,25 e possono anche essere localizzate all'interno di regioni introniche del loro gene bersaglio o di altri geni non intervenienti 26,27. Inoltre, gli elementi regolatori distali possono anche controllare più di un gene allo stesso tempo, e viceversa28,29. Questa complessità posizionale ostacola l'individuazione delle associazioni regolatorie tra loro e, pertanto, la maggior parte degli obiettivi di ciascun elemento regolatore in ogni tipo di cellula rimane sconosciuta.

Negli ultimi anni, c'è stato un boom significativo nello sviluppo di tecniche di cattura della conformazione cromosomica (3C) per lo studio delle interazioni della cromatina. Il più utilizzato di essi, Hi-C, permette di generare una mappa di tutte le interazioni tra ogni frammento del genoma di una cellula30. Tuttavia, per rilevare interazioni significative a livello di frammento di restrizione, Hi-C si basa sul sequenziamento ultra-profondo, vietandone l'uso per studiare regolarmente il panorama regolatorio dei singoli geni. Per superare questa limitazione economica, sono emerse diverse tecniche 3C basate sull'arricchimento, come ChIA-PET31, HiChIP 32 e la sua controparte a basso input HiCuT33. Queste tecniche dipendono dall'uso di anticorpi per arricchire le interazioni genome-wide mediate da una proteina specifica. Tuttavia, la caratteristica unica di queste tecniche 3C è anche la rovina della loro applicazione; Gli utenti contano sulla disponibilità di anticorpi di alta qualità per la proteina di interesse e non possono confrontare le condizioni in cui il legame della proteina è dinamico.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) è un'altra tecnica 3C basata sull'arricchimento che aggira queste limitazioni34,35. Utilizzando un sistema di arricchimento della sonda di RNA biotinilato, PCHi-C è in grado di generare librerie ad alta risoluzione a livello di genoma di regioni genomiche che interagiscono con 28.650 promotori genici umani o 27.595 annotati nel topo, noti anche come interattoma del promotore. Questo approccio consente di rilevare interazioni significative a lungo raggio alla risoluzione a livello di frammento di restrizione di entrambi i promotori attivi e inattivi e di confrontare in modo robusto gli interattomi del promotore tra qualsiasi condizione indipendentemente dalla dinamica delle modificazioni istoniche o del legame proteico. PCHi-C è stato ampiamente utilizzato negli ultimi anni per identificare le riorganizzazioni dell'interattoma del promotore durante il differenziamento cellulare 36,37, identificare il meccanismo d'azione dei fattori di trascrizione38,39 e scoprire nuovi potenziali geni e vie deregolate nella malattia da varianti non codificanti 40,41,42,43,44,45,46,47,48, accanto alle mutazioni non codificanti del nuovo driver49,50. Inoltre, semplicemente modificando il sistema di cattura, questa tecnica può essere personalizzata in base alla domanda biologica per interrogare qualsiasi interattoma (ad esempio, l'interattoma enhancer 51 o l'interattoma di una raccolta di alterazioni non codificanti41,52).

Tuttavia, PCHi-C si basa su un minimo di 20 milioni di cellule per eseguire la tecnica, che impedisce lo studio di popolazioni cellulari scarse come quelle spesso utilizzate nella biologia dello sviluppo e nelle applicazioni cliniche. Per questo motivo, abbiamo sviluppato Capture Hi-C (liCHi-C) a basso input, un nuovo metodo economico e personalizzabile basato sul framework sperimentale di PCHi-C per generare interattomi promotori ad alta risoluzione con input a bassa cella. Eseguendo l'esperimento con minime modifiche del tubo, scambiando o eliminando passaggi dal protocollo PCHi-C originale, riducendo drasticamente i volumi di reazione e modificando le concentrazioni di reagenti, la complessità della libreria è massimizzata ed è possibile generare librerie di alta qualità con un minimo di 50.000 celle53.

Low input Capture Hi-C (liCHi-C) è stato confrontato con PCHi-C e utilizzato per chiarire il ricablaggio dell'interattoma del promotore durante la differenziazione delle cellule ematopoietiche umane, scoprire potenziali nuovi geni e percorsi associati alla malattia deregolati da alterazioni non codificanti e rilevare anomalie cromosomiche53. Il protocollo passo-passo e i diversi controlli di qualità attraverso la tecnica sono dettagliati qui fino alla generazione finale delle librerie e alla loro analisi computazionale.

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Protocollo

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Per garantire una perdita minima di materiale, (1) lavorare con tubi e punte a basso legame del DNA (vedere la tabella dei materiali), (2) posizionare i reagenti sulla parete del tubo invece di introdurre la punta all'interno del campione e, (3) se possibile, mescolare il campione per inversione invece di pipettare il campione su e giù, e ruotare verso il basso in seguito per recuperare il campione.

