È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

La preparazione ex vivo di una fetta di midollo spinale per la registrazione del patch-clamp a cellula intera nei motoneuroni durante la stimolazione del midollo spinale

3.9K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/65385

⸱

8 settembre 2023

 ,  ,  , 
1National Engineering Research Center of Neuromodulation, School of Aerospace Engineering, Tsinghua University, 2IDG/McGovern Institute for Brain Research, Tsinghua University, 3School of Life Sciences, Tsinghua University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo che utilizza un patch-clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni alla stimolazione del midollo spinale (SCS) con un'elevata risoluzione spazio-temporale, che può aiutare i ricercatori a migliorare le loro capacità di separare il midollo spinale e mantenere contemporaneamente la vitalità cellulare.

Abstract

La stimolazione del midollo spinale (SCS) può ripristinare efficacemente la funzione locomotoria dopo una lesione del midollo spinale (SCI). Poiché i motoneuroni sono l'unità finale per eseguire i comportamenti sensomotori, studiare direttamente le risposte elettriche dei motoneuroni con SCS può aiutarci a comprendere la logica sottostante della modulazione motoria spinale. Per registrare simultaneamente diverse caratteristiche di stimolo e risposte cellulari, un patch-clamp è un buon metodo per studiare le caratteristiche elettrofisiologiche su scala di singola cellula. Tuttavia, ci sono ancora alcune difficoltà complesse nel raggiungere questo obiettivo, tra cui il mantenimento della vitalità cellulare, la rapida separazione del midollo spinale dalla struttura ossea e l'utilizzo dell'SCS per indurre con successo potenziali d'azione. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che utilizza patch-clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni a SCS con un'elevata risoluzione spaziotemporale, che può aiutare i ricercatori a migliorare le loro capacità di separare il midollo spinale e mantenere la vitalità cellulare allo stesso tempo per studiare senza problemi il meccanismo elettrico di SCS sul motoneurone ed evitare inutili tentativi ed errori.

Introduzione

La stimolazione del midollo spinale (SCS) può ripristinare efficacemente la funzione locomotoria dopo una lesione del midollo spinale (SCI). Andreas Rowald et al. hanno riportato che la SCS consente la funzione locomotoria e del tronco degli arti inferiori entro un solo giorno1. L'esplorazione del meccanismo biologico della SCS per il recupero locomotore è un campo di ricerca critico e di tendenza per lo sviluppo di una strategia SCS più precisa. Ad esempio, il team di Grégoire Courtine ha dimostrato che l'interneurone eccitatorio Vsx2 e i neuroni Hoxa10 nel midollo spinale sono i neuroni chiave per la risposta alla SCS e la neuromodulazione cellulo-specifica è fattibile per ripristinare la capacità di camminare del ratto dopo la lesione midollare2. Tuttavia, pochi studi si concentrano sul meccanismo elettrico della SCS su scala di una singola cellula. Sebbene sia ben noto che lo stimolo in corrente continua soprasoglia può suscitare i potenziali d'azione (AP) nel classico esperimento del calamaro 3,4,5, non è ancora chiaro come la stimolazione elettrica alternata pulsata, come la SCS, influenzi la generazione del segnale motorio.

Data la complessità dei circuiti neurali intraspinali, una selezione appropriata per la popolazione cellulare è importante per studiare il meccanismo elettrico della SCS. Sebbene la SCS ripristini la funzione motoria attivando la via propriocettiva6, i motoneuroni sono l'unità finale per eseguire il comando motorio, derivato dall'integrazione dell'input afferente alle informazioni sulla propriocezione7. Pertanto, studiare direttamente le caratteristiche elettriche dei motoneuroni con SCS può aiutarci a comprendere la logica sottostante alla modulazione motoria spinale.

Come sappiamo, il patch-clamp è il metodo gold standard per la registrazione elettrofisiologica cellulare con una risoluzione spazio-temporale estremamente elevata8. Pertanto, questo studio descrive un metodo che utilizza un patch clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni alla SCS. Rispetto al cerotto cerebrale9, il cerotto per il midollo spinale è più difficile per i seguenti motivi: (1) Il midollo spinale è protetto dal canale vertebrale con un volume minuscolo, che richiede una micromanipolazione molto fine e una rigorosa manutenzione ghiacciata per ottenere una migliore vitalità cellulare. (2) Poiché il midollo spinale è troppo sottile per essere fissato sul vassoio di taglio, deve essere immerso in agarosio a basso punto di fusione e tagliato dopo la solidificazione.

