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Articolo metodologico

Arricchimento di mRNA e preparazione della libreria bisolfito-mRNA per il sequenziamento di nuova generazione

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⸱

DOI:

10.3791/65352

⸱

7 luglio 2023

 , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro facile da seguire per condurre la purificazione dell'RNA poli(A), la conversione del bisolfito e la preparazione della libreria utilizzando apparecchiature standardizzate per un campione biologico di interesse.

Abstract

Le modificazioni post-trascrizionali dell'RNA in vari tipi di trascritti di RNA sono associate a diverse regolazioni dell'RNA nelle cellule eucariotiche. È stato dimostrato che le modificazioni aberranti dell'RNA 5-metilcitosina e l'espressione disregolata delle metiltransferasi dell'RNA sono associate a varie malattie, compresi i tumori. Il sequenziamento del bisolfito a livello di trascrittoma è stato sviluppato per caratterizzare le posizioni e i livelli quantitativi di metilazione della citosina nell'RNA convertito in bisolfito alla risoluzione della coppia di basi. In questo documento, questo protocollo presenta in dettaglio le procedure di due cicli di purificazione del poli(A) RNA, tre cicli di reazione del bisolfito e la preparazione della libreria per consentire la mappatura a livello di trascrittoma dei siti di modificazione dell'mRNA 5-metilcitosina. La valutazione della quantità e della qualità dell'RNA dopo la reazione principale è essenziale per monitorare l'integrità dell'RNA ed è un passaggio fondamentale per garantire librerie di sequenziamento di alta qualità. Idealmente, le procedure possono essere completate entro tre giorni. Con questo protocollo, l'utilizzo di RNA totale di alta qualità come input può praticamente costruire robuste librerie di bisolfito-mRNA per il sequenziamento di nuova generazione dal campione di interesse.

Introduzione

Tra oltre 150 tipi di modificazioni post-trascrizionali1, la modificazione della 5-metilcitosina (m5C) è stata identificata in vari tipi di RNA, tra cui l'RNA ribosomiale, l'RNA di trasferimento, l'RNA messaggero, il micro RNA, l'RNA lungo non codificante, l'RNA del vault, l'RNA enhancer e i piccoli RNA specifici del corpo cajal2. L'RNA m 5 C è associato a diversi meccanismi biologici e patologici come la regolazione dello sviluppo delle radici delle piante3, l'espressione genica virale4 e la progressione del cancro5. Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire pipeline semplificate per caratterizzare il profilo di modificazione dell'mRNA m5C a livello di trascrittoma di campioni biologici in diversi stadi di sviluppo o nel contesto della malattia. Il sequenziamento del bisolfito a livello di trascrittoma è stato sviluppato per caratterizzare le posizioni e i livelli quantitativi di metilazione della citosina nell'RNA convertito in bisolfito alla risoluzionedella coppia di basi 6,7,8,9. Ciò è particolarmente utile quando si studia l'associazione dim5C con l'espressione genica e il destino dell'RNA che è coinvolto nei meccanismi di regolazione biologica nelle cellule. Nella cellula di mammifero, ci sono due lettori noti di m 5 C: ALYREF può riconoscere m 5 C nel nucleo e funge da trasportatore da nucleo mRNA a citosol10, mentre YBX1 può riconoscere m5C nel citoplasma e aumentare la stabilizzazione dell'mRNA11. Nelle cellule T CD4+ CD4+ del lupus eritematososistemico sono stati riportati mRNA m5C aberranti correlati alle vie immunitarie 12. Gli studi hanno rivelato un'associazione tra la modificazione dell'mRNA m5C e la modulazione dell'immunità del cancro e la progressione del cancro13,14. Pertanto, la mappatura del profilo di modificazione di m5C sull'mRNA può fornire informazioni cruciali per chiarire il potenziale meccanismo regolatorio.