1. Fissazione cellulare

  1. Cellule che crescono in sospensione
    1. Raccogli da 50.000 a un milione di cellule e mettile in un tubo da 1,5 ml a basso legame del DNA.
      NOTA: I tipi di cellule utilizzati per il presente studio sono dettagliati nella sezione dei risultati rappresentativi.
    2. Centrifugare le celle per 5 minuti a 600 x g (a 4 °C) utilizzando una centrifuga a rotore ad angolo fisso e rimuovere il surnatante mediante pipettaggio.
    3. Risospendere le cellule in 1 mL di RPMI 1640 integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) a temperatura ambiente.
    4. Aggiungere 143 μL di formaldeide al 16% senza metanolo per raggiungere una concentrazione del 2% e mescolare.
    5. Incubare le cellule per 10 minuti mentre si ruota a temperatura ambiente per fissare le cellule.
      NOTA: Cerca di essere il più preciso possibile con l'incubazione di 10 minuti. La fissazione eccessiva o insufficiente delle celle può portare a una diminuzione della qualità della libreria.
    6. Estinguere la reazione aggiungendo 164 μL di glicina ghiacciata 1 M e mescolare. Incubare le cellule per 5 minuti, ruotando a temperatura ambiente.
    7. Incubare ulteriormente le cellule per 15 minuti sul ghiaccio, mescolando per inversione ogni ~ 5 minuti.
    8. Centrifugare le celle per 10 minuti a 1.000 x g (a 4 °C) utilizzando una centrifuga a rotore ad angolo fisso e rimuovere il surnatante.
    9. Lavare le cellule riassumendo il pellet in 1 ml di soluzione salina ghiacciata tamponata con fosfato 1x (PBS).
    10. Centrifugare le cellule per 10 minuti a 1.000 x g (a 4 °C) e rimuovere il surnatante.
      NOTA: Le celle pellettate possono essere congelate in azoto liquido o ghiaccio secco e conservate a -80 °C.
  2. Cellule aderenti
    1. Lavare le cellule nel piatto di coltura con 1x PBS.
    2. Preparare abbastanza RPMI 1640 integrato con FBS al 10% e formaldeide al 2% senza metanolo a temperatura ambiente per coprire il piatto di coltura.
    3. Aggiungere il mezzo integrato al piatto di coltura con le cellule e incubare per 10 minuti, dondolando a temperatura ambiente per fissare le cellule.
      NOTA: Cerca di essere il più preciso possibile con l'incubazione di 10 minuti. La fissazione eccessiva o insufficiente delle celle può portare a una diminuzione della qualità della libreria.
    4. Spegnere la reazione aggiungendo 1 M di glicina fino a 0,125 M e mescolare dondolando.
    5. Incubare le cellule per 5 minuti, dondolando a temperatura ambiente.
    6. Incubare ulteriormente le cellule per 15 minuti a 4 °C, mescolando oscillando ogni 3-4 minuti.
    7. Rimuovere il supporto e lavare le celle con 1x PBS freddo.
    8. Raschiare le cellule e trasferirle in un tubo a basso legame di DNA da 1,5 ml. Pulire il piatto di coltura con 0,5-1 ml di 1x PBS freddo.
    9. Centrifugare le celle per 10 minuti a 1.000 x g (a 4 °C) utilizzando una centrifuga a rotore ad angolo fisso e rimuovere il surnatante. Le celle pellettate possono essere congelate in azoto liquido o ghiaccio secco e conservate a -80 °C.

2. Lisi e digestione

  1. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone di lisi fredda (Tabella 1) per interrompere la membrana cellulare. L'aggiunta del buffer da sola dovrebbe essere sufficiente per risospendere le celle, ma possono essere ulteriormente risospese se necessario mediante vortice di luce.
  2. Incubare su ghiaccio per 30 minuti, mescolando per inversione ogni ~ 5 minuti. Centrifugare i nuclei per 10 minuti a 1.000 x g (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospendere i nuclei con 500 μL di tampone di restrizione freddo 1,25x 2 (vedere Tabella dei materiali).
  3. Centrifugare i nuclei per 10 minuti a 1.000 x g (a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospendere i nuclei in 179 μL di tampone di restrizione 1,25x 2.
  4. Aggiungere 5,5 μL di sodio dodecilsolfato al 10% (SDS; vedere Tabella dei materiali) e omogeneizzare. Le cellule possono formare grumi; Questo è normale e deve essere disaggregato il più possibile per vortice. Incubare il campione per 1 ora a 37 °C in un blocco termico, agitando a 950 giri/min.
  5. Spegnere la SDS aggiungendo 37,5 μL di Triton X-100 al 10% e mescolare. Incubare il campione per 1 ora a 37 °C in un blocco termico, agitando a 950 giri/min.
  6. Digerire la cromatina aggiungendo 7,5 μL di HindIII (100 U/μL; vedere Tabella dei materiali) e mescolare. Incubare il campione per una notte a 37 °C in un blocco termico, agitando a 950 giri/min.
  7. La mattina seguente, aggiungere altri 2,5 μL di HindIII (100 U/μL) e incubare ulteriormente il campione per 1 ora a 37 °C in un blocco termico, agitando a 950 giri/min per garantire una corretta digestione della cromatina.
    NOTA: Come parte dei controlli dell'efficienza della digestione (vedere il punto 5.1), trasferire l'equivalente di 20.000 a 40.000 nuclei in un'altra provetta per rappresentare il controllo non digerito. Dopo la digestione, trasferire nuovamente lo stesso numero di cellule in un altro tubo per rappresentare il controllo digerito. Si raccomanda di testare l'efficienza della digestione come esperimento separato se la disponibilità del materiale di partenza è scarsa.

