Questo protocollo delinea la quantificazione delle proprietà meccaniche di linee cellulari cancerose e non cancerose in vitro. Le differenze conservate nella meccanica delle cellule cancerose e normali possono agire come un biomarcatore che può avere implicazioni nella prognosi e nella diagnosi.
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Articolo metodologico
Protocollo di saggio di taglio per la determinazione delle proprietà dei materiali a singola cellula
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La biomeccanica irregolare è un segno distintivo della biologia del cancro soggetta a studi approfonditi. Le proprietà meccaniche di una cella sono simili a quelle di un materiale. La resistenza di una cellula allo stress e alla tensione, il suo tempo di rilassamento e la sua elasticità sono tutte proprietà che possono essere derivate e confrontate con altri tipi di cellule. Quantificare le proprietà meccaniche delle cellule cancerose (maligne) rispetto alle cellule normali (non maligne) consente ai ricercatori di scoprire ulteriormente i fondamenti biofisici di questa malattia. Mentre le proprietà meccaniche delle cellule tumorali sono note per differire costantemente dalle proprietà meccaniche delle cellule normali, manca una procedura sperimentale standard per dedurre queste proprietà dalle cellule in coltura.
Questo articolo delinea una procedura per quantificare le proprietà meccaniche di singole cellule in vitro utilizzando un saggio a taglio fluido. Il principio alla base di questo test comporta l'applicazione dello sforzo di taglio del fluido su una singola cellula e il monitoraggio ottico della deformazione cellulare risultante nel tempo. Le proprietà meccaniche delle celle vengono successivamente caratterizzate utilizzando l'analisi di correlazione delle immagini digitali (DIC) e adattando un modello viscoelastico appropriato ai dati sperimentali generati dall'analisi DIC. Nel complesso, il protocollo qui delineato mira a fornire un metodo più efficace e mirato per la diagnosi di tumori difficili da trattare.
Introduzione
Lo studio delle differenze biofisiche tra cellule cancerose e non cancerose consente nuove opportunità diagnostiche e terapeutiche1. Comprendere come le differenze nella biomeccanica / meccanobiologia contribuiscono alla progressione del tumore e alla resistenza al trattamento rivelerà nuove strade per la terapia mirata e la diagnosi precoce2.
Mentre è noto che le proprietà meccaniche delle cellule tumorali differiscono dalle cellule normali (ad esempio, viscoelasticità della membrana plasmatica e dell'involucro nucleare)3,4,5,
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Protocollo
1. Preparazione per il saggio di taglio a cellula singola
- Coltura cellulare
- Seminare circa 50.000 cellule singole sospese in una capsula di Petri di 35 mm x 10 mm contenente 2 ml di terreno di coltura.
NOTA: Vortice le celle sospese prima della semina per rompere gli aggregati cellulari. - Incubare le cellule a 37 °C e consentire tra 10 e 48 ore per l'attaccamento cellulare e la formazione completa della proteina citoscheletrica.
NOTA: Considerare la durata dell'attaccamento cellulare, così come i tassi di proliferazione e crescita, per garantire un'adeguata crescita cellulare e attaccamento evitando l'aggregazione cell....
- Seminare circa 50.000 cellule singole sospese in una capsula di Petri di 35 mm x 10 mm contenente 2 ml di terreno di coltura.
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Risultati
Il protocollo di saggio a taglio accoppiato con l'analisi della deformazione utilizzando DIC e un modello viscoelastico è riuscito a quantificare le proprietà meccaniche di una singola cella in vitro. Questo metodo è stato testato su linee cellulari umane e murine, tra cui cellule mammarie umane normali (MCF-10A)3,4,9, cellule di carcinoma mammario triplo negativo meno metastatiche (MDA-MB-468)3, cellule di carcinoma mammario triplo negativo (MDA-MB-231)3, cellule di osteosarcoma umano
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Discussione
Il metodo di saggio di taglio, che include la creazione di un ambiente pseudo-meccanobiologico per simulare l'interazione delle cellule con il microambiente meccanico circostante e le loro risposte alle sollecitazioni meccaniche, ha prodotto un catalogo di proprietà meccaniche cellulari, i cui modelli mostrano atipie fisiche conservate tra le linee cellulari cancerose 3,4,5,7,8
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano i precedenti ricercatori del gruppo Soboyejo del Worcester Polytechnic Institute che per primi hanno aperto la strada a questa tecnica: i dottori Yifang Cao, Jingjie Hu e Vanessa Uzonwanne. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Cancer Institute (NIH / NCI K22 CA258410 a M.D.). Le figure sono state create con BioRender.com.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| COLTURA CELLULARE | |||
| ,25% Tripsina, 2,21 mM EDTA, 1x[-] bicarbonato di sodio | Corning | 25-053-ci | Per il distacco cellulare dal substrato in coltura cellulare |
| 15 mL Provette da centrifuga | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| Piastre di Petri da 35 mm | Corning | 430165 | |
| Provette | da centrifuga da 50 mLFalcon by Corning | 14-432-22 | |
| Centrifuga | qualsiasi | Per colture cellulari sterili | |
| Modifica di Dulbecco del terreno di Eagle (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | O qualsiasi altro mezzo per la coltura di cellule. Il DMEM è stato utilizzato per la coltura di cellule U87 |
| Guanti | qualsiasi | Per colture cellulari sterili | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubatore | Thermo Scientific | Per l'incubazione durante la coltura cellulare | |
| Cappa | qualsiasi | Per colture cellulari sterili | |
| Micropipetta | qualsiasi | Per colture cellulari sterili | |
| Puntali per micropipette | qualsiasi | Per colture cellulari sterili | |
| Microscopio | Leica/qualsiasi | Per colture cellulari sterili | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio e magnesio PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| Pipetman | qualsiasi | Per colture cellulari sterili | |
| Puntali per pipette | qualsiasi | Per colture cellulari sterili | |
| Incubatore per liquidi GP 10 di precisione | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 | Flask Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| <>strongSHEAR ASSAY | |||
| 100 mL | becher qualsiasi | Per la creazione di DMEM + metilcellulosa mezzi di taglio viscosi | |
| DMEM | Corning | ||
| Camera di flusso + guarnizione in gomma | Glycotech | 31-001 | Kit camera di flusso circolare (per piastre di coltura tissutale da 35 mm) |
| Reometro ibrido | HR-2 Discovery Reometro | Per la determinazione della viscosità del fluido di taglio Barra di agitazione | |
| magnetica | qualsiasi | Per la creazione di DMEM + mezzi di taglio viscosi di metilcellulosa | |
| Piastra di agitazione magnetica | qualsiasi | Per la creazione di DMEM + mezzi di taglio viscosi di metilcellulosa | |
| Metilcellulosa qualsiasi | Per aumentare la viscosità del DMEM nei mezzi di flusso | ||
| Pompa a siringa | KD Scientific Geminin 88 plus | Per la programmazione dell'infusione e del prelievo di fluidi | |
| Siringhe, tubi e connettori | Per la configurazione dell'apparato di taglio | ||
| SOFTWARE | |||
| Software ABAQUS | Software Simulia | ||
| Digitial Image Correlation | LaVision, Germania | DAVIS 10.1.2 | |
| Software di imaging | Software per microscopio | ||
| MATLAB | MATLAB MATLAB_R2020B |
Riferimenti
- Sethi, S., Ali, S., Philip, P. A., Sarkar, F. H. Clinical advances in molecular biomarkers for cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14771-14784 (2013).
- Runel, G., Lopez-Ramirez, N., Chlasta, J., Masse, I. Biomechanical properties of ....
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Ristampe e permessi
