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Articolo metodologico

Perfusione epatica isolata normotermica suina

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DOI:

10.3791/65336

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9 giugno 2023

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1Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, Laboratory of Abdominal Transplantation, KU Leuven, 2Department of Abdominal Transplant Surgery and Coordination, University Hospitals Leuven

In questo articolo

Sommario

Il modello suino di perfusione meccanica normotermica epatica (NMP), qui descritto, può essere utilizzato con successo per studiare l'NMP come strategia di conservazione, strumento per la valutazione della vitalità e piattaforma per la riparazione d'organo. Ha un alto valore traslazionale, tuttavia è tecnicamente impegnativo e laborioso.

Abstract

I modelli suini di perfusione meccanica normotermica (NMP) ex situ del fegato sono sempre più utilizzati nella ricerca sui trapianti. A differenza dei roditori, i fegati suini sono anatomicamente e fisiologicamente vicini all'uomo, con dimensioni degli organi e composizione biliare simili. L'NMP preserva l'innesto epatico in condizioni quasi fisiologiche facendo ricircolare un perfusato a base di globuli rossi caldo, ossigenato e arricchito di sostanze nutritive attraverso il sistema vascolare epatico. L'NMP può essere utilizzato per studiare il danno da ischemia-riperfusione, preservare un fegato ex situ prima del trapianto, valutare la funzione del fegato prima dell'impianto e fornire una piattaforma per la riparazione e la rigenerazione degli organi. In alternativa, l'NMP con un perfusato a base di sangue intero può essere utilizzato per imitare il trapianto. Tuttavia, questo modello è laborioso, tecnicamente impegnativo e comporta un costo finanziario elevato.

In questo modello NMP suino, utilizziamo fegati ischemici caldi danneggiati (corrispondenti alla donazione dopo la morte circolatoria). In primo luogo, viene avviata l'anestesia generale con ventilazione meccanica, seguita dall'induzione dell'ischemia calda bloccando l'aorta toracica per 60 minuti. Le cannule inserite nell'aorta addominale e nella vena porta consentono il lavaggio del fegato con una soluzione di conservazione fredda. Il sangue espulso viene lavato con un salva cellule per ottenere globuli rossi concentrati. Dopo l'epatectomia, le cannule vengono inserite nella vena porta, nell'arteria epatica e nella vena cava infraepatica e collegate a un circuito di perfusione chiuso innescato con un espansore plasmatico e globuli rossi. Un ossigenatore a fibra cava è incluso nel circuito e accoppiato a uno scambiatore di calore per mantenere una pO2 di 70-100 mmHg a 38 °C. L'NMP è ottenuto da un flusso continuo direttamente attraverso l'arteria e attraverso un serbatoio venoso attraverso la vena porta. I flussi, le pressioni e i valori dei gas ematici sono costantemente monitorati. Per valutare il danno epatico, il perfusato e il tessuto vengono campionati in punti temporali predefiniti; La bile viene raccolta tramite una cannula nel dotto biliare comune.

Introduzione

Il trapianto di fegato è l'unico trattamento definitivo per l'insufficienza epatica allo stadio terminale; Tuttavia, il suo successo è limitato da un persistente squilibrio tra i pazienti in lista d'attesa e la disponibilità di potenziali organi da donatori1. Per aumentare il pool di donatori, nell'ultimo decennio sono stati gradualmente ampliati i criteri dei donatori, tra cui l'età avanzata del donatore, la steatosi epatica e la donazione dopo la morte circolatoria (DCD)2,3. Durante una procedura di DCD, il fegato subisce invariabilmente un periodo di ischemia calda tra la sospensione della terapia di sostegno vitale, la dichiarazione di morte e il raffreddamento e la conservazione in situ, aggravando il danno da ischemia-riperfusione (IRI)4. Di conseguenza, i fegati DCD sono associati a un'aumentata incidenza di disfunzione precoce dell'allotrapianto e complicanze biliari 5,6.