Quindi, questo metodo fornisce dettagli tecnici nella dissezione del midollo spinale e nel mantenimento della vitalità cellulare allo stesso tempo, in modo da studiare senza problemi il meccanismo elettrico della SCS sui motoneuroni ed evitare inutili prove ed errori.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Il Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali ha approvato tutti gli esperimenti sugli animali e gli studi sono stati condotti in conformità con le normative vigenti in materia di benessere degli animali.

1. Preparazione degli animali

  1. Animali
    1. Informazioni sull'alloggiamento: Ratti Sprague-Dawley maschi (10-14 giorni postnatali, P10-P14) in un ambiente specifico privo di agenti patogeni.
      NOTA: Le condizioni ambientali sono state mantenute a 20 °C ± 2 °C, umidità: 50%-60%, con un ciclo luce/buio di 12 ore. Gli animali avevano libero accesso al cibo e all'acqua.
    2. Etichettare i motoneuroni retrogradamente: iniettare fluoro-oro (FG) nel muscolo bilaterale tibiale anteriore e gastrocnemio (2% in soluzione fisiologica sterile, 50 μL per muscolo) per marcare retrogradamente i motoneuroni 2 giorni prima del sacrificio.
  2. Soluzioni
    1. Preparare la soluzione di taglio: mescolare 120 mM di cloruro di colina, 2,6 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1,25 mM NaH 2 PO4, 0,5 mM CaCl 2, 7 mM MgCl2, 1,3 mM di acido ascorbico, 15 mM di glucosio. Pre-bolle la soluzione con il 95% di O 2 e il 5% di CO2 (regolare a pH 7,4 con KOH) per 30 minuti prima della dissezione e dell'affettatura. Raffreddare la soluzione con ghiaccio tritato.
    2. Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (ACSF): Mescolare 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4; 1,3 mM di MgCl 2, 2,4 mM di CaCl2, 26 mM di NaHCO3 e 10 mM di glucosio. Pre-bolle la soluzione con il 95% di O 2 e il 5% di CO2 per 30 minuti prima dell'incubazione.
    3. Preparare la soluzione intracellulare: Mescolare 126 mM di K-gluconato, 2 mM KCl, 2 mM di MgCl 2, 0,2 mM di EGTA, 10 mM di HEPES, 4 mM di Na 2 ATP, 0,4 mM di Na2GTP, 10 mM di K-fosfocreatina e 0,5% di Neurobiotina (pH 7,25 e 305 mOsm/Kg). Raffreddare la soluzione con ghiaccio tritato.
    4. Preparare il gel di agarosio a basso punto di fusione: sciogliere 4 g di agarosio in 100 ml di soluzione da taglio e utilizzare un rotore di agitazione magnetico per scioglierlo completamente. A 30 minuti prima dell'incorporazione, riscaldare l'agarosio a basso punto di fusione nel forno a microonde ad alta potenza per 1 minuto, quindi trasferirlo a bagnomaria a 39 °C per mantenere lo stato liquido.
  3. Preparazione dello strumento
    1. Posizionare il ghiaccio tritato sul vassoio di perfusione (Figura supplementare 1A) 10 minuti prima della perfusione. Posizionare il vassoio anatomico (Figura supplementare 1B) e il vassoio di taglio (Figura supplementare 1C) con una fascia d'acqua a -80 °C durante la notte in anticipo.
    2. Mettere la camera di incubazione con rete di nylon in forno a 45 °C per una notte in anticipo.
    3. Utilizzare agarosio a basso punto di fusione per prefabbricare una pendenza di 35° e una piattaforma di 2 mm di spessore (Figura supplementare 1D). Dopo la solidificazione del gel, posizionarli al centro di una capsula di Petri da 35 mm per sostenere il midollo spinale nelle successive procedure.
  4. Perfusione intracardica
