Method Article

Istituzione e conferma di un modello murino postnatale di sovraccarico del volume ventricolare destro

DOI:

10.3791/65372

⸱

June 9th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Intensive Care Unit, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Shanghai Children’s Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 3Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 4Department of Radiology, Huangpu Branch, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 5Institute of Pediatric Translational Medicine, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 6Shanghai Institute for Pediatric Congenital Heart Disease, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo presenta la creazione e la conferma di un modello postnatale di sovraccarico del volume ventricolare destro (VO) in topi con fistola arterovenosa addominale (AVF), che può essere applicato per studiare come il VO contribuisce allo sviluppo cardiaco postnatale.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il sovraccarico di volume (VO) del ventricolo destro (RV) è comune nei bambini con cardiopatia congenita. In considerazione delle diverse fasi di sviluppo, il miocardio del ventricolo destro può rispondere in modo diverso al VO nei bambini rispetto agli adulti. Il presente studio mira a stabilire un modello postnatale di RV VO nei topi utilizzando una fistola arterovenosa addominale modificata. Per confermare la creazione del VO e le successive alterazioni morfologiche ed emodinamiche del ventricolo destro, sono stati eseguiti per 3 mesi l'ecografia addominale, l'ecocardiografia e la colorazione istochimica. Di conseguenza, la procedura nei topi postnatali ha mostrato un tasso di sopravvivenza e di successo della fistola accettabile. Nei topi VO, la cavità del ventricolo destro è stata ampliata con una parete libera ispessita e il volume sistolico è aumentato di circa il 30%-40% entro 2 mesi dall'intervento chirurgico. Successivamente, la pressione sistolica del ventricolo destro è aumentata, è stato osservato un corrispondente rigurgito della valvola polmonare ed è apparso un rimodellamento della piccola arteria polmonare. In conclusione, la chirurgia della fistola arterovenosa modificata (AVF) è fattibile per stabilire il modello RV VO nei topi postnatali. Considerando la probabilità di chiusura della fistola e l'elevata resistenza dell'arteria polmonare, è necessario eseguire un'ecografia addominale e un'ecocardiografia per confermare lo stato del modello prima dell'applicazione.

Introduction

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Il sovraccarico di volume (VO) del ventricolo destro (RV) è comune nei bambini con cardiopatia congenita (CHD), che porta a un rimodellamento miocardico patologico e a una prognosi sfavorevole a lungo termine 1,2,3. Una comprensione approfondita del rimodellamento del ventricolo destro e dei relativi interventi mirati precoci è essenziale per un buon risultato nei bambini con CHD. Ci sono diverse differenze nelle strutture molecolari, nelle funzioni fisiologiche e nelle risposte agli stimoli nel cuore di adulti e bambini 1,4,5,6. Ad esempio, sotto l'influenza del sovraccarico di pressione, la proliferazione dei cardiomiociti è la risposta principale nei cuori neonatali, mentre la fibrosi si verifica nei cuori adulti 5,6. Inoltre, molti farmaci efficaci nel trattamento dell'insufficienza cardiaca negli adulti non hanno alcun effetto terapeutico sull'insufficienza cardiaca nei bambini e possono persino causare ulteriori danni 7,8. Pertanto, le conclusioni tratte dagli animali adulti non possono essere applicate direttamente agli animali giovani.

Il modello di fistola arterovenosa (AVF) è stato utilizzato per decenni per indurre il VO cardiaco cronico e la corrispondente disfunzione cardiaca in animali adulti di diverse specie 9,10,11,12,13. Tuttavia, si sa poco del modello nei topi postnatali. Nei nostri studi precedenti, un modello murino postnatale VO è stato generato con successo dalla creazione di una FAV addominale. È stato dimostrato anche il cambiamento del percorso di sviluppo del ventricolo destro nel cuore postnatale14,15,16,17.

Per esplorare il processo chirurgico modificato sottostante e le caratteristiche del presente modello, viene presentato un protocollo dettagliato; Il modello viene valutato per 3 mesi in questo studio.

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Protocol

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Tutte le procedure qui presentate sono conformi ai principi delineati nella Dichiarazione di Helsinki e sono state approvate dal Comitato per il benessere degli animali e gli studi umani presso lo Shanghai Children's Medical Center (SCMC-LAWEC-2023-003). Per il presente studio sono stati utilizzati cuccioli di topo C57BL/6 (P7, maschi, 3-4 g). Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). I cuccioli di topo e le loro madri che allattano (cuccioli:madri = 6:1 in una singola gabbia) sono stati tenuti in condizioni di laboratorio prive di agenti patogeni specifici in un ciclo di luce e buio di 12 ore a 22 ± 2 °C con libero accesso all'acqua e una dieta nutrizionale. I cuccioli sono stati randomizzati in due gruppi: un gruppo VO e un gruppo operato fittiziamente.

1. Preparazione dell'attrezzatura e degli strumenti chirurgici

NOTA: I dettagli commerciali di tutti i materiali/attrezzature sono elencati nella Tabella dei materiali.