Per questi fegati di donatori ad alto rischio, la conservazione convenzionale con celle frigorifere statiche non offre una protezione sufficiente contro l'IRI. Finora, le strategie di conservazione alternative come la perfusione meccanica normotermica (NMP) hanno guadagnato una notevole trazione. Durante la perfusione meccanica normotermica, il fegato viene collegato ex situ a un circuito isolato e perfuso con un perfusato ossigenato e arricchito di sostanze nutritive a temperatura corporea. Gli studi clinici suggeriscono che l'NMP riduce il danno epatocellulare, come riflesso dalla riduzione del picco di rilascio delle transaminasi e dalla disfunzione precoce dell'allotrapianto7. Tuttavia, si sa poco sulla biologia delle cellule epatiche durante NMP8.

I modelli animali sono stati fondamentali nell'evoluzione del trapianto di fegato. A differenza dei modelli di roditori, il maiale è considerato di valore traslazionale più elevato in quanto il fegato suino è anatomicamente e fisiologicamente vicino all'uomo, con dimensioni degli organi e composizione biliare simili. Tuttavia, i modelli di trapianto di fegato suino sono laboriosi, difficili da standardizzare e comportano un costo finanziario significativamente più elevato.

L'NMP del fegato suino può essere utilizzato per scopi diversi. Può essere applicato per imitare il trapianto ex situ quando si utilizza un perfusato a base di sangue intero, per preservare il fegato di un donatore in un ambiente protettivo con un perfusato a base di globuli rossi impoverito di leucociti, per valutare potenziali biomarcatori che predicono la funzionalità epatica ex situ prima del trapianto o come piattaforma per studiare la terapia rigenerativa 9,10,11.

L'adozione di modelli NMP di fegato suino è impegnativa, mentre gli aspetti tecnici chirurgici e legati alla perfusione sono scarsamente descritti. Nel nostro laboratorio di ricerca, abbiamo adottato la configurazione NMP originariamente descritta da Butler et al.12 per sviluppare e convalidare un modello di perfusione epatica isolata ex situ suina 24 ore su 24 che potrebbe essere utilizzato sia per conservare un trapianto di fegato per il trapianto che per imitare un trapianto. Qui, descriviamo un protocollo passo dopo passo; Un quadro metodologico e le potenziali insidie sono pubblicati altrove9.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti dopo l'approvazione del comitato per la cura degli animali della KU Leuven e in linea con le linee guida europee.

1. Informazioni sugli animali

NOTA: Per questo protocollo di studio vengono utilizzati suini maschi TOPIGS TN70, di età pari a 3 mesi, con un peso corporeo di circa 30 kg e un peso del fegato di 600-700 g.

  1. Mantieni gli animali sotto un ritmo giorno/notte di 12 ore in recinti singoli con libero accesso al cibo e all'acqua del rubinetto e contatto visivo, olfattivo e uditivo tra di loro.
  2. Assicurati che gli animali arrivino almeno 2 giorni prima dell'intervento per abituarsi all'ambiente circostante. Digiunare i suini per 12 ore prima dell'intervento chirurgico con libero accesso all'acqua.
    NOTA: L'anestesia viene mantenuta con isoflurano e l'analgesia con fentanil. Durante l'anestesia, l'elettrocardiogramma, la pulsossimetria, la capnografia e la pressione sanguigna vengono continuamente monitorati. Gli esperimenti sono terminali; I suini vengono soppressi mediante dissanguamento mentre si procurano il fegato in anestesia generale e analgesia continua.