    1. Anestetizzare i ratti con tribromoetanolo al 2,5% (160 μL/10 g) tramite iniezione intraperitoneale. Assicurarsi che i ratti siano completamente anestetizzati verificando la mancanza di risposta agli stimoli esterni, come un leggero pizzicotto del dito del piede.
    2. Quando l'anestesia corretta è confermata, posizionare i ratti in posizione supina e immobilizzarli nella capsula di Petri riempita di gel di silice.
    3. Praticare un'incisione cutanea longitudinale di 5 mm caudalmente al processo xifoideo, quindi espandere completamente lo spazio sottocutaneo. Praticare un'incisione cutanea longitudinale di 2 cm lungo la linea mediana ventrale per esporre completamente la parete toracica esterna, iniziando con l'incisione sopra menzionata e terminando con la parte superiore del torace.
    4. Utilizzare una pinzetta dentata per sollevare lo xifoide (Figura supplementare 2A), quindi utilizzare forbici sottili per tagliare il diaframma. Tagliare lo sterno lungo entrambi i lati del processo xifoideo per aprire il torace ed esporre il cuore (Figura 2B supplementare).
      NOTA: Fare attenzione a preservare i vasi toracici interni su entrambi i lati; in caso contrario, potrebbe causare un'emorragia massiccia.
    5. Usa una pinzetta senza denti per sollevare il ventricolo sinistro. Inserire un ago da 22 G nell'apice ventricolare sinistro lungo l'asse longitudinale del ventricolo sinistro (Figura 2C supplementare). Nel frattempo, osserva la pulsazione ritmica del sangue nel tubo di perfusione, altrimenti l'ago potrebbe perforare il ventricolo destro, il che potrebbe portare a uno scarso effetto di perfusione.
      NOTA: La pinzetta dentata non deve essere utilizzata; in caso contrario, potrebbe causare ulteriori perdite di sangue dal sito di tenuta della pinzetta.
    6. Utilizzare forbici sottili per tagliare l'atrio destro (Figura supplementare 2C), quindi iniettare manualmente 100 ml di fluido perfusivo ghiacciato a una velocità di circa 2 ml/s entro 1 minuto.
      NOTA: Quando il fegato e le zampe dei ratti impallidiscono e il sangue non fuoriesce dall'atrio destro, è possibile ottenere una buona perfusione.
  5. Dissezione del midollo spinale (Figura 1)
    1. Posizionare il ratto in posizione prona e tagliare la colonna vertebrale rispettivamente in corrispondenza della spina iliaca anteriore superiore (circa il livello vertebrale L4) e del punto di spostamento della curvatura della colonna toracica (circa il livello vertebrale T6) (Figura 1A). Quindi, posizionare immediatamente la colonna vertebrale isolata nella soluzione di perfusione ghiacciata ossigenata per lavare via il sangue residuo e il tessuto adiposo; Questa procedura è utile per mantenere pulito il campo operatorio nelle procedure successive.
      NOTA: I muscoli paraspinali devono essere riservati, il che favorisce la successiva fissazione della colonna vertebrale utilizzando una spilla per insetti.
    2. Trasferire immediatamente la colonna vertebrale isolata nel vassoio anatomico (Figura 1B) con il lato dorsale rivolto verso l'alto e l'estremità rostrale vicino all'operatore. Riempire il vassoio anatomico con 50 ml di soluzione da taglio ghiacciata continuamente ossigenata (Figura 1B).
    3. Utilizzare quattro spilli per insetti per fissare la colonna vertebrale penetrando nei muscoli paraspinali (Figura 1B).
    4. Sotto il microscopio di dissezione, tagliare i peduncoli vertebrali di entrambi i lati dall'estremità rostrale con la microforbice, che può essere definita "laminectomia" (Figura 1C). Prestare attenzione a non danneggiare il midollo spinale. Nel frattempo, usa le pinzette micro-dentate per sollevare il corpo vertebrale tagliato.