  1. Assicurarsi che i seguenti tipi di apparecchiature siano pronti e correttamente funzionanti: tavolo operatorio (pannello in plastica espansa), macchina per anestesia inalatoria, microscopio con illuminazione verticale e telecamera incorporata, dispositivo a ultrasuoni con trasduttore a 24 MHz e piattaforma di riscaldamento termostatico.
  2. Sterilizzare gli strumenti chirurgici (ad esempio, un porta-aghi, una pinza a punta fine e forbici a molla Vannas a manico rotondo).
  3. Assemblare i seguenti materiali di consumo: aghi da sutura chirurgici 11-0 e 9-0 (punta conica) con filo, strisce di nastro, aghi per siringa da 5 ml, seta 2-0 (fissaggio chirurgico), cotton fioc sterili e gel per ultrasuoni.
  4. Assicurarsi che siano presenti i seguenti reagenti: betadina, etanolo al 70%, soluzione salina sterile normale, isoflurano, paracetamolo, unguento oftalmico e crema depilatoria.

2. Procedura chirurgica

NOTA: La procedura chirurgica della fistola è stata modificata secondo il metodo11 precedentemente descritto. La Figura 1 mostra un diagramma schematico dell'operazione AVF nei topi postnatali.

  1. Anestesia e contenzione
    1. Mettere i cuccioli di topo in una scatola di induzione per anestesia alimentata con isoflurano/ossigeno al 2% per 2 minuti con il flusso impostato su 1 L/min. Somministrare paracetamolo (0,1 ml PO da 80 mg/2,5 ml) utilizzando una siringa per la tubercolosi.
    2. Posizionare i cuccioli in posizione supina sul tavolo operatorio con inalazione nasale di isoflurano all'1,5% con un flusso di 0,8 L/min per mantenere l'anestesia. Regola la posizione del cucciolo legando le zampe agli aghi fissi della siringa. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi dei cuccioli per prevenire l'essiccazione corneale.
    3. Pizzica la coda del cucciolo anestetizzato per verificarne la reattività al dolore; Nessun movimento evidente del corpo indica un'anestesia adeguata.
  2. Chirurgia della fistola
    1. Disinfettare la pelle con tre scrub alternati di betadine ed etanolo al 70%, quindi drappeggiare il sito chirurgico. Tagliare la parete addominale e il peritoneo dal basso addome al subxifoide per esporre completamente la cavità peritoneale, facendo attenzione a non ferire gli organi addominali. Gocciolare una normale soluzione fisiologica sterile per inumidire gli organi esternalizzati.
    2. Allontanare delicatamente il tratto gastrointestinale e la vescica dal sito chirurgico utilizzando tamponi di cotone per visualizzare l'aorta addominale verticale (AA) e la vena cava inferiore (IVC) sotto il retroperitoneo. Ruotare il tavolo operatorio di 90° in senso antiorario e regolare l'ingrandimento del microscopio per visualizzare chiaramente i due recipienti orizzontali.
    3. Perforare la fistola dall'AA all'IVC in direzione obliqua di 1 cm distale rispetto all'arteria renale con un ago di sutura 11-0 (diametro = 0,07 mm). Verificare la corretta creazione della fistola in base al gonfiore e alla miscelazione del sangue venoso e arterioso nell'IVC.
    4. Successivamente, comprimere rapidamente il punto di sanguinamento utilizzando una forza appropriata applicata con tamponi di cotone asciutti per 15 s. Sostituire lo stomaco, l'intestino e la vescica nella cavità addominale il prima possibile per favorire la compressione emostatica.
    5. Suturare la parete addominale e il peritoneo con un punto a cavallo utilizzando un filo di sutura 9-0. Interrompere l'anestesia e fornire ai cuccioli il 100% di ossigeno per 1 minuto.
  3. Rianimazione in anestesia
    1. Posizionare i cuccioli su una piattaforma riscaldante a 38 °C. Dopo un completo risveglio con vitalità, restituisci i cuccioli alla madre che allatta. L'intera procedura dura circa 15 minuti.
      NOTA: Nel presente studio, il gruppo fittizio viene sottoposto alla stessa procedura ad eccezione della fase di puntura.

3. Conferma ecografica della fistola

NOTA: Il funzionamento generale dell'ecografo era identico ai rapporti precedenti18,19.