3. Legatura e decrosslinking

  1. Raffreddare il campione sul ghiaccio. Preparare un mastermix e aggiungere i seguenti reagenti per riempire e biotinilare le sporgenze del frammento di restrizione: 3 μL di tampone di restrizione 10x 2, 1 μL di acqua priva di nucleasi, 0,75 μL di 10 mM dCTP, 0,75 μL di 10 mM dTTP, 0,75 μL di 10 mM dGTP, 18,75 μL di 0,4 mM di biotina-14-dATP e 5 μL di 5 U/μL Klenow (vedere Tabella dei materiali). Incubare il campione per 75 minuti a 37 °C, mescolando per inversione ogni ~15 min.
  2. Raffreddare il campione sul ghiaccio. Preparare un mastermix e aggiungere i seguenti reagenti per ligare le estremità del DNA riempito: 50 μL di tampone di legatura 10x, 2,5 μL di 20 mg/ml di albumina sierica bovina (BSA), 12,5 μL di 1 U/μL T4 DNA ligasi e 173 μL di acqua priva di nucleasi (vedere Tabella dei materiali).
  3. Incubare il campione per 4-6 ore a 16 °C, mescolando per inversione ogni ~1 ora. Inoltre, incubare il campione per 30 minuti a temperatura ambiente. Decrosslink della cromatina aggiungendo 30 μL di 10 mg/mL di proteinasi K e mescolare. Incubare il campione per una notte a 65 °C.
  4. La mattina seguente, aggiungere altri 15 μL di 10 mg/mL di proteinasi K e incubare ulteriormente il campione per 2 ore a 65 °C per garantire una corretta reticolazione della cromatina.

4. Purificazione del DNA

  1. Raffreddare il campione a temperatura ambiente e trasferirlo in una provetta adatta per la purificazione fenolo-cloroformio.
  2. Aggiungere 1 volume (545 μL) di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico (25:24:1) per purificare il DNA e mescolare agitando energicamente.
  3. Centrifugare il campione per 5 minuti a 12.000 x g a temperatura ambiente e trasferire la fase acquosa superiore (545 μL) in una provetta a basso legame di DNA da 2 ml.
  4. Aggiungere i seguenti reagenti per precipitare il DNA: 1.362,5 μL di etanolo al 100% raffreddato a -20 °C, 54,5 μL di acetato di sodio 3 M (pH 5,2) e 2 μL di glicogeno 15 mg/ml come coprecipitante.
  5. Incubare per 1 ora a -80 °C o per una notte a -20 °C.
  6. Centrifugare il campione per 30 minuti a 16.000-21.000 x g a 4 °C e rimuovere il surnatante. Il pellet di DNA deve essere visibile.
  7. Lavare il pellet aggiungendo 1 ml di etanolo al 70%, vortice e centrifugazione per 10 minuti a 16.000-21.000 x g a temperatura ambiente.
  8. Rimuovere il surnatante e lasciare asciugare il pellet all'aria. Risospendere il pellet di DNA in 130 μL di acqua priva di nucleasi.
  9. Valutare la concentrazione mediante quantificazione fluorometrica (vedi Tabella dei materiali). Conservare il materiale 3C purificato a -20 °C per diversi mesi prima di procedere con il protocollo.