2. Preparazione dell'impianto di perfusione

  1. Installazione del kit di perfusione monouso
    1. Fissare il serbatoio a un'altezza fissa di circa 15 cm più alta del ricettacolo epatico.
    2. Collegare la testa della pompa all'apposita fessura sulla pompa centrifuga. Collegare il tubo dell'ossigeno all'ossigenatore. Collegare i tubi di ingresso e di uscita del riscaldatore/raffreddatore alle apposite fessure sull'ossigenatore.
    3. Installare una valvola a manicotto sul tubo di deflusso sotto il serbatoio. Installare la seconda valvola a manicotto sul tubo di afflusso al serbatoio dopo la connessione a Y, dove l'altro tubo alimenterà l'arteria epatica.
      NOTA: La prima valvola a manicotto controllerà l'afflusso nella vena porta. La chiusura della seconda valvola a manicotto aumenterà il flusso, e quindi anche la pressione nell'arteria epatica.
    4. Installare il sensore di flusso distalmente dalla prima valvola a manicotto sul tubo di deflusso del serbatoio. Installare il secondo sensore di flusso sul tubo di afflusso sulla testa della pompa.
      NOTA: Il primo sensore di flusso misurerà il flusso nella vena porta. Il secondo sensore di flusso misurerà il deflusso dalla vena cava.
    5. Tagliare il tubo di deflusso dall'ossigenatore e inserire il filtro arterioso nella direzione corretta.
      NOTA: Tagliare il tubo a non più lungo di 2 cm dopo l'ossigenatore; se viene lasciato troppo a lungo, si attorciglia quando il tubo diventa più morbido quando viene perfuso con un perfuso a 37 °C. Se ancora si attorciglia, sostenere il filtro arterioso legandolo al supporto del serbatoio.
  2. Installazione del tubo di ricircolo delle perdite
    1. Il kit di perfusione contiene due provette con un'estremità da 3/16 e un'estremità da 1/16. Collegare i due tubi tra loro inserendo l'estremità da 1/16 nell'estremità da 3/16. Collegare l'estremità 3/16 al serbatoio.
    2. Installare il tubo nella pompa a rulli, considerando il senso di rotazione. Impostare il diametro corretto del tubo e impostare la velocità su 15-18 rotazioni al minuto (rpm). Posizionare l'estremità 1/16 nel recipiente del fegato e fissare se necessario.
  3. Taratura continua dell'emogasanalisi in linea
    1. Accendere l'analizzatore di gas e selezionare Calibra.
    2. Controllare il numero di serie corretto sulla confezione del sensore e premere OK.
    3. Estrarre il supporto del sensore arterioso dalla cassetta e collegarlo ad esso con un tappo blu in alto e un filtro bianco in basso.
    4. Svitare e rimuovere il tappo bianco sotto il filtro; Non svitare il filtro stesso. Allentare il tappo di sfiato blu sulla parte superiore, non rimuoverlo. Inserire saldamente il sensore e il supporto del sensore nella cassetta di calibrazione.
    5. Avviare la calibrazione. Al termine della calibrazione, rimuovere il sensore e il supporto del sensore dalla cassetta di calibrazione. Rimuovere il filtro bianco sul fondo e serrare il tappo di sfiato blu sulla parte superiore.
    6. Inserire il sensore nella linea di campionamento del kit di perfusione. Non iniziare l'analisi dei gas fino a quando il circuito di perfusione non è stato innescato.
  4. Adescamento del circuito
    1. Inserire una linea di infusione in una sacca da 500 ml di espansore al plasma e collegarla al serbatoio. Posizionare una fascetta sulla linea di deflusso del serbatoio e riempire il serbatoio con 300 ml di espansore al plasma.
    2. Rimuovere il morsetto del tubo e lasciare che l'espansore al plasma riempia il circuito
    3. Disaerare la testa della pompa e l'ossigenatore. Il circuito è ora innescato. Accendere il riscaldatore/raffreddatore e impostarlo a 38 °C
  5. Preparazione delle linee di infusione
    1. Aspirare 5 mL (25.000 U) di una soluzione di eparina da 5 U/mL in una siringa da 50 mL. Aspirare altri 25 mL di soluzione di NaCl allo 0,9% per ottenere un volume totale di 30 mL di soluzione di eparina (velocità di infusione: 1 mL/h).
    2. Sciogliere 5 g di taurocolato di sodio in 50 mL di NaCl allo 0,9% e aspirarlo in 450 mL di NaCl allo 0,9% per raggiungere una concentrazione dell'1%. È necessario un volume totale di 168 mL (velocità di infusione: 7 mL/h).
    3. Aspirare 2 mL (200 U) di una soluzione di insulina da 100 U/mL in una siringa da 50 mL. Aspirare altri 28 mL di soluzione di NaCl allo 0,9% per ottenere un volume totale di 30 mL di soluzione di insulina (velocità di infusione: 1 mL/h).
    4. Aspirare 10 mL di tampone glicina (diluente) e aggiungerlo al flaconcino da 0,5 mg di epoprostenolo. Utilizzando il filtro microbico fornito nel kit di epoprostenolo, aspirare 5 mL dal flaconcino contenente l'epoprostenolo ricostituito con tampone glicina in una siringa da 50 mL. Prelevare altri 25 mL di soluzione di NaCl allo 0,9% per ottenere un volume totale di 30 mL di soluzione di epoprostenolo (velocità di infusione: 1 mL/h).