  1. Conferma della fistola mediante ecografia addominale
    1. Dopo l'induzione dell'anestesia (passaggio 2.1.1), fissare i topi con strisce di nastro adesivo in posizione supina sulla piattaforma calda. Quindi, collegare i topi a un monitor per elettrocardiogramma (ECG) con gel per ultrasuoni. Mantenere l'anestesia utilizzando isoflurano all'1,5% con un flusso di 0,8 L/min.
    2. Preparare la pelle del torace e dell'addome utilizzando una crema depilatoria. Dopo qualche secondo, rimuovere la crema con una punta di cotone imbevuta di acqua tiepida. Posizionare il trasduttore (24 MHz) sulla linea addominale e ruotare il marcatore del trasduttore sulla testa dei topi.
    3. Spostare la piattaforma verso il basso sul lato sinistro o destro dei topi e utilizzare la modalità B e la modalità Color Doppler per visualizzare la vista sull'asse lungo dei vasi e dei segnali ematici18,19. Misurare la velocità del flusso sanguigno dell'AA, dell'IVC e della fistola per confermare la pervietà dell'AVF attraverso la modalità Doppler a onde pulsate.
      NOTA: La corretta creazione di fistole sull'ecografia è stata indicata da un segnale di flusso turbolento visibile tra l'AA e l'IVC (Figura 2C). La velocità del flusso sanguigno Doppler nel sito AVF era significativamente elevata rispetto a una velocità sistolica relativamente più bassa nell'AA (Figura 2A,C). Inoltre, in contrasto con i normali modelli di flusso nell'IVC (Figura 2B), anche la forma d'onda pulsatile del flusso sanguigno IVC prossimale all'AVF ha confermato il successo della creazione della fistola (Figura 2D).
  2. Conferma del VO mediante ecocardiografia
    1. Spostare la parte posteriore della piattaforma verso il basso, posizionare il trasduttore (24 MHz) sul petto e ruotare il marcatore del trasduttore sulla spalla destra dei topi. Visualizza la vista parasternale modificata dell'asse lungo dell'arteria polmonare (PA) utilizzando la modalità B e la modalità color Doppler.
    2. Utilizzando la modalità Doppler a onde pulsate, misurare i segnali del flusso sanguigno nel PA, tra cui l'integrale del tempo di velocità (PA-VTI), il diametro della valvola PA (PAD), il tempo di accelerazione arteriosa polmonare (PAT) e il tempo di eiezione del ventricolo destro (RVET) (Figura 2E,F e Figura 3A,B).
    3. Misurare i parametri ecografici dalla media di tre misurazioni consecutive. Calcolare la gittata sistolica del ventricolo destro (RVSV, mL) e la pressione sistolica del ventricolo destro (RVSP, mmHg) utilizzando le seguenti formule20:
      RVSV [mL] =1/4 × πD2 × VTIPA
      RVSP [mmHg] = -83,7 × PAT/RVET - indice + 63,7
      NOTA: Considerando la distorsione della misurazione ecografica, un aumento del >15% nelPA RVSV o VTI nei topi VO rispetto ai topi nel gruppo sham è stato considerato VO nel gruppo RV (Figura 2E,F).

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Results

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Tasso di sopravvivenza e pervietà AVF entro 3 mesi
Un totale di 30 (75%) topi nel gruppo VO e 19 (95%) topi nel gruppo sham sono sopravvissuti all'intervento chirurgico AVF (Figura 4A). Nel gruppo VO, otto topi sono morti entro 1 giorno dall'intervento chirurgico a causa di sanguinamento eccessivo (n = 5) o cannibalizzazione (n = 3), mentre due topi sono morti per cause sconosciute a 1 mese.

Dei topi VO sopravvissuti (n = 30), l'ecografia ha co...

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Discussion

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In precedenza, il classico modello RV VO veniva creato utilizzando il rigurgito della valvola21; tuttavia, rispetto alla FAV, la chirurgia della valvola a cuore aperto può richiedere tecniche più sofisticate e può essere associata a una mortalità significativamente più elevata, in particolare nei topi postnatali. Poiché gli studi sugli animali hanno dimostrato che lo stesso effetto del VO è stato ottenuto dall'AVF22, in questo studio è stata utilizzata la chirurgia della fi...

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Disclosures

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Non ci sono conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation of China (n. 82200309) e dall'Innovation Project of Distinguished Medical Team di Ningbo (n. 2022020405)

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
70% etanoloTiandz, chia
ACETAMINOFENE soluzione oraleVistaPharm, Inc. Largo, FL 33771, USANDC 66689-054-01
Macchina per anestesiaRWD Life Science, CinaR550IP
Maschera per anestesiaRWD Life Science, Cina68680
C57BL / 6 topiXipu' er-bikai Experimental Animal Co., Ltd (Shanghai, Cina)
Crema depilatoriaVeet, FranciaVT-200
Kit ematossilina ed eosina Beyotime biotech C0105M 
IsofluranoRWD Life Science, CinaR510-22-10
Microscopio  Yuyan Instruments, CinaSM-301
Aghi da sutura chirurgiciNINGBO MEDICAL NEEDLE CO., LTD, Cina
Piattaforma di riscaldamento termostaticoQingdao Juchuang Environmental Protection Group Co., Ltd, Cina
Dispositivo a ultrasuoniFUJIFILM VisualSonics, Inc.Vevo 2100includono la modalità B, la modalità Color Doppler e la modalità Doppler a onde pulsate
Gel per ultrasuoniParker Laboratories, Stati UnitiREF 01-08
Trasduttore a ultrasuoniFUJIFILM VisualSonics, Inc.MS 400
Le modalità di immagine

References

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