Per studiare i ruoli funzionali della modificazione dell'RNA m 5 C in determinate condizioni biologiche, gli approcci basati sulla conversione del bisolfito (bsRNA-seq) e sull'arricchimento dell'affinità anticorpale come m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq e 5-Aza-seq possono essere combinati con la piattaforma di sequenziamento ad alto rendimento per fornire un rilevamento efficiente di regioni e sequenze mirate con le modifiche m5C su una scala a livello di trascrittoma15, Ore 16. Il vantaggio di questo protocollo fornisce il panorama completo dell'RNA m 5 C con una risoluzione a base singola, poiché l'approccio basato sull'arricchimento dell'affinità anticorpale si basa sulla disponibilità di anticorpi di alta qualità e potrebbe raggiungere la risoluzionea singolo frammento del paesaggio di metilazione m5C17.

Tutti i campioni di RNA saranno processati con due cicli di arricchimento di mRNA utilizzando perle oligo(dT), tre cicli di reazione con bisolfito e la preparazione della libreria di sequenziamento. Per monitorare la qualità dell'RNA, ogni campione di RNA sarà esaminato mediante elettroforesi su gel capillare prima e dopo le procedure di purificazione dell'mRNA e reazione del bisolfito per valutare la distribuzione dei frammenti. Le librerie purificate saranno esaminate in base alle loro qualità di ampliconi PCR, ai frammenti di distribuzione dimensionale del DNA mediante elettroforesi su gel capillare e alle loro quantità complessive esaminate mediante saggi quantitativi basati su coloranti a fluorescenza prima del sequenziamento. Il sistema può anche essere utilizzato per analizzare un ampio spettro di campioni biologici come prodotti agricoli, virioni isolati, linee cellulari, organismi modello e campioni patologici.

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Protocollo

1. Purificazione dell'RNA di poli(A)

NOTA: Utilizzare l'RNA totale trattato con DNasi I ed esaminare la qualità e l'integrità dell'RNA totale mediante valutazione dell'elettroforesi capillare o su gel convenzionale prima di procedere alla purificazione dell'RNA poli(A). I ricercatori dovrebbero essere in grado di identificare le bande ribosomiali dell'rRNA 28S e 18S nel campo ad alto peso molecolare e la banda dell'rRNA 5,8S nel campo a basso peso molecolare senza bande di striscio significative nell'elettroferogramma. Le fasi di purificazione seguono essenzialmente le istruzioni del produttore con piccole modifiche indicate nelle fasi specifiche. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.