    5. Dopo la laminectomia, non separare immediatamente il midollo spinale dal canale spinale. Invece, usa una microforbice per tagliare la dura madre lungo la linea mediana dorsale, che favorisce l'assorbimento dei nutrienti tra le cellule e l'ACSF ossigenato (Figura 1D).
      NOTA: Non strappare mai la dura madre. È consentito solo tagliare la dura madre con microforbici; in caso contrario, la radice nervosa e il parenchima spinale saranno seriamente danneggiati!
    6. Sollevare la parte rostrale del midollo spinale, quindi tagliare con cura la radice nervosa riservando circa 1 mm (Figura 1E). Dopo aver separato il midollo spinale dal canale vertebrale, utilizzare 2 spilli per insetti per fissare il midollo spinale con il lato ventrale rivolto verso l'alto (Figura 1F).
    7. Usa una microforbice per tagliare la dura madre lungo la linea mediana ventrale (Figura 1F). Tagliare le radici nervose ridondanti con circa 1 mm di riserva.
      NOTA: Il nervo è molto più tenace del midollo spinale. Se la radice nervosa riservata è troppo lunga (>1 mm), il vibratomo non può tagliare la radice nervosa, il che può portare a una grave lacerazione del parenchima spinale.
    8. Utilizzare una microforbice per separare l'allargamento lombare a una lunghezza di 6-7 mm (Figura 1G).
  6. Incorporazione nell'agarosio a basso punto di fusione
    1. Posizionare l'allargamento lombare sulla pendenza di 35° (Figura 1H) con il lato dorsale rivolto verso l'alto e l'estremità caudale verso il basso. Utilizzare una carta assorbente da filtro per rimuovere l'abbondante acqua sulla superficie del tessuto (Figura 1H).
    2. Versare lentamente il gel di agarosio fuso nella capsula di Petri contenente l'allargamento lombare (Figura 1I).
      NOTA: Non versare troppo velocemente, altrimenti si accumuleranno bolle nel gel.
    3. Mettere la capsula di Petri di cui sopra nella miscela di acqua ghiacciata per raffreddare il gel il prima possibile, il che favorisce il mantenimento dell'attività delle cellule.
    4. Tagliare il gel in un cubo di 15 mm x 10 mm x 10 mm e montarlo sul disco del campione con supercolla (Figura 1J).
  7. Affettamento
    1. Posizionare il disco portacampioni nel vassoio di taglio precongelato, quindi versare la soluzione di taglio ghiacciata (Figura 1K). Far bollire continuamente con il 95% di CO 2 e il 5% di O2 nel vassoio di taglio.
    2. Impostare i parametri del vibratomo: spessore: 350 μm; velocità: 0,14-0,16 mm/s, ampiezza: 1,0 mm e frequenza di vibrazione: 85 Hz.
    3. Raccogli 2-3 fette adatte per animale. Registra 1-2 motoneuroni FG+ sani per fetta, con un intervallo di 5-6 cellule per animale.
  8. Incubazione
    1. Utilizzare una pinzetta per vetrini di copertura per tagliare una fetta (Figura 1L) e posizionarla nella camera di incubazione riempita con ACSF continuamente ossigenato. Porre la camera di incubazione a bagnomaria a 32 °C per 30 minuti, quindi continuare a incubarla a temperatura ambiente (RT) per altri 30 minuti prima della registrazione.
      NOTA: Le procedure di cui sopra, dall'anestesia all'ottenimento della prima fetta, devono essere completate entro 20-30 minuti per mantenere il più possibile la vitalità delle cellule. I motoneuroni in ogni fetta possono mantenere la loro vitalità per circa 6-7 ore.

