Iniezioni intracerebroventricolari a mano libera nei topi

Summary

Qui viene descritto un approccio semplice e rapido per l'esecuzione di iniezioni intracerebroventricolari nei topi utilizzando un approccio a mano libera (cioè senza un dispositivo stereotassico).

Abstract

Lo studio dei sistemi neuroendocrini richiede spesso la somministrazione di farmaci, virus o altri agenti sperimentali direttamente nel cervello dei topi. Un'iniezione intracerebroventricolare (ICV) consente la somministrazione diffusa dell'agente sperimentale in tutto il cervello (in particolare nelle strutture vicino ai ventricoli). Qui vengono descritti i metodi per effettuare iniezioni ICV a mano libera in topi adulti. Utilizzando punti di riferimento visivi e tattili sulle teste dei topi, le iniezioni nei ventricoli laterali possono essere effettuate in modo rapido e affidabile. Le iniezioni vengono effettuate con una siringa di vetro tenuta in mano dallo sperimentatore e posta a distanze approssimative dai punti di riferimento. Pertanto, questa tecnica non richiede un frame stereotassico. Inoltre, questa tecnica richiede solo una breve anestesia con isoflurano, che consente la successiva valutazione del comportamento e/o della fisiologia del topo in topi svegli e che si comportano liberamente. L'iniezione ICV a mano libera è un potente strumento per la somministrazione efficiente di agenti sperimentali nel cervello di topi viventi e può essere combinata con altre tecniche come il prelievo frequente di sangue, la manipolazione dei circuiti neurali o la registrazione in vivo per studiare i processi neuroendocrini.

Introduction

La somministrazione di agenti sperimentali, come i farmaci¹, i virus² o le cellule³, al cervello è spesso necessaria per la ricerca neuroendocrina. Se l'agente non attraversa facilmente la barriera emato-encefalica o l'obiettivo sperimentale è quello di testare in modo specifico gli effetti centrali dell'agente, è importante disporre di un metodo affidabile per somministrare iniezioni nel cervello. Inoltre, l'iniezione nello spazio intracerebroventricolare (ICV) offre l'opportunità di distribuire ampiamente l'agente nel cervello e fornisce un'ampia area bersaglio, aumentando così la probabilità di successo dell'iniezione².

Un metodo comune per effettuare iniezioni di ICV prevede il posizionamento di una cannula permanente a permanenza. In questo approccio, è necessario un telaio stereotassico per posizionare la cannula disponibile in commercio o su misura, poiché la cannula viene incollata o cementata in posizione. Spesso, al momento del recupero, viene somministrata una dose sovrafisiologica di angiotensina II attraverso la cannula e, se si osserva immediatamente il comportamento del bere, la cannula viene considerata posizionata correttamente⁴. Questo approccio presenta molti vantaggi, tra cui la possibilità di eseguire un'infusione a lungo termine e la possibilità di iniettare più volte lo stesso animale; inoltre, se viene impiegata l'angiotensina II, il corretto posizionamento può essere confermato prima della somministrazione di composti sperimentali. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni al posizionamento di una cannula permanente, tra cui la necessità di attrezzature costose (telaio stereotassico), la possibilità di danni alla cannula dopo il posizionamento (ad esempio, i topi possono masticare la cannula di un compagno di gabbia) e la possibilità di infezioni intorno alla cannula permanente. Le iniezioni singole di ICV possono essere effettuate con l'uso di un frame^{stereotassico 3}, che, sebbene efficace, richiede una sostanziale esposizione all'anestesia e, quindi, può oscurare alcuni effetti fisiologici e comportamentali acuti del trattamento. Inoltre, il posizionamento dei topi in un telaio stereotassico richiede una formazione sostanziale per ottenere un posizionamento stabile e prevenire la rottura dei condotti uditivi.

Qui viene descritto un metodo consolidato per effettuare iniezioni a mano libera nei topi. Questo metodo si basa sulle precedenti relazioni ^5,6. I vantaggi di questa tecnica sono che è semplice, rapida e non richiede attrezzature specializzate come un telaio stereotassico. Come descritto di seguito, questa procedura prevede la manipolazione di una siringa di vetro rispetto ai punti di riferimento sulla testa del topo per effettuare le iniezioni, che possono essere eseguite rapidamente e, quindi, richiedono solo pochi minuti di anestesia gassosa il giorno dell'esperimento.

Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dalla Colorado State University (#3960) e dall'Università della California San Diego Institutional Animal Care and Use Committees, dove sono stati raccolti i dati rappresentativi (S13235, PI Kellie Breen Church). I dati di cinque topi C57/BL6 femmine adulte e due maschi adulti (9-16 settimane) sono illustrati nella sezione dei dati rappresentativi. I topi femmina sono stati ovariectomizzati 3-4 settimane prima dell'iniezione di ICV e della raccolta del sangue come descritto in precedenza⁷. Prima della sperimentazione, questi topi sono stati alloggiati con un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di luce scura e hanno avuto libero accesso al mangime e all'acqua in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Esecuzione della craniotomia

NOTA: La craniotomia può essere eseguita uno o più giorni prima dell'iniezione vera e propria, il che rende il processo di iniezione più rapido il giorno dell'esperimento.

1. Preparare i materiali per la craniotomia come descritto di seguito.
   1. Posizionare un tappetino da banco pulito o un telo sul piano di lavoro. Fissare con del nastro adesivo l'ogiva di un vaporizzatore all'isoflurano sulla superficie di lavoro (vicino allo sperimentatore, ma rivolto in direzione opposta; vedere la Figura 1A).
   2. Posizionare il tubo silattico all'estremità di un ago sterile affilato da 18 G in modo che sporga ~1 mm della punta dell'ago. Posizionare il tubo silastico all'estremità di un ago sterile smussato in modo che sporga ~1 mm della punta dell'ago.
      NOTA: Per ogni topo devono essere utilizzati aghi preconfezionati separati e sterili (affilati e smussati).
   3. Procurati un rasoio elettrico, uno scrub allo iodio, una garza sterile e dei tamponi imbevuti di alcol per preparare il sito di iniezione.
2. Esercitati a muovere un ago di 2 mm lateralmente e 1 mm caudale come descritto di seguito.
   1. Utilizzare un righello e una penna per segnare un foglio di carta con un punto di partenza (questo sarà bregma), un segno di 2 mm a sinistra o a destra e un altro segno di 1 mm sopra l'ultimo (questo sarà il sito di iniezione; vedere la Figura 1B).
   2. Esercitarsi a spostare l'ago dal punto di partenza al punto 1 al punto 2 (dal bregma al sito di iniezione) fino a quando non si è sicuri che il movimento sia ripetibile senza guide.
      NOTA: Le coordinate qui descritte sono efficaci nei topi adulti C57/BL6, ma altri ceppi o gruppi di età potrebbero richiedere un aggiustamento.
3. Preparare il topo per la craniotomia come descritto di seguito.
   1. Metti il topo in una camera di induzione e anestetizza il topo con isoflurano al 3%-4% in ossigeno di grado medico. Con la pratica e la familiarità con la procedura, ridurre la durata totale dell'esposizione all'isoflurano a meno di 10 minuti per la procedura di craniotomia.
      ATTENZIONE: L'esposizione all'isoflurano è pericolosa per la salute umana; Utilizzare un vaporizzatore per isoflurano approvato e ispezionato in un'area ben ventilata con mezzi di evacuazione dei gas di scarico.
   2. Una volta che il riflesso delle dita dei piedi è assente, radere la testa dell'animale. Applicare il lubrificante per gli occhi.
   3. Posizionare il mouse sul piano di lavoro con la testa nell'ogiva nasale per mantenere l'anestesia.
   4. Somministrare un agente analgesico, come la buprenorfina (0,6-0,8 mg/kg di peso corporeo del topo, per via sottocutanea), come indicato dal fornitore.
   5. Pulire il sito di iniezione strofinando la testina con una garza sterile imbevuta di una soluzione di iodio (eseguire tre scrub), quindi strofinare con un tampone scrub imbevuto di alcol (eseguire tre volte).
      NOTA: Rimuovere il pelo e pulire la pelle intorno al sito di iniezione e utilizzare strumenti e aghi sterili, come raccomandato dall'American Veterinary Medical Association per prevenire le infezioni.
4. Tenere saldamente la testa del mouse con la mano non dominante. Posizionare la testa il più possibile piatta sul piano di lavoro.
5. Individuare il sito dell'iniezione.
   1. Utilizzare l'ago affilato da 18 G preparato per identificare prima il bregma; Per questo, trascina l'ago sulla pelle della testa lungo la linea mediana, muovendoti sul piano rostrale-caudale. Immaginiamo un triangolo equilatero in cui i due vertici sono gli occhi e il terzo vertice è la posizione approssimativa di bregma (vedi Figura 1C).
   2. Da bregma, spostare l'ago di 2 mm lateralmente e 1 mm caudale nel sito di iniezione.
6. Tenendo l'ago in verticale, spingere con decisione l'ago attraverso la pelle e l'osso fino a quando il tubo non è a filo con la pelle.
7. Ritrarre l'ago, ruotare l'ago e premere nuovamente attraverso la pelle e l'osso. Ripeti il processo fino a creare un piccolo foro nell'osso.
8. Utilizzare l'ago smussato per verificare che sia stato prodotto un foro sufficiente nell'osso. Cerca di creare un'apertura nell'osso abbastanza grande da consentire il passaggio dell'ago smussato.
9. Rimuovere il topo dall'ogiva nasale, pulire il sangue dal sito di iniezione con una garza sterile e posizionare il topo in una gabbia su uno scaldagabbia fino al risveglio. Poiché l'apertura praticata dalla craniotomia è piccola (ago da 18 G), il sito non ha bisogno di essere chiuso con una sutura o clip per ferite.
   NOTA: L'apertura qui prodotta è piccola (18 G), quindi molte istituzioni considerano questa procedura un'iniezione piuttosto che un intervento chirurgico. Inoltre, sebbene venga praticata un'apertura attraverso la pelle e l'osso verso il cervello, tenere la pelle tesa fa sì che i fori non si allineino, il che probabilmente aiuta a prevenire il contatto della flora cutanea o della lettiera della gabbia con il cervello.