  1. Preparazione
    1. Riscaldare il reagente, il tampone di lavaggio, le perle di oligo(dT) e il tampone di lisi a temperatura ambiente per 30 minuti prima di eseguire le seguenti procedure.
    2. Per l'isolamento di RNA arricchito di poli(A), preparare 10-20 μg di un'aliquota di RNA totale di alta qualità come materiale di partenza trasferendo una quantità adeguata di RNA in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL priva di nucleasi. Incubare nel blocco termico a 70 °C per 5 min, quindi tenere in ghiaccio per 2 min.
      NOTA: Le quantità di RNA totale come materiale di partenza devono essere opportunamente regolate in base alla quantità desiderata di mRNA e alla natura delle cellule utilizzate. Empiricamente, l'RNA arricchito di poli(A) può rappresentare l'1-5% di abbondanza nell'RNA totale. Un'aliquota di 10 μg di RNA totale di alta qualità dovrebbe fornire RNA arricchito di poli(A) di alta qualità nell'intervallo 100-500 ng per la conversione del bisolfito a valle.
    3. Nel frattempo, risospendere completamente le perle di oligo(dT). Trasferire le quantità necessarie di sospensione di microsfere in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL, quindi posizionare sul magnete per 3 minuti fino a quando le perle magnetiche formano una pallina.
      NOTA: Utilizzare 50 μL di microsfere di oligo(dT) per 10 μg di RNA totale in ingresso. Il volume delle perline in questa fase potrebbe essere ulteriormente ottimizzato a seconda delle celle utilizzate.
    4. Rimuovere il surnatante e risospendere le perle di oligo(dT) con quantità uguali (il volume della sospensione di microsfere utilizzate al punto 1.1.3.) di tampone di lisi e posizionarle sul magnete per 3 minuti prima di rimuovere il surnatante.
      NOTA: Non asciugare eccessivamente le perline; L'utente deve procedere rapidamente al passaggio 1.2.1.
  2. Il primo ciclo di purificazione
    1. Aggiungere il tampone di lisi alla provetta del campione di RNA (rapporto di volume 4:1) e mescolare accuratamente prima di trasferire alle perle di oligo (dT).
      NOTA: Se il volume del campione di RNA è di 20 μL, aggiungere 80 μL di tampone di lisi.
    2. Risospendere completamente l'RNA: la miscela tampone di lisi e le microsfere di oligo(dT) pipettano almeno 10 volte.
    3. Lasciare incubare i campioni con rotazione continua per 15 minuti a temperatura ambiente.
    4. Posizionare il campione sul magnete per 5 minuti o fino a quando il surnatante non è limpido; Scartare il surnatante.
    5. Aggiungere 600 μL di tampone di lavaggio 1 alle perle e mescolare con cura per risospendere le perle.
    6. Posizionare il tubo sul magnete per 5 minuti o fino a quando il surnatante non è chiaro, gettare il surnatante e ripetere una volta il passaggio di lavaggio 1.2.5.
    7. Lavare le perline aggiungendo 300 μL di Wash Buffer 2 e risospendere delicatamente le perline.
    8. Posizionare il tubo sul magnete per 5 minuti o fino a quando il surnatante non è limpido, gettare il surnatante e ripetere una volta il passaggio di lavaggio 1.2.7.
    9. Aggiungere 30 μL di Tris-HCl (tampone di eluizione) freddo da 10 mM alla provetta del campione e incubare a 70 °C per 5 min.
    10. Trasferire rapidamente la provetta sul magnete e, quando la sospensione è limpida dopo 20 secondi o più, trasferire il surnatante contenente RNA arricchito di poli(A) eluito nella nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
  3. Il secondo ciclo di purificazione
    1. Aggiungere 120 μL (4 volte il volume del campione eluito) tampone di lisi al campione di RNA eluito e mescolare accuratamente.
    2. Lavare le perle utilizzate nel primo ciclo di purificazione con una quantità uguale di tampone di lisi come al punto 1.1.4, pipettare 10 volte per risospendere le perle, quindi posizionarle sul magnete per 5 minuti prima di scartare il surnatante.
    3. Trasferire la miscela di RNA: tampone di lisi sulle microsfere lavate e miscelare accuratamente pipettando almeno 10 volte.
    4. Incubare il campione con rotazione continua per 15 minuti a temperatura ambiente.
    5. Ripetere i passaggi da 1.2.4 a 1.2.8 per rimuovere il sale e altri sottotipi di RNA.
      NOTA: Il volume del tampone di lavaggio può essere ridotto a 300 μL di tampone di lavaggio 1 e 150 μL di tampone di lavaggio 2.
    6. Aggiungere 25 μL (volume desiderato) di Tris-HCl (tampone di eluizione) freddo da 10 mM alla provetta del campione e incubare a 70 °C per 5 minuti.
    7. Trasferire rapidamente la provetta sul magnete e, quando la sospensione è limpida dopo 20 secondi o più, trasferire il surnatante contenente RNA arricchito di poli(A) eluito in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
    8. Trasferimento di 2,2 μL in provette a 8 strisce per la valutazione della qualità della quantità e della qualità dell'RNA utilizzando saggi ad alta sensibilità dell'RNA.
    9. Conservare il campione a -20 °C per brevi periodi e a -70 °C per un periodo più lungo.
      NOTA: questo può essere un punto di pausa nel protocollo.

2. Conversione del bisolfito

NOTA: Le fasi di centrifugazione sono state tutte eseguite a temperatura ambiente. Le procedure sono essenzialmente eseguite secondo le istruzioni del produttore, ma con un ulteriore passaggio 2.2 per aggiungere la sequenza o le sequenze di mRNA di controllo spike-in prima del passaggio 2.3 della reazione al bisolfito.