5. Controlli di qualità opzionali

  1. Valutare l'efficienza della digestione. Eseguire la dereticolazione e la purificazione del DNA fenolo:cloroformio, come descritto in precedenza, ai controlli non digeriti e digeriti ottenuti al punto 2.13. Risospendere il pellet di DNA in 10 μL di acqua priva di nucleasi. Quantificare la concentrazione e diluire il DNA ottenuto, se necessario, a 4 ng/μL.
  2. Eseguire la PCR quantitativa con 4 ng di DNA di entrambi i controlli non digeriti e digeriti, con primer che coprono un locus aperto della cromatina con e senza un bersaglio HindIII (vedere Tabella 2 per la progettazione del primer). Calcolare l'efficienza della digestione seguendo un rapporto precedentemente pubblicato35.
    NOTA: L'efficienza della legatura è calcolata in percentuale utilizzando la formula: digestione (%) = 100 -100/(2^[(Ct digerito con HindIII - Ctdigested senza HindIII) - (Ct non digerito con HindIII - Ct non digerito senza HindIII)]) (vedi Tabella 3), che tiene conto del differenziale dei diversi Cts ottenuti per ciascuna coppia di primer nei controlli non digeriti e digeriti.
  3. Valutare la sensibilità del rilevamento dell'interazione eseguendo la reazione a catena della polimerasi convenzionale (PCR) (0,2 mM dNTP, 0,4 μm entrambi i primer F + R, 0,1 e U/μL polimerasi hot start), con primer che coprono interazioni cellula-invariante a lungo e corto raggio (vedere Tabella 2 per la progettazione del primer). Utilizzare 50-100 ng di materiale 3C (per interazioni a corto e lungo raggio, rispettivamente) e amplificare utilizzando le seguenti condizioni: 98 °C per 15 min, seguiti da 37 cicli di 98 °C per 30 s, 60 °C per 1 min, 72 °C per 1 min e terminare di 72 °C per 10 min. Conservare a 4 °C.
    NOTA: Se la quantità di DNA ottenuta è inferiore a 2 μg, controllare solo un'interazione a lungo e corto raggio anziché l'intero pannello di interazione.
  4. Eseguire il prodotto su 1x tris-borato-EDTA (TBE) utilizzando gel di agarosio all'1,6% e cercare la presenza del corrispondente amplicone PCR54.
    NOTA: A causa dell'imprevedibile "taglia e incolla" del genoma, possono apparire bande non specifiche. Finché viene osservata la dimensione della banda corretta, viene conteggiata come corretta.
  5. Valutare l'efficienza del fill-in e della legatura della biotina digerendo in modo differenziale un prodotto PCR a corto raggio con HindIII, NheI (vedi Tabella dei materiali), entrambi gli enzimi o nessuno (acqua) ed eseguendo il prodotto su un gel di agarosio 1x TBE 1,6%. Un corretto fill-in e legatura eliminano il precedente target HindIII e creano un nuovo target NheI, quindi l'amplicone dovrebbe essere tagliato solo in presenza di NheI.
    NOTA: Per ridurre al minimo la perdita di materiale, recuperare 2,5 μL di un prodotto PCR a corto raggio dai controlli di interazione e riamplificarlo cinque volte per eseguire i controlli di riempimento e legatura.

6. Sonicazione

  1. Trasferire i 130 μL del campione (rabboccare con acqua priva di nucleasi se utilizzata per i controlli) in una cuvetta adatta alla sonicazione.
  2. Impostare un sonicatore a bagnomaria e sonicare utilizzando i seguenti parametri (ottimizzati per il modello e le cuvette descritti nella tabella dei materiali): fattore di servizio: 20%; potenza di incidenza di picco: 50; cicli per raffica: 200; tempo: 65 s; e intervallo di temperatura: 6-10 °C (8 °C ottimale).
  3. Trasferire il campione in una nuova provetta a basso legame di DNA da 1,5 ml.

7. Fine riparazione

  1. Preparare un mastermix e aggiungere i seguenti reagenti per riparare le estremità irregolari dei frammenti di DNA creati durante la sonicazione: 18 μL di tampone di legatura 10x, 18 μL di miscela 2,5 mM dNTP ciascuno, 6,5 μL di DNA polimerasi T4 3 U/μL, 6,5 μL di PNK T4 10 U/μL e 1,3 μL di 5 U/μL Klenow (vedi Tabella dei materiali).
  2. Incubare il campione per 30 minuti a 20 °C e rabboccare con tampone Tris-low EDTA (TLE) (vedere Tabella 1) a 300 μL.

8. Pull-down della biotina

  1. Trasferire 150 μL di sfere di streptavidina C1 (vedi Tabella dei materiali) per campione in un tubo da 1,5 ml, posizionarle su un tubo magnetico da 1,5 mL e attendere 2-3 minuti o fino a quando tutte le perle sono attaccate alla parete. Rimuovere il surnatante, lasciando le perline dietro.
  2. Lavare le perline con 400 μL di tampone 1x Tween (TB; vedere Tabella 1). Per lavare le perline, aggiungere il tampone e risospenderle con un vortice morbido. Riposizionare il tubo nel magnete e attendere 2-3 minuti o fino a quando tutte le perline sono attaccate al muro. Rimuovere il surnatante, lasciando le perline dietro.
  3. Lavare le perle con 300 μL di tampone 1x senza Tween (NTB; vedere Tabella 1). Risospendere le perle in 300 μL di 2x NTB (vedere Tabella 1).
    NOTA: Le perline possono formare uno strato polveroso attorno alla parete del tubo durante il lavaggio con tamponi senza detergente. Questo è normale e non influisce sull'esito del protocollo.
  4. Combinare questi 300 μL di perline in 2x NTB con i 300 μL del campione. Incubare per 15 minuti, ruotando a temperatura ambiente per estrarre i frammenti informativi di DNA con biotina. La biblioteca è ora attaccata alle perle di streptavidina C1.
  5. Lavare le perline con 400 μL di 1x NTB. Lavare le perle con 100 μL di tampone TLE e successivamente risospenderle in 35,7 μL di tampone TLE.