2. Effettuare l'iniezione

1. Preparare i materiali per l'iniezione come descritto di seguito.
   1. Posizionare un tappetino da banco pulito o un telo sul piano di lavoro. Fissare con del nastro adesivo l'ogiva di un vaporizzatore all'isoflurano sulla superficie di lavoro (vicino allo sperimentatore, ma rivolto in direzione opposta; vedere la Figura 1A).
   2. Applicare un ago da 27 G lungo 10 mm con uno smusso di 45° su una siringa di vetro da 5 μL. Posizionare il tubo silattico sull'ago in modo che sporgano 3,5 mm della punta dell'ago; utilizzare del nastro da laboratorio per fissare il tubo al corpo della siringa (vedere la Figura 1D).
   3. Preparare il mezzo di iniezione (farmaco, virus o altro liquido per l'iniezione) in un tubo. Per i risultati rappresentativi di questo studio, è stata iniettata soluzione salina isotonica sterile.
      NOTA: Selezionare una provetta che consenta l'accesso dalla siringa di vetro e dall'ago, ad esempio una provetta per microcentrifuga da 2 ml.
   4. Prelevare 3 μL di terreno di iniezione nella siringa di vetro. Innanzitutto, prelevare più del volume desiderato ed espellere fino a quando nella siringa rimangono 3 μL.
   5. Raccogli scrub allo iodio, garza sterile e tamponi imbevuti di alcol per preparare il sito di iniezione.
   6. Avviare un timer da laboratorio in modalità conto alla rovescia e posizionare il timer in modo che sia visibile allo sperimentatore durante le iniezioni.
   7. Esercitati a muovere un ago di 2 mm lateralmente e 1 mm caudale come eseguito il giorno precedente.
2. Preparare il topo per l'iniezione come descritto di seguito.
   1. Posizionare il topo nella camera di induzione e anestetizzare il topo con isoflurano. Una volta che il riflesso della punta è assente, applicare del lubrificante per gli occhi e posizionare il mouse sul piano di lavoro con la testa nell'ogiva del naso.
   2. Pulire il sito di iniezione con tre salviette di iodio e alcol ciascuna. Identificare il sito di iniezione con un ago da 18 G (o un ago smussato) come descritto al punto 1.8. Il foro creato durante la craniotomia dovrebbe essere rilevabile.
      NOTA: Se la craniotomia non è stata eseguita in anticipo, o se il foro nel cranio non è rilevabile, la craniotomia può essere eseguita qui.
3. Eseguire l'iniezione con una siringa di vetro come descritto di seguito.
   1. Tenere saldamente la testa del mouse con la mano non dominante. Posizionare la testa il più possibile piatta sul piano di lavoro.
   2. Inserire l'ago della siringa di vetro attraverso il foro del cranio fino a quando il tubo posto sopra l'ago preparato al punto 2.1.2 non poggia sulla pelle del topo.
   3. Tenere la siringa il più verticalmente possibile, prestando attenzione sia al piano coronale che a quello sagittale. Iniettare lentamente il terreno per un periodo di 1 minuto.
   4. Tenere la siringa e l'ago in posizione per un altro minuto dopo il completamento dell'iniezione per ridurre al minimo il riflusso. Ritrarre lentamente l'ago dalla testa del mouse.
   5. Rimuovere il topo dall'ogiva nasale, pulire il sangue dal sito di iniezione con una garza sterile (se presente) e posizionare il topo in una gabbia su uno scaldagabbia fino al risveglio.