  1. Trasferire 19 μL di campione di RNA arricchito di poli(A) purificato in una provetta da 0,2 mL a 8 strisce.
  2. Aggiungere 1,0 μL di controllo spike-in, che è esente da qualsiasi modifica al rapporto di quantità 1:10.000 predeterminato (cioè 0,1 ng di mRNA luciferasi: 1 μg di RNA arricchito di poli(A) purificato) nel campione di RNA del passaggio 2.1.
    NOTA: La sequenza di controllo spike-in può essere l'RNA luciferasi Firefly, la Renilla luciferasi o la sequenza di RNA trascritta in vitro senza citosine metilate.
  3. Aggiungere 130 μL di reggente di conversione alla provetta e capovolgere delicatamente più volte per una miscelazione accurata.
  4. Posizionare la provetta nella macchina PCR ed eseguire tre cicli di riscaldamento a 70 °C per 10 minuti, seguiti da un'incubazione a 64 °C per 45 minuti ciascuno e quindi da un ultimo passaggio per raffreddare a 4 °C.
  5. Posizionare la colonna sulla provetta di raccolta e trasferire 250 μL di tampone legante l'RNA alla colonna.
  6. Trasferire il campione dal passaggio 2.4 alla colonna dal passaggio 2.5 e pipettare accuratamente.
  7. Aggiungere 400 μL di etanolo al 95-100% nella colonna, chiudere rapidamente il tappo e capovolgere più volte.
  8. Centrifugare a 10.000 × g per 30 s a 25 °C ed eliminare il flusso.
  9. Aggiungere 200 μL di tampone di lavaggio dell'RNA alla colonna.
  10. Centrifugare a 10.000 × g per 30 s a 25 °C ed eliminare il flusso.
  11. Aggiungere 200 μL di tampone desolfonazione e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
  12. Centrifugare a 10.000 × g per 30 s a 25 °C ed eliminare il flusso.
  13. Aggiungere 400 μL di tampone di lavaggio dell'RNA e centrifugare a 10.000 × g per 30 s a 25 °C ed eliminare il flusso. Ripeti questo passaggio una volta.
  14. Centrifugare nuovamente a 10.000 × g per 2 minuti a 25 °C per rimuovere completamente il tampone di lavaggio residuo.
    NOTA: L'altra fase di centrifugazione 2.14 per 2 minuti prima dell'eluizione consiste nel rimuovere completamente il tampone di lavaggio. La fase di lavaggio viene eseguita due volte per eliminare il componente ad alto contenuto di sale dal reagente bisolfito e dal tampone di desolfonazione sulla colonna.
  15. Trasferire la colonna in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
  16. Aggiungere 20-30 μL di H2O senza nucleasi alla colonna e lasciare riposare a temperatura ambiente per 1 minuto.
  17. Centrifugare a 10.000 × g per 30 s a 25 °C.
  18. Trasferimento di 2,2 μL in provette a 8 strisce per la valutazione della quantità e della qualità dell'RNA.
  19. Conservare il campione di RNA trattato con bisolfito a -20 °C per brevi periodi e a -70 °C per un periodo più lungo.
    NOTA: questo può essere un punto di pausa nel protocollo.

3. Preparazione della libreria di mRNA trattata con bisolfito

NOTA: Seguire la sezione 4 del protocollo di istruzioni per la preparazione della libreria per l'uso con mRNA purificato o RNA impoverito di rRNA. La prima fase di priming dovrebbe seguire il protocollo FFPE RNA poiché il trattamento con bisolfito frammenta l'RNA. Eseguire ogni passaggio nella cappa a flusso laminare e aggiungere la miscela di reazione su una griglia di raffreddamento ghiacciata.