3. Induzione dell'anestesia

  1. Sedazione
    1. Preparare una siringa con 2 mg/kg di xilazina e 8 mg/kg di Zoletil (4 mg/kg di tiletamina e 4 mg/kg di zolazepam), una siringa con 10 ml di NaCl allo 0,9%, una valvola a tre vie, una linea di prolunga e un ago intramuscolare da 21 G.
    2. Posizionare l'ago nel muscolo gluteo, iniettare la miscela di xilazina e tiletamina e lavare la linea di prolunga con NaCl allo 0,9%. Dopo 15 minuti, il maiale viene sedato.
    3. Pesare il maiale e trasportarlo in sala operatoria.
  2. Anestesia
    1. Accendi il ventilatore
    2. Posizionare il maiale in posizione supina sul tavolo operatorio e fissare le estremità.
    3. Preossigenare con una maschera di ventilazione con 1,5 L di O2, 1,5 L di aria e 1% di isoflurano.
    4. Collegare una sonda di saturazione alla coda o all'orecchio. Collegare i tre elettrocardiogrammi per un monitoraggio continuo.
    5. Inserire un catetere da 22 G in una vena auricolare, collegarlo a una valvola a tre vie e avviare una flebo di liquidi per via endovenosa (IV) (Plasmalyte) a una velocità di 400 mL/h.
    6. Inserire una siringa da 60 ml con 50 μg/mL di fentanil in un driver automatico per siringhe. Somministrare un bolo di 1 mL e iniziare un'infusione continua a una velocità di 0,16 mL/kg/h.
    7. Rimuovere la maschera di ventilazione e inserire il laringoscopio, sollevando l'epiglottide. Inserire un tubo endotracheale nella trachea e gonfiare il palloncino per evitare perdite d'aria. Fissare il tubo con del nastro adesivo al muso del maiale.
      NOTA: Chiudere l'isoflurano quando si rimuove la maschera di ventilazione.
    8. Collegare il tubo endotracheale al ventilatore.
      NOTA: Impostazioni del ventilatore: volume corrente di 0,4 L; 0,5 kPa di pressione media delle vie aeree; pressione delle vie aeree di 2,5 kPa; 0,5 kPa pressione positiva di fine espirazione; frequenza 15/min; 4,7-5,3 kPa CO2 di fine espirazione.
    9. Collegare il capnografo al tubo endotracheale.