3. Conferma della posizione di iniezione

1. Anestetizzare in profondità e perfondere il topo con soluzione fisiologica e paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) come descritto in precedenza⁸. Conservare il cervello in saccarosio al 30% in PBS a 4 °C fino a quando il cervello non affonda (in genere 2 giorni).
2. Tagliare sezioni coronali di 20-50 μm su un criostato come descritto in precedenza⁹. Durante il sezionamento, osservare il tratto di iniezione nel blocco di tessuto. Registrare se il tratto di iniezione interseca chiaramente il ventricolo laterale.

Results

Se eseguita con successo, questa tecnica consente la rapida somministrazione di un agente sperimentale nel sistema ventricolare. Un profilo di impulso dell'ormone luteinizzante (LH) da un topo ovariectomizzato che ha ricevuto un'iniezione ICV di 3 μL di soluzione salina isotonica sterile, il veicolo di molti composti farmacologici, è mostrato nella Figura 2A. Questo esempio dimostra che una breve esposizione all'anestesia gassosa e l'iniezione di 3 μL di liquido nel sistema ventricolare da sola non hanno alterato la secrezione pulsatile di LH. A 3 ore dall'iniezione di ICV, l'animale è stato sottoposto a eutanasia e il tessuto neurale appena congelato è stato raccolto e tagliato su un criostato; il tratto di iniezione si interseca chiaramente con il ventricolo laterale. Il tratto di iniezione era visibile anche nel tessuto neurale di topi perfusi con fissativo (10 mL di soluzione fisiologica eparinizzata seguiti da 20 mL di paraformaldeide al 4% in tampone fosfato). Esempi di iniezioni correttamente posizionate sono mostrati nella Figura 2B. Due esempi di iniezioni posizionate in modo errato sono mostrati nella Figura 2C. Esempi di iniezioni di inchiostro di china posizionate correttamente (a sinistra) e in modo errato sono mostrati nella Figura 2D. L'iniezione di inchiostro di china è utile per praticare questa tecnica in quanto consente una chiara visualizzazione della posizione di iniezione. Il flusso di colorante sia nei ventricoli laterali che nel terzo ventricolo può essere visto in iniezioni posizionate correttamente (Figura 2D, a sinistra).

Figura 1: Immagini che illustrano la preparazione dell'apparecchiatura e le coordinate di iniezione per le iniezioni ICV a mano libera. (A) Configurazione della stazione di lavoro per le iniezioni ICV a mano libera. (B) Schema per praticare il movimento necessario per effettuare l'iniezione di ICV in topi femmina C57/BL6 di 3-4 mesi. (C) Posizione approssimativa del bregma nei topi adulti. (D) Posizionamento del tubo per rivelare 3,5 mm della punta dell'ago per l'iniezione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Dati rappresentativi dell'ormone luteinizzante e dell'istologia relativi alle iniezioni di ICV a mano libera. (A) Profilo dell'impulso LH prima e dopo l'iniezione di ICV. I punti dati con riempimento nero solido rappresentano gli impulsi determinati utilizzando una riformulazione di PULSAR¹⁰ con i parametri suggeriti in tale riferimento per un topo OVX e un livello di rilevamento di 0,32 ng/mL. (B) Fotografie di una sezione coronale del cervello di topo con un'iniezione ICV correttamente posizionata. (C) Fotografie di una sezione coronale del cervello di topo con un'iniezione di ICV posizionata in modo errato: un tratto di iniezione laterale al ventricolo (a sinistra) e un tratto di iniezione dorsale al ventricolo (a destra). (D) Fotografie di una sezione coronale del cervello di topo con un'iniezione ICV di inchiostro di china posizionata correttamente (a sinistra) e un'iniezione ICV di inchiostro di china posizionata in modo errato (a destra). Nota: i pannelli B e C raffigurano cervelli perfusi con paraformaldeide raccolti 3 ore dopo l'iniezione di soluzione fisiologica; Il pannello D raffigura cervelli freschi raccolti su ghiaccio secco 2 minuti dopo l'iniezione di inchiostro di china. Barra della scala = 1 mm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Qui viene descritto un mezzo semplice ed efficace per effettuare iniezioni di ICV nei topi. Poiché questa tecnica non richiede una struttura stereotassica, questo approccio per la somministrazione centralizzata di farmaci e agenti sperimentali è accessibile a un maggior numero di ricercatori. Inoltre, questo approccio ha una produttività relativamente elevata poiché la procedura di preparazione e iniezione può essere eseguita rapidamente.