  1. Adescamento dell'RNA in ingresso
    1. Trasferire la quantità desiderata di campione di mRNA trattato con bisolfito in un massimo totale di 5 μL o aggiungere H2O senza nucleasi per un totale di 5 μL.
      NOTA: Si raccomanda un minimo di 10 ng di mRNA trattato con bisolfito come input per questo tipo di preparazione della libreria di RNA e per generare la molarità finale del prodotto della libreria 4nM.
    2. Aggiungere 1 μL di primer casuale (lilla) al campione e miscelare mediante pipettaggio.
    3. Posizionare la provetta del campione nella macchina PCR preimpostata a 65 °C e il coperchio a 105 °C per 5 minuti e tenere a 4 °C.
  2. Sintesi di cDNA a primo filamento
    1. Aggiungere 4 μL di tampone per la reazione di sintesi (lillà), 8 μL di reagente per la specificità del filamento (marrone) e 2 μL di miscela di enzimi di sintesi (marrone) al campione, per un volume totale di 20 μL. Miscelare accuratamente pipettando almeno 10 volte e centrifugare rapidamente.
    2. Posizionare la provetta nella macchina PCR preimpostata a 25 °C per 10 min, 42 °C per 50 min, 70 °C per 15 min e tenere a 4 °C.
      NOTA: Per inserti superiori a 200 basi, si consiglia un periodo di incubazione di 42 °C di 50 min; per inserti di dimensioni inferiori a 200 basi, si consiglia un periodo di incubazione di 15 minuti a 42 °C.
  3. Sintesi di cDNA a secondo filamento
    1. Aggiungere 8 μL di tampone di reazione di sintesi con miscela dUTP (arancione), 4 μL di miscela di enzimi di sintesi (arancione) e 48 μL di H2O senza nucleasi. Miscelare accuratamente pipettando almeno 10 volte e centrifugare rapidamente.
    2. Posizionare la provetta nella macchina PCR preimpostata a 16 °C per 1 ora con il coperchio spento o ≤40 °C.
  4. Purificazione di cDNA a doppio filamento con microsfere di purificazione del DNA
    1. Preriscaldare le perle di purificazione del DNA 30 minuti prima di eseguire la purificazione e il vortice per risospendere le perle.
    2. Aggiungere 144 μL di microsfere di purificazione del DNA in sospensione al campione di cDNA del passaggio 3.3.2 e mescolare accuratamente pipettando almeno 10 volte.
    3. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    4. Posizionare la provetta su una griglia magnetica per 5 minuti fino a quando la soluzione non è limpida, quindi rimuovere il surnatante e conservare le perle che contengono DNA.
    5. Aggiungere 200 μL di etanolo all'80% appena prodotto nella provetta con le perle mantenendo il campione sul rack magnetico e incubare a temperatura ambiente per 30 secondi.
    6. Rimuovere il surnatante e ripetere il passaggio 3.4.5 una volta, ma questa volta rimuovere con cautela tutto il surnatante residuo.
    7. Asciugare all'aria le perline per 1-5 minuti mantenendo il campione sul magnete.
      NOTA: Non asciugare eccessivamente le perline; Il colore dovrebbe essere marrone scuro.
    8. Rimuovere il campione dal rack magnetico ed eluire il DNA aggiungendo 53 μL di tampone 0,1x TE (10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA, pH 8,0) alle microsfere. Mescolare accuratamente pipettando almeno 10 volte e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti.
    9. Posizionare la provetta sulla griglia magnetica per 5 minuti o fino a quando la soluzione non è limpida.
    10. Trasferire 50 μL di surnatante contenente cDNA a doppio filamento in una nuova provetta a 8 strisce.
      NOTA: A questo punto il protocollo può essere interrotto e il campione può essere conservato a -30 °C.
  5. Preparazione finale della libreria di cDNA
    1. Aggiungere 7 μL di tampone di reazione di lucidatura (verde) e 3 μL di miscela enzimatica di lucidatura (verde) al campione di cDNA a doppio filamento eluito.
    2. Miscelare la miscela pipettando 10 volte con un volume di 50 μL senza creare bolle, quindi centrifugare rapidamente il campione.
    3. Mettere il campione in una macchina PCR e incubare a 20 °C per 30 minuti, 65 °C per 30 minuti e conservare a 4 °C.
  6. Legatura dell'adattatore
    1. Diluire l'adattatore (rosso) secondo le istruzioni del produttore.
    2. Aggiungere al campione 2,5 μL dell'adattatore diluito, 1 μL di potenziatore di legatura (rosso) e 30 μL di Ligation Master Mix (rosso).
    3. Miscelare la miscela pipettando 10 volte con un'impostazione del volume di 80 μL senza creare bolle, quindi centrifugare rapidamente il campione.
    4. Porre il campione in una macchina PCR e incubare a 20 °C per 15 minuti.
    5. Aggiungere 3 μL della miscela di uracile DNA glicosilasi e DNA glicosilasi-liasi endonucleasi VIII (blu) al campione e pipettare accuratamente.
    6. Rimettere il campione nella macchina PCR e incubare a 37 °C per 15 minuti con il coperchio impostato a 75 °C.
  7. Purificazione dei cDNA trattati con reazione di legatura