4. Chirurgia

  1. Catetere venoso profondo e linea arteriosa
    1. Disinfettare il campo chirurgico con betadine e posizionare i teli su entrambi i lati della linea mediana.
    2. Praticare un'incisione lunga 7 cm dal lato sinistro della parte superiore dello sterno lateralmente al muscolo sternocleidomastoideo e posizionare un divaricatore ortostatico.
    3. Sezionare il tessuto sottocutaneo dal muscolo in direzione laterale e identificare la vena giugulare esterna. Sezionare liberamente la vena, legando i rami laterali se presenti.
    4. Posizionare due legature 2/0 attorno alla vena giugulare esterna e legare la legatura cranica.
    5. Tagliare la vena caudale dalla legatura legata e inserire un catetere venoso francese da 12.
      NOTA: Assicurarsi che il catetere venoso sia lavato con soluzione fisiologica eparinizzata prima dell'inserimento.
    6. Fissare il catetere con la seconda legatura. Se il catetere venoso nella vena dell'orecchio è fragile o troppo piccolo, passare il fluido EV e le linee di fentanil al catetere venoso profondo. In caso contrario, non utilizzarlo fino alla raccolta del sangue nel salva cellule.
    7. Sezionare il bordo mediale del muscolo sternocleidomastoideo e sostituire il divaricatore ortostatico aprendo il piano tra il muscolo sternocleidomastoideo sul lato laterale e la trachea sul lato mediale.
    8. Rimuovere il timo per esporre l'arteria carotide. Ripetere il passaggio 4.1.4 per l'arteria.
    9. Inserire la linea arteriosa nell'arteria carotide in direzione caudale e fissare. Collegare la linea arteriosa alla linea del monitor della pressione.
  2. Dissezione dell'aorta e della vena cava
    1. Eseguire una laparotomia della linea mediana dallo xifoide all'osso pubico.
      NOTA: Nei suini maschi, caudale dal pene, incidere 1 cm lateralmente dalla linea mediana per evitare di danneggiare l'uretra sottocutanea.
    2. Transetto del legamento ombelicale. Posizionare un divaricatore addominale. Tirare l'intestino a sinistra lateralmente e cranialmente per visualizzare l'aorta e la vena cava.
      NOTA: L'intestino suino non è ruotato; Pertanto, non è necessaria alcuna mobilizzazione del colon per accedere al retroperitoneo.
    3. Sezionare liberamente circa 3 cm dell'aorta appena craniale della biforcazione iliaca e posizionare due legature attorno all'aorta.
      NOTA: C'è un grande vaso linfatico vicino all'aorta; Fare attenzione a non danneggiarlo in quanto ciò offuscherà il campo chirurgico e complicherà la dissezione.
    4. Sezionare la vena cava allo stesso livello dell'aorta e posizionare due legature.
  3. Dissezione del legamento gastroduodenale
    1. Iniziare la dissezione sul lato laterale del legamento gastroduodenale, sezionare il dotto biliare comune e circondarlo con un'ansa vasale.
    2. Ritrarre il dotto biliare sul lato mediale, esponendo la vena porta. Rimuovere un grande linfonodo sul lato laterale della vena porta
    3. Liberare la vena porta verso il pancreas; C'è spesso un ramo dello stomaco e del pancreas che deve essere legato e sezionato. Circonda la vena porta con un anello del vaso sul lato del fegato e una legatura sul lato del pancreas. Ritrarre lateralmente la vena porta, facendo attenzione a non chiuderla.
    4. Identificare l'arteria epatica comune e circondarla con un'ansa vasativa.
  4. Dissezione dell'aorta toracica
    1. Tirare la caudale epatica e aprire ventralmente la parte tendinea centrale del diaframma dalla vena cava sopraepatica. Ritrarre l'esofago sul lato destro, esponendo l'aorta toracica.
    2. Sezionare senza lasciare il tessuto circostante e fare attenzione a non danneggiare la vena azygos.
      NOTA: Non è necessario circondare l'aorta toracica; La dissezione deve essere estesa a sufficienza per posizionare un morsetto vascolare.
  5. Preparazione del salva celle
    1. Appendere il serbatoio nell'anello nero, rimuovere il tappo dalla singola gamba dell'adattatore e collegare il tubo alla porta di uscita da 3/8 di pollice sul fondo del serbatoio di raccolta del sangue.
    2. Stappare il tubo di aspirazione/anticoagulante e collegarlo a una delle porte di ingresso del sangue da 1/4 di pollice sul bordo superiore del serbatoio di raccolta del sangue.
    3. Inserire la vasca del kit di lavaggio ruotandola; Assicurati che si senta un clic.
    4. Posizionare il tubo nella pompa a rulli e nel divisore del tubo.