9. dATP-tailing, legatura dell'adattatore e amplificazione PCR

  1. Preparare un mastermix e aggiungere i seguenti reagenti al campione per dATP-coda le estremità dei frammenti di DNA riparati: 5 μL di tampone di restrizione 10x 2, 2,3 μL di 10 mM dATP e 7 μL di 5 U/μL Klenow exo-. Incubare il campione per 30 minuti a 37 °C.
  2. Inattivare Klenow exo- incubando ulteriormente il campione per 10 minuti a 65 °C. Raffreddare il campione sul ghiaccio. Lavare le perline con 300 μL di 1x TB. Lavare le perline con 300 μL di 1x NTB.
  3. Lavare le perle con 100 μL di tampone di legatura 1x e successivamente risospenderle in 50 μL di tampone di legatura 1x. Aggiungere al campione 4 μL di miscela adattatrice prericotto da 15 μM (vedere Tabella 2) e 1 μL di 2.000 U/μL di DNA ligasi T4 (vedere Tabella dei materiali).
  4. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Lavare le perline con 400 μL di 1x TB. Lavare le perline con 200 μL di 1x NTB. Lavare le perle con 100 μl di tampone di restrizione 1x 2.
  5. Lavare le perle con 50 μL di 1x tampone di restrizione 2 e successivamente risospenderle in 50 μL di 1x tampone di restrizione 2.
  6. Mescolare i seguenti reagenti per preparare la reazione PCR per amplificare la libreria: 50 μL di perline con la libreria, 250 μL di 2x PCR mastermix con enzima, 12 μL di primer F + R (25 μM ciascuno; vedere Tabella 2) e 188 μL di acqua priva di nucleasi.
  7. Eseguire la PCR con le seguenti condizioni (dividere la miscela di reagenti PCR in reazioni da 50 μL): 98 °C per 40 s, seguiti da X cicli di 98 °C per 10 s, 65 °C per 30 s, 72 °C per 30 s e terminare entro 72 °C per 10 minuti. Conservare a 4 °C.
    NOTA: Utilizzare il seguente numero di cicli come punto di partenza per ottimizzare il protocollo nelle celle diploidi con l'obiettivo di ottenere un output di 500-1.000 ng prima dell'acquisizione della libreria: un milione di celle per otto cicli; 250.000 cellule per 10 cicli; 50.000 cellule per 12 cicli.
  8. Raggruppa tutte le reazioni da 50 μL dello stesso campione in un tubo a basso legame di DNA da 1,5 ml, posizionalo su un magnete a tubo da 1,5 ml e attendi 2-3 minuti o fino a quando tutte le perle sono attaccate alla parete.
  9. Trasferire il surnatante contenente la libreria (500 μL) in una nuova provetta a basso legame del DNA da 1,5 ml. Riempire con tampone TLE a 500 μL se parte del surnatante è stato perso. Le perle di streptavidina C1 non sono più necessarie.
  10. Eseguire una selezione fronte-retro55 utilizzando la purificazione a perline paramagnetiche (volume 0,4-1). Ciò consente l'eliminazione selettiva di frammenti troppo grandi (>1.000 bp) e troppo piccoli o primer PCR (<200 bp), a seconda della concentrazione di polietilenglicole e sale delle sfere paramagnetiche aggiunte.
  11. Aggiungere 200 μL (0,4 volumi) di perline di brodo alla libreria e mescolare a vortice. Incubare per 10 minuti, ruotando a temperatura ambiente.
  12. Posizionare su un magnete, attendere 2-3 minuti o fino a quando tutte le perle sono attaccate al muro e trasferire il surnatante contenente la libreria (senza i frammenti più grandi) in un nuovo tubo a basso legame di DNA da 1,5 ml.
  13. Concentrare le perle prendendo 750 μL di perline di brodo, metterle in un tubo da 1,5 ml su un magnete, attendere 2-3 minuti o fino a quando tutte le perle sono attaccate al muro, rimuovere il surnatante e risospendere le perle vorticando in 300 μL di nuove perle di brodo.
  14. Aggiungere questi 300 μL di perle concentrate al campione (1 volume) e mescolare per vortice. Incubare per 10 minuti, ruotando a temperatura ambiente. Posizionare su un magnete, attendere 2-3 minuti o fino a quando tutte le perle sono attaccate al muro e rimuovere il surnatante (contenente i frammenti più piccoli e i primer PCR).
  15. Lavare le perline tre volte con 1 ml di etanolo al 70%. Per fare questo, aggiungi l'etanolo mentre il tubo con le perline è ancora sul magnete, cercando di non disturbare le perle, e attendi 30-60 s. Successivamente, rimuovere il surnatante senza disturbare le perline.
  16. Lasciare asciugare le perle all'aria e risospenderle in 21 μL di tampone TLE mediante vortice.
    NOTA: L'eccessiva essiccazione delle perle può ridurre la resa quando si eluisce il DNA. Mirare a risospenderli nel tampone TLE immediatamente dopo che non sono più "lucidi" dall'etanolo.
  17. Incubare il campione per 10 minuti a 37 °C in un blocco termico per eluire la libreria dalle perle. Posizionare il tubo in un magnete e trasferire il surnatante contenente la libreria in un nuovo tubo a basso legame di DNA da 1,5 ml.
  18. Quantificare la dimensione e la concentrazione mediante elettroforesi automatizzata (vedi Tabella dei materiali). Il materiale Hi-C purificato può essere conservato a -20 °C per diversi mesi prima di procedere con il protocollo.