    NOTA: A questo scopo è possibile utilizzare la selezione delle dimensioni con le perline SPRIselect o, opzionalmente, con le perline AMpure XP18.
    1. Preriscaldare le perle 30 minuti prima di eseguire la purificazione e il vortice per risospenderle.
    2. Trasferire 25 μL di microsfere risospese sul campione di cDNA della fase 3.6.6 e miscelare accuratamente pipettando almeno 10 volte.
    3. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    4. Posizionare la provetta su una griglia magnetica per 5 minuti fino a quando la soluzione non è limpida, quindi trasferire il surnatante in una nuova provetta da 8 strisce e scartare le perline.
    5. Aggiungere 10 μL di microsfere risospese al surnatante e miscelare accuratamente pipettando almeno 10 volte.
    6. Posizionare la provetta su una griglia magnetica per 5 minuti fino a quando la soluzione non è limpida, quindi scartare il surnatante e non disturbare le perle.
    7. Aggiungere 200 μL di etanolo all'80% appena prodotto nella provetta con le perle mantenendo il campione sul rack magnetico e incubare a temperatura ambiente per 30 secondi.
    8. Rimuovere il surnatante e ripetere il passaggio 3.7.7 una volta, ma questa volta rimuovere con cautela tutto il surnatante residuo.
    9. Asciugare le perline all'aria per 1-5 minuti mantenendo il campione sul magnete.
      NOTA: Non asciugare eccessivamente le perline; Il colore dovrebbe essere marrone scuro.
    10. Rimuovere il campione dal rack magnetico ed eluire il DNA aggiungendo 17 μL di tampone TE 0,1x alle microsfere. Mescolare accuratamente pipettando almeno 10 volte e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti.
    11. Posizionare la provetta sulla griglia magnetica per 5 minuti fino a quando la soluzione non è limpida.
    12. Trasferire 15 μL di surnatante, che contiene il dsDNA preparato all'estremità del bersaglio, in una nuova provetta a 8 strisce.
  8. Arricchimento PCR del DNA legato all'adattatore
    1. Aggiungere 25 μL di master mix (blu), 5 μL di primer adattatore 5' e 5 μL di primer adattatore 3' al campione di DNA legato all'adattatore. Mescolare accuratamente pipettando almeno 10 volte.
    2. Posizionare il campione nella macchina PCR ed eseguire l'amplificazione PCR utilizzando i seguenti passaggi: (1) 98 °C per 30 s, (2) 98 °C per 10 s, (3) 65 °C per 75 s, (4) 65 °C per 5 min e (5) mantenere a 4 °C; in cui i passaggi (2) e (3) devono essere ripetuti per un numero di ciclo N+2 in cui N è uguale alla quantità di RNA in ingresso nel manuale di istruzioni. Ciò significa che sono necessari 2 cicli aggiuntivi a causa della selezione delle dimensioni su entrambi i lati dei campioni eseguita nel passaggio 3.7.
      NOTA: Ad esempio, 8 ng dell'ingresso di mRNA purificato sarebbero raccomandati con 9-10 cicli di PCR; ma con il cDNA a doppia faccia, selezionato per dimensione e legato nella fase 3.7, il ciclo PCR raccomandato sarebbe di 11-12 cicli.
  9. Purificazione di librerie amplificate con PCR
    1. Preriscaldare le perle di purificazione del DNA per 30 minuti prima di eseguire la purificazione e il vortice per risospendere le perle.
    2. Trasferire 45 μL (0,9x) di microsfere risospese al prodotto PCR della fase 3.8.2 e miscelare accuratamente pipettando almeno 10x.
    3. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    4. Posizionare la provetta su una griglia magnetica per 5 minuti fino a quando la soluzione non è limpida, quindi rimuovere il surnatante e conservare le perle che contengono DNA.
    5. Aggiungere 200 μL di etanolo all'80% appena prodotto nella provetta con le perline, lasciare il campione sul rack magnetico e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 30 secondi.
    6. Rimuovere il surnatante e ripetere il passaggio 3.9.5 una volta, ma questa volta rimuovere con cautela tutto il surnatante residuo.
    7. Asciugare le perline all'aria per 1-5 minuti mantenendo il campione sul magnete.
      NOTA: Non asciugare eccessivamente le perline; Il colore dovrebbe essere marrone scuro.
    8. Prelevare il campione dal rack magnetico e aggiungere 22 μL di tampone TE 0,1x alle perle per eluire il DNA. Mescolare accuratamente pipettando almeno 10 volte e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti.
    9. Posizionare la provetta sulla griglia magnetica e lasciarla riposare per 5 minuti o fino a quando la soluzione non è limpida a temperatura ambiente.
    10. Trasferire 20 μL di surnatante in una nuova provetta a 8 strisce.
    11. Trasferimento di provette da 2,2 μL a 8 strisce per la valutazione della qualità della quantità e della qualità della libreria.
      NOTA: La quantità della libreria può essere rilevata anche mediante qPCR (vedere l'Indice dei materiali).
    12. Conservare il campione della libreria bsRNA-seq a -20 °C.