2. Registrazione patch-clamp con SCS (Figura 2)

  1. Preparazioni
    1. Perfondere la camera di registrazione con ACSF a bolle continue ad una velocità di circa 1-2 mL/min. Regolare la portata individualmente tramite il pannello di controllo sulla pompa peristaltica.
    2. Posizionare una fetta nella camera di registrazione. Usa il filo di platino a forma di U con fili di nylon per stabilizzare saldamente la fetta in posizione.
    3. Utilizzare un microscopio a contrasto a interferenza differenziale infrarossa (IR-DIC) per osservare la fetta. Sotto l'obiettivo 4x, verificare che la lunghezza della radice dorsale sia di circa 1 mm. Trova l'area in cui la radice dorsale entra nel parenchima, quindi sposta il campo visivo centrale in quest'area.
    4. Collegare il generatore di impulsi con elettrodi personalizzati (Figura 2A).
  2. Configurazione SCS
    1. Posizionare l'anodo di SCS vicino alla linea mediana dorsale tramite il sistema di micromanipolazione (Figura 2B).
    2. Posizionare il catodo di SCS vicino alla zona di ingresso della radice dorsale (DREZ) tramite il sistema di micromanipolazione (Figura 2B).
  3. Targeting cellulare e imaging
    1. Usa IR-DIC con un obiettivo 10x trova approssimativamente la regione dorsolaterale della colonna motoria, dove si trova la maggior parte dei motoneuroni. Quindi, sposta il campo visivo centrale in quest'area.
    2. Passa a una lente dell'obiettivo 60x per trovare un neurone sano con una superficie liscia e luminosa e nuclei invisibili (Figura 2C,F).
    3. Abbassare leggermente l'intensità IR e accendere la sorgente luminosa a fluorescenza. Passare dal filtro della luce al filtro di eccitazione ultravioletta a banda larga (Figura 2D,G), per selezionare un motoneurone FG-positivo (FG+) appropriato (Figura 2E,H).
    4. Utilizzare elettrodi di aspirazione per applicare 1x stimolazione di soglia motoria alla radice dorsale. Se viene rilevato un potenziale d'azione evocato nei motoneuroni (Figura supplementare 3), ciò conferma che l'attività della radice dorsale è intatta. In caso contrario, questa fetta deve essere scartata.
  4. Registrazione patch-clamp
    1. Riempire la micropipetta con la soluzione intracellulare e inserirla nel portaelettrodo. Utilizzare il sistema di micromanipolazione per abbassare la pipetta nel bagno ACSF. La resistenza della pipetta varia da 5 a 8 MΩ.
    2. Applicare una piccola quantità di pressione positiva alla pipetta per soffiare via la polvere e i detriti cellulari.
      1. Abbassare l'elettrodo per avvicinarlo alla cella. Quando la pipetta tocca la superficie del neurone FG+, una piccola rientranza della membrana diventa visibile a livello della punta. Rilasciare la pressione positiva.
      2. Quindi, applicare una piccola quantità di pressione negativa alla pipetta utilizzando una siringa. Questo crea una piccola quantità di aspirazione che tira la membrana cellulare a contatto con la pipetta di vetro. Prestare sempre attenzione alla resistenza totale sull'interfaccia software fino a quando il valore della resistenza non aumenta a gigaohm (>1 GΩ). Quindi, si forma il gigaseal.
    3. Bloccare il potenziale di membrana a -70 mV, quindi premere il pulsante di compensazione rapida della capacità sull'interfaccia software dell'amplificatore. Applicare delicatamente una pressione negativa transitoria per rompere la membrana cellulare, quindi premere il pulsante di compensazione della capacità lenta sull'interfaccia software dell'amplificatore. A questo punto, si ottiene una buona configurazione a cellula intera.
    4. Passare alla modalità di pinza amperometrica facendo clic sul pulsante IC sull'interfaccia software e registrare il potenziale di membrana a riposo (RMP).
    5. Applicare l'SCS per 1-2 s con l'ampiezza di 1-10 mA, mentre l'ampiezza e la frequenza dell'impulso sono fissate rispettivamente a 210 μs e 40 Hz. Determinare la soglia motoria aumentando lentamente l'ampiezza della stimolazione fino a quando non si osserva il primo AP.
    6. Distinguere i motoneuroni a fuoco ritardato e immediato utilizzando un'iniezione di corrente depolarizzante di 5 s attorno alla reobase nella modalità current-clamp10,11,12. Motoneuroni a fuoco immediato: una bassa reobase può indurre un'accensione immediata e ripetitiva con una frequenza di attivazione stabile; Motoneuroni a fuoco ritardato: un'elevata base reometrica può indurre un'insorgenza ritardata per l'accensione ripetitiva con una velocità di attivazione accelerata (Figura 3).
    7. Quando SCS è disattivato, continuare a registrare il potenziale di membrana per l'acquisizione dell'attivazione spontanea degli AP.
    8. Eseguire registrazioni voltage-clamp registrazioni voltage-clamp per la corrente postsinaptica eccitatoria (EPSC) quando SCS è acceso e spento. Il parametro di stimolazione è 1x soglia motoria, 210 μs, 2 Hz.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Grazie al rigoroso mantenimento a bassa temperatura durante l'operazione fine (Figura 1 supplementare, Figura 2 supplementare e Figura 1), la vitalità cellulare è stata sufficiente per eseguire successive registrazioni elettrofisiologiche. Per simulare il più possibile lo scenario clinico, abbiamo utilizzato la micromanipolazione per posizionare il catodo e l'anodo SCS vicino alla linea mediana dorsale e DREZ, rispettivamente (Figura 2), che pot...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Le informazioni di movimento modulate da SCS vengono infine condivise nei motoneuroni. Pertanto, prendere i motoneuroni come obiettivo di ricerca può semplificare il disegno dello studio e rivelare il meccanismo di neuromodulazione della SCS in modo più diretto. Per registrare simultaneamente diverse caratteristiche di stimolo e risposte cellulari, un patch-clamp è un buon metodo per studiare le caratteristiche elettrofisiologiche su scala di singola cellula. Tuttavia, ci sono ancora alcune difficoltà, tra cui come mante...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ringraziamenti