10. Acquisizione della libreria

  1. Lavora con 500-1.000 ng della libreria. Concentrare la libreria essiccando il DNA utilizzando un concentratore sottovuoto e risospendendo il materiale in 3,4 μL di acqua priva di nucleasi.
  2. Aggiungere i seguenti bloccanti dal kit di arricchimento di destinazione (vedere la tabella dei materiali) al campione: 2,5 μL di Blocker 1, 2,5 μL di Blocker 2 e 0,6 μL di oligobloccanti personalizzati per gli adattatori.
  3. Risospendere accuratamente, trasferire la soluzione su una striscia PCR da 0,2 mL e incubare in un termociclatore per 5 minuti a 95 °C, seguito da 5 minuti a 65 °C con un coperchio riscaldato. Lasciare la provetta in incubazione a 65 °C.
  4. Preparare la soluzione di ibridazione combinando i seguenti reagenti del kit di arricchimento target (vedere Tabella dei materiali) per campione (13 μL). Tenere sul banco a temperatura ambiente: 6,63 μL di Hyb 1, 0,27 μL di Hyb 2, 2,65 μL di Hyb 3 e 3,45 μL di Hyb 4.
  5. Diluire 0,5 μL di blocco di RNasi dal kit di arricchimento target con 1,5 μL di acqua priva di nucleasi per campione. Scongelare 5 μL di RNA biotinilato per campione su ghiaccio e aggiungervi i 2 μL del blocco di RNasi diluito. Tenere sul banco a temperatura ambiente.
  6. Aggiungere i 13 μL della soluzione di ibridazione ai 7 μL dell'RNA biotinilato con RNasi e mescolare bene.
  7. Mentre sul termociclatore a 65 °C, trasferire la soluzione di ibridazione con l'RNA biotinilato (20 μL) nella libreria bloccata. Chiudere saldamente il coperchio del tubo e incubare nel termociclatore per una notte a 65 °C.
    NOTA: Per ridurre al minimo l'evaporazione del campione (che può portare a un'ibridazione RNA-DNA non ottimale) quando si eseguono più campioni contemporaneamente, utilizzare una pipetta multicanale per trasferire contemporaneamente l'RNA biotinilato a ciascuna libreria.

11. Pull-down della biotina e amplificazione PCR

  1. Trasferire 50 μL di sfere di streptavidina T1 per campione in una provetta a basso legame di DNA da 1,5 ml, posizionarle su un tubo magnetico da 1,5 ml e attendere 2-3 minuti o fino a quando tutte le perle sono attaccate alla parete. Rimuovere il surnatante, lasciando le perline dietro. Lavare le perle tre volte con 200 μL del tampone legante dal kit di arricchimento target.
  2. Risospendere le perle in 200 μL di tampone legante. Mentre si è sul termociclatore a 65 °C, trasferire il campione nelle sfere di streptavidina T1 risospese e incubare per 30 minuti, ruotando a temperatura ambiente.
  3. Lavare le perle con 200 μL di tampone di lavaggio 1 dal kit di arricchimento target. Incubare per 15 minuti, ruotando a temperatura ambiente. Lavare le perle tre volte con 200 μL di tampone di lavaggio 2 dal kit di arricchimento target riscaldato a 65 °C. Incubare per 10 minuti a 65 °C in un blocco termico, agitando a 300 giri/min tra un lavaggio e l'altro.
  4. Lavare le perle con 200 μL di 1x tampone di restrizione 2 e successivamente risospenderle in 30 μL di 1x tampone di restrizione 2.
  5. Miscelare i seguenti reagenti per preparare la reazione PCR per amplificare la libreria: 30 μL di sfere con la libreria, 150 μL di 2x PCR mastermix con enzima, 7,2 μL di primer F + R (25 μM ciascuno; vedere Tabella 2) e 112,8 μL di acqua priva di nucleasi.
  6. Eseguire la PCR con le seguenti condizioni (dividere la miscela di reagenti PCR in reazioni da 50 μL): 98 °C per 40 s, seguita da quattro cicli di 98 °C per 10 s, 65 °C per 30 s, 72 °C per 30 s e terminare con 72 °C per 10 minuti. Conservare a 4 °C.
  7. Raggruppa tutte le reazioni da 50 μL dello stesso campione in un tubo a basso legame di DNA da 1,5 ml, posizionalo su un magnete a tubo da 1,5 ml e attendi 2-3 minuti o fino a quando tutte le perle sono attaccate alla parete.
  8. Trasferire il surnatante contenente la libreria (300 μL) in una nuova provetta a basso legame di DNA da 1,5 ml. Ricarica con tampone TLE a 300 μL se parte del surnatante è stata persa. Le perle di streptavidina T1 non sono più necessarie.
  9. Eseguire una purificazione del DNA utilizzando perline paramagnetiche (0,9 volumi; vedi Tabella dei materiali). Aggiungere 270 μL di sfere al campione e mescolare per vortice.
  10. Incubare per 10 minuti, ruotando a temperatura ambiente.
  11. Posizionare su un magnete, attendere 2-3 minuti o fino a quando tutte le perline sono attaccate al muro e rimuovere il surnatante.
  12. Lavare le perline tre volte con 1 ml di etanolo al 70%. Per fare questo, aggiungere l'etanolo mentre il tubo con le perline è ancora sul magnete, cercando di non disturbare le perle, e attendere 30-60 s. Successivamente, rimuovere il surnatante senza disturbare le perline.
  13. Lasciare asciugare le perle all'aria e risospenderle in 21 μL di tampone TLE mediante vortice.
    NOTA: L'eccessiva essiccazione delle perle può ridurre la resa quando si eluisce il DNA. Mirare a risospenderli nel tampone TLE immediatamente dopo che non sono più "lucidi" dall'etanolo.
  14. Incubare il campione per 10 minuti a 37 °C in un blocco termico per eluire la libreria dalle perle.
  15. Posizionare il tubo in un magnete e trasferire il surnatante contenente la libreria in un nuovo tubo a basso legame di DNA da 1,5 ml.
  16. Quantificare le dimensioni e la concentrazione mediante elettroforesi automatizzata.