    5. Appendere una sacca per la raccolta del sangue citrato fosfato destrosio adenina (CPDA)-1 al palo e assicurarsi che la connessione sia ben salda.
      NOTA: Composizione della sacca di sangue CPDA-1 (63 mL): 2,99 g/L di acido citrico anidro; 26,3 g/L di citrato di sodio disidro; 2,22 g/L di fosfato sodico monoitrato; 31,9 g/L di destrosio monoidrato; 0,275 g/L di adenina.
    6. Appendere il sacchetto dei rifiuti sul lato della macchina (assicurarsi che sia chiuso correttamente) e collegarlo al kit di lavaggio (tappo giallo).
    7. Collegare entrambi i tubi a forma di Y (tappi bianchi) a un sacchetto da 3 L di NaCl allo 0,9%.
    8. Collegare la provetta con il tappo blu al tubo adattatore sul fondo del serbatoio di raccolta del sangue. Accendere il sistema di autotrasfusione.
  6. Incannulamento dell'aorta e della vena cava
    1. Somministrare 500 UI/kg di eparina e lasciarla circolare per 2 minuti. Legare la legatura caudale attorno all'aorta e inserire una cannula francese 20 nell'aorta e fissare. La stessa procedura viene ripetuta per la vena cava.
  7. Per imitare una procedura DCD, l'ischemia calda viene indotta bloccando l'aorta toracica per un periodo di tempo, in questo caso 60 minuti.
    NOTA: Durante l'ischemia calda, il drenaggio cavale e giugulare viene aperto e viene avviata la raccolta del sangue al salva cellule. Ciò si traduce nel dissanguamento del maiale.
  8. Lavaggio del fegato
    1. Al termine dell'ischemia calda, iniziare una vampata di calore con 2 L di soluzione conservante ghiacciata (4-6 °C) attraverso la cannula aortica e raffreddare l'addome con un'applicazione topica di granita.
      NOTA: Durante il flusso di freddo, tutto il sangue rimanente viene espulso e raccolto nel salva cellule.
    2. Quando i primi 2 L sono stati lavati, rimuovere la cannula dall'aorta, legare la legatura sulla vena porta e incannulare la vena porta. Quindi, fissarlo con l'anello del vaso.
    3. Sciacquare il fegato attraverso la vena porta con altri 2 L di soluzione di conservazione ghiacciata (4-6°C).
  9. Hepatectomy
    1. Togliete il ghiaccio dall'addome. Sezionare il dotto biliare vicino al pancreas.
    2. Rimuovere la cannula portale e dividere la vena porta. Ritrarre l'intestino a sinistra per esporre la vena cava infraepatica.
    3. Sezionare la vena cava libera dal retroperitoneo e dividere solo il cranio dalle vene renali. Sezionare l'arteria epatica comune fino all'arteria celiaca e originare dall'aorta.
      NOTA: Il taglio dei cru diaframmatici destri può migliorare l'esposizione.
    4. Dividere l'arteria gastroduodenale e tagliare l'arteria celiaca con una macchia dell'aorta. Transetto dell'omento minore vicino allo stomaco cranialmente fino all'esofago
    5. Mobilizzare il fegato sinistro tagliando il legamento triangolare sinistro. Tagliare il diaframma sul lato sinistro della vena cava.
    6. Mobilizzare il fegato destro tagliando il diaframma destro da ventrale a dorsale, terminando appena caudalmente dalla transezione infraepatica della vena cava.
    7. Tagliare la vena cava sopraepatica e tagliare gli eventuali accessori rimanenti. Il fegato è ora libero; Toglietelo e mettetelo in una ciotola con acqua ghiacciata.
  10. Procedura di back-table
    1. Pesare il fegato. Cannulare la vena porta con una cannula francese 25 e fissarla con legature. Cannulare l'arteria epatica con una cannula rinforzata a 14 francesi e fissarla con legature.
    2. Incannulare la vena cava infraepatica e posizionare la punta della cannula al livello in cui le vene epatiche drenano nella vena cava. Fissare con le legature.
    3. Metti un cordino intorno al bordo del diaframma per evitare sanguinamenti da eventuali vene diaframmatiche e lega la vena cava sopraepatica.
    4. Disaerare la cannula porta ed eseguire un lavaggio della vena porta con 250 mL di espansore al plasma freddo. Verificare la presenza di eventuali perdite.
      NOTA: Verificare l'adeguato deflusso attraverso la cannula cavale.
    5. Dopo il lavaggio del portale, posizionare un morsetto per tubi sulla cannula del portale, assicurandosi che l'aria non entri nella cannula e nella vena porta.
    6. Disaerare la cannula arteriosa e far scorrere 250 ml di espansore di plasma freddo attraverso l'arteria epatica. Verificare la presenza di eventuali perdite e tagliare eventuali rami laterali. Posizionare una pinza per tubi sulla cannula arteriosa e cavale.