Questo studio è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (52207254 e 82301657) e dal China Postdoctoral Science Fund (2022M711833).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Adenosina 5'-trifosfato sale di magnesioSigmaA9187
Acido ascorbicoSigmaA4034
CaCl2· 2H2OSigmaC5080
Cloruro di colinaSigmaC7527
Pinzetta a scorrimentodi copertura VETUS36A-SAClip una fetta
D-GlucosioSigmaG8270
EGTASigmaE4378
Forbici finiRWD Life ScienceS12006-10Taglia il diaframma
Sorgente luminosa a fluorescenzaOlympus U-HGLGPS
Fluoro-GoldFluorochromeFluorochrome Label il motoneurone
Guanosina 5′-trifosfato sale di sodio idratoSigmaG8877
HEPESSigmaH3375
telecamera CCD a infrarossiDage-MTIIR-1000E
KClSigmaP5405
K-gluconatoSigmaP1847
Basso punto di fusione agarosioSigmaA9414
MgSO4· 7H2OSigmaM2773
 Strumento Sutter MP-200
Estrattore per micropipetteStrumento SutterP1000
Micro-forbici Jinzhongwa1020Microscopio per laminectomia
per anatomiaOlimpoMicroscopio SZX10
per eclorofisiologiaOlympus BX51WI
Pinzetta microdentataRWD Life ScienceF11008-09Sollevare il corpo vertebrale tagliato
NaClSigmaS5886
NaH2PO4SigmaS8282
NaHCO3SigmaV900182
Na-FosfocreatinaSigmaP7936
Obiettivo per eclorotrofisiologiaOlympus LUMPLFLN60XWdistanza di lavoro 2 mm 
Osmometro Avanzato FISKE 210
Amplificatore patch-clamp Assone Multiclamp 700B
Digitalizzatore patch-clampAxon Misuratore di pH Digidata 1550B
 Mettler ToledoFE28
Slice AnchorSistema multicanaleSHD-27H
Stimolatore del midollo spinalePINST901
Pinzetta dentataRWD Life ScienceF13030-10Sollevare il
vibratomoLeicaVT1200S
Filtro di eccitazione ultravioletta a banda largaOlympus U-MF2
Micromanipolatore xifoide

Riferimenti

  1. Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
  2. Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
  3. Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
  4. Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
  5. Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
  6. Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
  7. Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
  8. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  9. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525(2016).
  10. Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385(2021).
  11. Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586(2018).
  12. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046(2014).
  13. Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
  14. Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696(2020).
  15. Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
  16. Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
  17. Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917(2022).
  18. Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
  19. Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358(2022).
  20. Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
  21. Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312(2012).
  22. Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
  23. Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
  24. Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
  25. Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
  26. Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
  27. Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
  28. Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Registrazione elettrofisiologicavitalit cellularepotenziali d azionelesione del midollo spinalesezionamento con vibratomo
La preparazione ex vivo di una fetta di midollo spinale per la registrazione del patch-clamp a cellula intera nei motoneuroni durante la stimolazione del midollo spinale
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.