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Risultati

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liCHi-C offre la possibilità di generare librerie di interattomi promotori di alta qualità e risoluzione con un minimo di 50.000 cellule53. Ciò si ottiene – oltre alla drastica riduzione dei volumi di reazione e all'uso di oggetti plastici a basso legame del DNA in tutto il protocollo – rimuovendo passaggi non necessari dal protocollo originale, in cui si verificano perdite significative di materiale. Questi includono la purificazione del fenolo dopo la reticolazione, la rimozione della biotina e ...

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Discussione

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liCHi-C offre la capacità di generare librerie di interattomi promotori ad alta risoluzione utilizzando un framework sperimentale simile a PCHi-C ma con un numero di celle notevolmente ridotto. Ciò si ottiene notevolmente eliminando i passaggi non necessari, come la purificazione del fenolo e la rimozione della biotina. Nel classico protocollo Hi-C57 della legatura in-nucleo e nella sua successiva tecnica derivata PCHi-C, la biotina viene rimossa dai frammenti di restrizione non legati per evitare...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il resto dei membri del laboratorio Javierre per il loro feedback sul manoscritto. Ringraziamo il Programma CERCA, la Generalitat de Catalunya e la Fondazione Josep Carreras per il sostegno istituzionale. Questo lavoro è stato finanziato dal FEDER/Ministero spagnolo della Scienza e dell'Innovazione (RTI2018-094788-A-I00), dall'Associazione europea di ematologia (4823998) e dall'Associazione spagnola contro il cancro (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ è finanziato dal progetto Junior Leader della La Caixa Banking Foundation (LCF / BQ / PI19 / 11690001), LR è finanziato da una borsa di studio AGAUR FI (2019FI-B00017) e LT-D è finanziato da una borsa di studio FPI (PRE2019-088005). Ringraziamo il programma di dottorato in biochimica e biologia molecolare dell'Universitat Autònoma de Barcelona per il suo supporto. Nessuno dei finanziatori è stato coinvolto in nessun momento nella progettazione sperimentale o nella scrittura del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,4 mM Biotina-14-dATPInvitrogen19524-016
0,5 M EDTA pH 8,0InvitrogenAM9260G
1 M Tris pH 8,0InvitrogenAM9855G
10x NEBuffer 2New England BiolabsB7002SCitato come tampone di restrizione 2 nel manoscritto
10x PBSFisher ScientificBP3994
10x tampone di reazione DNA ligasi T4New England BiolabsB0202S
Soluzione di formaldeide al 16% (p/v), senza metanoloThermo Scientific28908
20 mg/mL Albumina sierica bovinaNew England BiolabsB9000S
5 M NaClInvitrogenAM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Tubi luminosiQiuantabio2302820Per la purificazione fenolo-cloroformio nella sezione 4 (purificazione del DNA). Le provette in gel Phase Lock sono un tipo commerciale di provette appositamente progettate per massimizzare il recupero del DNA dopo la purificazione fenolo-cloroformio, evitando il trascinamento di contaminanti nella fase organica contenendo una resina di densità intermedia che si deposita tra la fase organica e quella acquosa e li isola. Le provette PLG devono essere centrifugate a 12.000 x g per 30 s prima dell'uso per garantire che la resina sia ben posizionata sul fondo della provetta
Adattatori e primer PCR per l'amplificazione della libreriaTecnologie DNA integrate-Acquistatecome primer singoli con purificazione PAGE per
raschiatori cellulariNunc179693O qualsiasi altra marca
Centrifuga (rotore ad angolo fisso per provette da 1,5 mL)Qualsiasi marca
Pacchetto CHiCAGO R1.14.0
Perle CleanNGSCleanNACNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTPPromegaU120A, U121A, U122A, U123AO qualsiasi altra provetta DNA LoBind di qualsiasi altra marca
Eppendorf301080511,5 mL
, 2 mLEppendorf30108078