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Risultati

Una serie di librerie bsRNA-seq da linee cellulari19 sono state generate seguendo le procedure descritte in questo rapporto (Figura 1). Dopo la purificazione totale dell'RNA accompagnata dal trattamento DNase eseguito su campioni di linee cellulari e la qualità controllata mediante elettroforesi su gel e spettrofotometria UV-Vis (A260/A280), il campione di RNA può procedere all'arricchimento di poli(A) RNA. Per determinare se la doppia purificazione p...

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Discussione

In questo protocollo, è stata ottenuta una pipeline dettagliata di arricchimento di poli(A), conversione di bisolfito e preparazione della libreria utilizzando componenti standardizzati. Ulteriori analisi di sequenziamento hanno fornito l'identificazione dell'mRNA 5-metilcitosina nei campioni di interesse.

Il passaggio critico è la qualità del materiale di partenza, l'RNA totale, poiché la degradazione dell'RNA avrebbe un impatto sul tasso di recupero della purificazione dell'RNA poli(A). Il c...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio Nazionale per la Scienza e la Tecnologia di Taiwan. [NSTC 111-2314-B-006-003]

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Agilent 2100 Sistema di bioanalizzatore per elettroforesiAgilent, Santa Clara, CARilevamento della qualità dell'RNA
Perline AMpure XPBeckman CoulterA63881purificare il DNA
Bioanalizzatore Kit DNA ad alta sensibilitàAgilent, Santa Clara, CA5067-4626Rilevamento della qualità del DNA
Bioanalizzatore RNA 6000 KitPico Agilent, Santa Clara, CA5067-1513RNA rilevamento della qualità
DiaMag02 - rack magneticoDiagenode, Denville, NJB04000001assistere la preparazione della libreria
DiaMag1.5 - rack magneticoDiagenode, Denville, NJB04000003 assistere lapurificazione dell'RNA poly(A)
Kit di purificazione DIRETTA dell'mRNA DynabeadsThermo Fisher Scientific, Waltham, MA61011purificazione dell'RNA poli(A); Tampone di lavaggio 1 e tampone di lavaggio 2
EtanoloJ.T.Baker64-17-5
Kit di metilazione dell'RNA EZZymo, Irvine, CAR5002trattamento con bisolfito
Firefly luciferasi mRNAPromega, Madison, WI, USAPicco L4561nella seqeunce di controllo 
Kit di quantificazione della libreria KAPARoche, SvizzeraQuantificazione della libreriaKK4824
Spettrofotometro a nanogocceThermo Fisher Scientific, Waltham, MA Rilevamentodella quantità di RNA totale
NEBNext multiplex Oligos per illumina (index Primer set1)New England Biolabs, Ipswich, MAPreparazione
della libreria E7335SNEBNext Ultra figure-materials-1 Kit di preparazione della libreria di RNA direzionale per IlluminaNew England Biolabs, Ipswich, MAPreparazione della libreria E7760S
Acqua senza nucleasiThermo Fisher ScientificAM9932
P2 pipetmanThermo Fisher Scientific, Waltham, MA4641010
Qubit 2.0 fluorimetro Thermo Fisher Scientific, Waltham, MARilevamento della quantità di RNA
Kit di analisi Qubit dsDNA HSThermo Fisher Scientific, Waltham, MAQ32854Rilevamento della quantità di DNA
Kit di analisi Qubit RNA HSThermo Fisher Scientific, Waltham, MAQ32852Rilevamento della quantità di RNA

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