Poiché questa procedura richiede la manipolazione manuale di aghi e di una siringa di vetro utilizzando distanze approssimative, si consiglia al nuovo praticante di dedicare un po' di tempo alla pratica dei movimenti prima di lavorare con animali vivi. Inoltre, i cadaveri di topo possono essere utili per esercitarsi a identificare il bregma con l'ago. Una volta acquisita un po' di confidenza con il movimento, è utile fare esperienza con animali da pratica dal vivo. Durante le sessioni di pratica, l'iniezione di 3 μL di inchiostro di china facilita la valutazione visiva del posizionamento dell'iniezione. Le iniezioni correttamente posizionate si tradurranno in una colorazione nera nel ventricolo laterale omolaterale e spesso nel terzo ventricolo e nel ventricolo laterale controlaterale. L'iniezione di inchiostro è una procedura terminale e ai topi non deve essere permesso di riprendersi dall'anestesia dopo l'iniezione di inchiostro. Anche i medici esperti possono trarre beneficio dal provare il movimento laterale di 2 mm e caudale di 1 mm un paio di volte prima di effettuare un'iniezione. Inoltre, è importante tenere la siringa di vetro in posizione verticale quando viene inserita nel cervello. Con la pratica, ci si può aspettare che il >75% delle iniezioni sia posizionato correttamente. Tenere l'ago in posizione per ~1 minuto dopo che l'intero volume è stato iniettato può aiutare a prevenire il riflusso del liquido dal cervello. Durante questo periodo, è essenziale tenere l'ago nella posizione corretta senza muoversi. L'esecuzione di successo di questa procedura richiede esperienza nella manipolazione e nella tenuta affidabile dell'ago e della siringa di vetro.

Se alcune iniezioni non vengono posizionate correttamente, ci sono diverse opzioni per la risoluzione dei problemi. Innanzitutto, controllare che l'ago per iniezione sia dritto (non piegato) e che l'ago sia ben fissato alla siringa di vetro. Successivamente, se le iniezioni mancate sono variabili nella loro posizione, è necessaria un'ulteriore pratica di manipolazione e tenuta della siringa di vetro. Può essere utile anche avere una persona in più per individuare se la siringa viene tenuta verticalmente durante l'iniezione. Anche trovare il bregma sulla pelle intatta con l'ago richiede pratica. Si raccomanda vivamente di dedicare del tempo per identificare con sicurezza questo punto di riferimento prima di procedere con l'iniezione. Se le iniezioni vengono costantemente posizionate in una posizione errata, sarà necessario modificare le coordinate di iniezione. Le coordinate qui descritte (±2 mm laterali, 1 mm caudale rispetto al bregma) sono efficaci nei topi adulti C57/BL6, ma potrebbe essere necessario adattarle per altri ceppi o gruppi di età.