DNA polimerasi I grande (Klenow) frammento 5000 unità/mLNew England BiolabsM0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 perlineInvitrogen65002Per il pull-down della biotina della libreria pre-catturata nella sezione 8 (pull-down della biotina)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beadsInvitrogen65602Per il pull-down della biotina della libreria post-catturata nella sezione 11 (pull-down della biotina e amplificazione PCR)
DynaMag-2Invitrogen12321DO qualsiasi altro magnete adatto per provette da 1,5 mlL
Etanolo assolutoVWR20821.321
FBS, qualificatoGibco10270-106O qualsiasi altra marca
GlycineFisher BioReagentsBP381-1
GlycoBlue CoprecipitanteInvitrogenAM9515Utilizzato per la coprecipitazione del DNA nella sezione 4 (purificazione del DNA)
HiCUP0.8.2
HindIII, 100 U/µ LNew England BiolabsR0104T
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50ML
Klenow EXO- 5000 unità/mLNew England BiolabsM0212L
Puntali filtranti a bassa ritenzione ( 10 µ L, 20 & micro; L, 200 & micro; L e 1000 µ L)ZeroTipPMT233010, PMT252020, PMT231200 PMT252000
M220 Ultrasuoni focalizzatiCovaris500295
Micro TUBE AFA Fiber Tappo a scatto pre-fessurato 6 fiale da 16 mmCovaris520045Per la sonicazione nella sezione 6 (sonicazione)
NheI-HF, 100 U/µ LNew England BiolabsR3131M
Acqua di biologia molecolare priva di nucleasiPrimer Sigma-AldrichW4502
PCR per controlli di qualitàStrisce integrate di DNATechnologies-PCR
e tappiAgilent Technologies410022, 401425
Fenolo: Cloroformio: Alcool isoamilico 25:24:1, Saturo con 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTASigma-AldrichP3803
Phusion  Master Mix PCR ad alta fedeltà con tampone HF NewEngland BiolabsM0531LPer l'amplificazione della libreria nelle sezioni 9 (coda dATP, legatura dell'adattatore e amplificazione PCR)
e 11 (pull-down della biotina e amplificazione PCR)
Cocktail di inibitori della proteasi (senza EDTA)Roche11873580001
Proteinasi K, ricombinante, Grado PCRRoche3115836001
Qubit 1x dsDNA Kit ad alta sensibilitàInvitrogenQ33230Per la quantificazione del DNA dopo la precipitazione nella sezione 4 (purificazione del DNA)
Provette per saggi QubitInvitrogenQ32856
rCutsmarttampone New England BiolabsB6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAXGibco61870-010O qualsiasi altra marca
SDS - Soluzione 10% per biologia molecolarePanReac AppliChemA0676
Acetato di sodio pH 5,2Sigma-AldrichS7899-100ML
Libreria SureSelect personalizzata 3-5,9 MbAgilent Technologies5190-4831Sistema di acquisizione di mouse o uomo progettato su misura, utilizzato per l'acquisizione
SureSelect Target Enrichment Box 1Agilent Technologies5190-8645Utilizzato per il
kit di arricchimento target captureSureSelect ILM PE Adattatore completoAgilent Technologies931107Utilizzato per la cattura
T4 DNA ligasi 1 U/µ LInvitrogen15224025Per la legatura nella sezione 3 (legatura e decrosslink)
T4 DNA ligasi 2000000/mLNew England BiolabsM0202TPer la legatura nella sezione 9 (dATP-tailing, legatura dell'adattatore e amplificazione PCR)
T4 DNA polimerasi 3000 unità/mLNew England BiolabsM0203L
T4 PNK 10000 unità/mLStrumento New England BiolabsM0201L
Tapestation 4200Agilent TechnologiesPer l'elettroforesi automatizzata nella sezione 9 (coda dATP, legatura dell'adattatore e amplificazione PCR) and
sezione 11 (pull-down della biotina e amplificazione PCR). Qualsiasi altro sistema di elettroforesi automatizzato è valido
Reagenti TapestationAgilent Technologies5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,Per l'elettroforesi automatizzata nella sezione 9 (dATP-tailing, legatura dell'adattatore e amplificazione PCR) and
sezione 11 (pull-down della biotina e amplificazione PCR). Qualsiasi altro sistema di elettroforesi automatizzato è valido
Triton X-100 per la biologia molecolarePanReac AppliChemA4975
Tween 20Sigma-AldrichP9416-50ML
NGS , provetta DNA LoBind da:

Riferimenti

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