5. Perfusione meccanica normotermica

  1. Perfusato
    1. Durante la preparazione del back-table, aggiungere al circuito i globuli rossi lavati e prodotti dal cell saver per ottenere l'ematocrito desiderato del 30%. Avviare la pompa per miscelare i globuli rossi con l'espansore plasmatico. Avviare l'analizzatore di gas continuo.
      NOTA: La formula per il volume dei globuli rossi per ottenere l'ematocrito desiderato: (peso del fegato + volume di adescamento) x ematocrito/ematocrito desiderato dopo il lavaggio. L'analizzatore di gas continuo fornisce anche un feedback sulla temperatura di perfusione, che normalmente corrisponde all'impostazione del riscaldatore a 38 °C.
    2. Aggiungere al perfusato 10 ml di gluconato di calcio al 10%, 2 ml di eparina (10.000 UI) e 750 mg di cefuroxima in 10 ml di NaCl allo 0,9%. Impostare il miscelatore di gas manuale su 0,5 L/min FiO2 del 21%.
  2. Inizio della perfusione
    1. Accendere i sensori di pressione, i sensori di flusso e la pompa a rulli per il ricircolo delle perdite.
    2. Metti il fegato nel ricettacolo. Posizionare il tubo clamps sul portale e sul tubo di afflusso arterioso e sul tubo di deflusso cavale del circuito e ritagliare il connettore a Y.
    3. Collegare le cannule ai rispettivi tubi di ingresso e di uscita con un raccordo a T in mezzo. Impedire l'ingresso di aria nel circuito.
    4. Installare rubinetti a tre vie sui raccordi a T e collegare ad essi le linee di pressione. Azzerare la pressione sulle linee e avviare il monitoraggio continuo della pressione.
    5. Impostare le valvole a manicotto, chiudendole quasi completamente, per evitare flussi sovrafisiologici e stress endoteliali.
    6. Avviare la perfusione rimuovendo le fascette dei tubi dall'afflusso del portale. Immediatamente dopo l'avvio dell'afflusso del portale, rimuovere le fascette dal deflusso cavale e avviare la pompa. La velocità della pompa è controllata dalla pressione, quindi puntare a una pressione nel deflusso cavale compresa tra -5 mmHg e -2 mmHg. Puntare a un flusso portale di 0,75 ml/min/g di fegato.
    7. Quando la perfusione portale è stabile e le pressioni cavali sono adeguate, rimuovere le pinze dal tubo arterioso. Puntare a pressioni intorno a 55-60 mmHg e flussi intorno a 0,25 mL/min/g fegato.
  3. Mantenimento stabile dell'emodinamica di perfusione
    1. Copri il fegato con una cupola di vetro o un involucro di plastica per evitare la perdita di calore dalla superficie.
    2. Se il flusso del portale è troppo elevato, chiudere la valvola a manicotto sul tubo di afflusso del portale.
    3. Se la pressione cavale diventa troppo negativa, aumenta il rischio di creare un vuoto all'interno della vena cava. Pressioni negative eccessive possono essere contrastate rallentando la velocità della pompa. In alternativa, l'aumento dell'afflusso attraverso la vena porta riduce la pressione di deflusso negativa fornendo più volume alla vena cava.
    4. Se la pressione arteriosa è troppo bassa, può essere aumentata aumentando la velocità della pompa o chiudendo la valvola a manicotto verso il serbatoio del portale per spingere più flusso attraverso il tubo di afflusso arterioso.
  4. Campionamento
    1. Ottenere i campioni di perfusato dalla valvola a tre vie di deflusso cavale o da una linea di campionamento designata tra l'ossigenatore e il serbatoio del portale.
    2. Ottenere agobiopsie durante la perfusione. I fori dell'ago devono essere suturati in quanto non vi è coagulazione dovuta all'eparinizzazione del circuito.
    3. Raccogliere la bile fissando una cannula francese 8 nel dotto biliare. Assicurati di legare il dotto cistico.

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Risultati

Il protocollo di perfusione presentato utilizza l'autoregolazione del flusso sanguigno del fegato per ottenere condizioni emodinamiche stabili fino a 24 ore e simulare la distribuzione fisiologica del flusso sanguigno nella vena porta e nell'arteria epatica. La Figura 1 rappresenta una panoramica schematica del circuito di perfusione. La Figura 2A mostra una distribuzione coerente del flusso sanguigno, con la vena porta e l'arteria epatica che contribuiscono ris...