Sebbene questa tecnica possa essere molto efficace per fornire rapidamente agenti a livello centrale, ci sono alcune limitazioni. Poiché lo stantuffo della siringa viene spostato manualmente, la velocità di iniezione può essere variabile. Si consiglia di iniettarlo relativamente lentamente per evitare potenziali effetti fuori bersaglio della pressione nel sistema ventricolare. In questo protocollo si raccomanda un volume di iniezione di 3 μL; tuttavia, un volume di iniezione maggiore (5 μL) è stato utilizzato in altri laboratori¹¹. A seconda del risultato misurato, potrebbe essere necessario regolare il volume e la velocità di iniezione. Ad esempio, i topi giovani possono tollerare solo volumi di iniezione più piccoli. Pertanto, si raccomandano esperimenti preliminari per testare gli effetti del veicolo. Un'ulteriore limitazione è che la conferma del corretto posizionamento dell'iniezione è limitata a una valutazione in qualche modo soggettiva del tratto di iniezione dopo che il tessuto è stato raccolto. Il tratto di iniezione è visibile sia nel tessuto fresco congelato che in quello perfuso con paraformaldeide raccolto diverse ore dopo l'iniezione di ICV (vedere le immagini nei risultati rappresentativi). Se vengono effettuate più iniezioni, potrebbe non essere chiaro dai segni del tratto se ogni iniezione è stata effettuata con successo.

Questo approccio a mano libera per effettuare iniezioni di ICV richiede l'anestesia. Con la pratica, le iniezioni possono essere effettuate rapidamente, con conseguente breve esposizione (3-5 minuti) all'anestetico. Radendo la testa del topo ed eseguendo la craniotomia (perforazione del cranio con un ago affilato) prima del giorno sperimentale, è possibile ridurre il tempo sotto anestesia durante l'esperimento. I topi in genere si riprendono completamente da questa breve esposizione all'anestesia entro pochi minuti. La raccolta di campioni di sangue dalla punta della coda subito dopo l'anestesia può essere impegnativa, quindi il campionamento può essere sospeso per ~ 30 minuti dopo l'iniezione per ridurre al minimo lo stress nei topi, anche se questo non è strettamente necessario. Anche altri laboratori hanno misurato con successo i cambiamenti nella secrezione di LH (campioni una tantum) 30 minuti dopo la somministrazione di agenti farmacologici utilizzando questa tecnica ICV a mano libera ^1,12. Cambiamenti nel comportamento locomotore e inattivo in un periodo di 24 ore sono stati rilevati anche dopo le iniezioni di ICV¹³, in modo da poter eseguire un monitoraggio a lungo termine. Si raccomanda l'esecuzione di test preliminari per determinare la facilità di campionamento e i potenziali effetti dell'anestesia sugli esiti di interesse.

In sintesi, la tecnica di iniezione ICV a mano libera qui descritta è un metodo semplice ma potente per somministrare agenti sperimentali nel cervello. I vantaggi specifici sono che l'approccio è rapido e tecnicamente semplice e consente un alto tasso di iniezioni effettuate con successo. Inoltre, poiché questa tecnica richiede solo una breve esposizione all'anestesia, può essere combinata con una varietà di altre tecniche come frequenti prelievi di sangue, manipolazione di circuiti neurali o registrazione in vivo per studiare i processi neuroendocrini.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aghi smussati calibro 18 SAI	Infusion	B18-150
Aghi calibro 18	BD Medical	305195
Tamponi imbevuti di alcol	Fisher Scientific	22-363-750
Cuscinetto da banco	Fisher Scientific	14-206-62AC22
Soluzione di betadina	Fisher Scientific	NC1696484
Buprenorfina	Patterson Vet Supply	07-892-5235	Sostanza controllata
Eyelube	Fisher Scientific	50-218-8442
Siringa di vetro	Hamilton	7634-01
Ago per iniezione	Hamilton	7803-01	27 gauge, ago RN a mozzo piccolo, stile di punta: 4, lunghezza dell'ago: 10 cm, angolo: 45
isoflurano	Patterson Vet Supply	07-893-8441
Vaporizzatore di isoflurano	Vet Equip	V-10
Nastro da laboratorio	VWR	89098-128
Ossigeno di grado medico	Airgas	OX USPEA
Paraformaldeide	Millipore-Sigma	8.18715.1000
Soluzione salina tamponata con fosfato	Fisher Scientific	J67802. Software K2
PulsaR	Open source, Università di Otago		Vedi ref 9
Ruler	Fisher Scientific	12-00-152
Tubi silastici (0,040" ID)	DOW	508-005
Tubi Silastic (0,078" ID)	DOW	508-009
Soluzione salina sterile	VWR	101320-574
Saccarosio	Fisher Scientific	S5-500