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Discussione

Qui, abbiamo dettagliato la nostra esperienza con l'NMP del fegato suino. I vantaggi di questa tecnica includono un alto valore traslazionale e versatilità. L'NMP del fegato suino può essere applicato sia per studiare e aumentare la comprensione di questa tecnica di conservazione avanzata o, in alternativa, per imitare il trapianto. Questa configurazione consente il controllo manuale di ogni aspetto della perfusione, consentendo di regolare la pressione e il flusso portale e arterioso in...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare tutti gli studenti ricercatori della facoltà di medicina della KU Leuven coinvolti in questi esperimenti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pompa a siringa Alaris GH PlusBD Care Fusion80023 UN 01-G
Dispositivo per anestesiaDott. GerTito
catetere arterioso Cavafix CertoBraun, Melsungen, GermaniaBRAU4152557
Analizzatore di gas ematiciRadiometroABL815
Gluconato di calcio 10%Braun, Melsungen, Germania570/13596667/1214
CapnografoDott. GerScio
SalvacellulareMedtronicAutoLog
Pompa centrifuga BiomedicusMedtronic85315 VERSIONE 3.0
Centrifuga Rotina 420R HettichVWR521-1156
Circuito di perfusione su misuraMedtronicM323901C
Set usa e getta salva celleMedtronicATLS24
DLP Cannula venosa monostadio, diritta 20FMedtronic66120
EpoprostenoloGlaxoSmithKline Belgio, Wavre, BelgioFlolan
Fentanyl-Janssen 0,05 mg/mLJanssenHK-08700
Sensore di flusso BioPro TTEM-TEC12271
Formaldeide 4%VWRVWRK4078.9005
Congelatore -80 ° CNuovo Brunswick ScientificoU570-86
FrigoriferoLiebherrTAZZA 3513
GeloplasmaFresenius-Kabi, Bad Homburg, GermaniaFREEFLEX
Radiatore del riscaldatoreStö ckert-Shiley, gruppo Sorin16-02-1950
Eparina 5000 IE/mLLeo Pharma, Ballerup, DanimarcaEparinaLeone
Cannula dell'arteria epaticaMedtronicBIO-MEDICUS 12F
Soluzione per la conservazione degli organi IGL-1Institut Georges LopezIGL-1/1000/D
Analizzatore di gas ematici in lineaTERUMOCalibratore 3MCDI 540/CDI 500
Insulina 200 UI ActrapidNovo Nordisk, Dagsvaerd, DanimarcaMEDI-00018
Isoflurano 1000 mg/g Vapore per inalazioneChanelle PharmaIso-Vet
catetere intravenoso BD Insyte-W 20 GBD381334
Serbatoio di azoto liquidoKGW IsothermEpisodio 22
Mersilene 250CM M3 USP2/0 non agugliato ligapakJNJ medicoF4503
Mersilene 250CM M3.5 USP0 non agugliato ligapakJNJ medicoF4504
Mersilene 5X70CM M3.5 USP0 non agugliatoJNJ medicoEH6935H
Mersilene 6X45CM M3 USP2/0 non agugliatoJNJ medicoEH6734H
Micro pipette 1000 & micro; LSocorex82,51,000
MonitoraggioSiemensSC 8000
Plasmalyte ViafloBaxterPlasmalyte Viaflo
Canula della vena portaLABORATORI CALMATI18F RV-40018
Sensore di pressioneStö ckert-Shiley, gruppo Sorin22-06-2000
Servoregolatore di pressioneMedtronicBM 9505-2
Prolene 4-0JNJ medicoEH7151H
Pompa a rulliCobe Century Stati Uniti d'America468048-000 REV C
Bicarbonato di sodio 8,4%Braun, Melsungen, Germania362 2339
Taurocolato di sodioSigma Aldrich, Burlington, Stati Uniti86339
Bisturi chirurgico nr 24Swann Morton0211
Catetere venoso, 3 lumen; 12FRFRECCIAAK-12123-F
Vicryl Vio 250CM M2 USP3/0 gigapak non agugliatoJNJ medicoV1205G
Xilazina 2%VMD Bestiame farmaceuticoXYL-M 2%
Zinacef Cefuroxima 750 mg compresse rivestite con filmGlaxoSmithKline Belgio, Wavre, BelgioNDC 0173-0353-32
Zoletil 100VirbacZoletil 100

Riferimenti

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