Questo protocollo descrive un metodo che utilizza un patch-clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni alla stimolazione del midollo spinale (SCS) con un'elevata risoluzione spazio-temporale, che può aiutare i ricercatori a migliorare le loro capacità di separare il midollo spinale e mantenere contemporaneamente la vitalità cellulare.
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Articolo metodologico
La preparazione ex vivo di una fetta di midollo spinale per la registrazione del patch-clamp a cellula intera nei motoneuroni durante la stimolazione del midollo spinale
In questo articolo
Sommario
Abstract
La stimolazione del midollo spinale (SCS) può ripristinare efficacemente la funzione locomotoria dopo una lesione del midollo spinale (SCI). Poiché i motoneuroni sono l'unità finale per eseguire i comportamenti sensomotori, studiare direttamente le risposte elettriche dei motoneuroni con SCS può aiutarci a comprendere la logica sottostante della modulazione motoria spinale. Per registrare simultaneamente diverse caratteristiche di stimolo e risposte cellulari, un patch-clamp è un buon metodo per studiare le caratteristiche elettrofisiologiche su scala di singola cellula. Tuttavia, ci sono ancora alcune difficoltà complesse nel raggiungere questo obiettivo, tra cui il mantenimento della vitalità cellulare, la rapida separazione del midollo spinale dalla struttura ossea e l'utilizzo dell'SCS per indurre con successo potenziali d'azione. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che utilizza patch-clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni a SCS con un'elevata risoluzione spaziotemporale, che può aiutare i ricercatori a migliorare le loro capacità di separare il midollo spinale e mantenere la vitalità cellulare allo stesso tempo per studiare senza problemi il meccanismo elettrico di SCS sul motoneurone ed evitare inutili tentativi ed errori.
Introduzione
La stimolazione del midollo spinale (SCS) può ripristinare efficacemente la funzione locomotoria dopo una lesione del midollo spinale (SCI). Andreas Rowald et al. hanno riportato che la SCS consente la funzione locomotoria e del tronco degli arti inferiori entro un solo giorno1. L'esplorazione del meccanismo biologico della SCS per il recupero locomotore è un campo di ricerca critico e di tendenza per lo sviluppo di una strategia SCS più precisa. Ad esempio, il team di Grégoire Courtine ha dimostrato che l'interneurone eccitatorio Vsx2 e i neuroni Hoxa10 nel midollo spinale sono i neuroni chiave per la risposta alla SCS e la neuromodulazione ce....
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Protocollo
Il Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali ha approvato tutti gli esperimenti sugli animali e gli studi sono stati condotti in conformità con le normative vigenti in materia di benessere degli animali.
1. Preparazione degli animali
- Animali
- Informazioni sull'alloggiamento: Ratti Sprague-Dawley maschi (10-14 giorni postnatali, P10-P14) in un ambiente specifico privo di agenti patogeni.
NOTA: Le condizioni ambientali sono state mantenute a 20 °C ± 2 °C, umidità: 50%-60%, con un ciclo luce/buio di 12 ore. Gli animali avevano libero accesso al cibo e all'acqua. - Etichettare i motone....
- Informazioni sull'alloggiamento: Ratti Sprague-Dawley maschi (10-14 giorni postnatali, P10-P14) in un ambiente specifico privo di agenti patogeni.
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Risultati
Grazie al rigoroso mantenimento a bassa temperatura durante l'operazione fine (Figura 1 supplementare, Figura 2 supplementare e Figura 1), la vitalità cellulare è stata sufficiente per eseguire successive registrazioni elettrofisiologiche. Per simulare il più possibile lo scenario clinico, abbiamo utilizzato la micromanipolazione per posizionare il catodo e l'anodo SCS vicino alla linea mediana dorsale e DREZ, rispettivamente (Figura 2), che pot.......
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Discussione
Le informazioni di movimento modulate da SCS vengono infine condivise nei motoneuroni. Pertanto, prendere i motoneuroni come obiettivo di ricerca può semplificare il disegno dello studio e rivelare il meccanismo di neuromodulazione della SCS in modo più diretto. Per registrare simultaneamente diverse caratteristiche di stimolo e risposte cellulari, un patch-clamp è un buon metodo per studiare le caratteristiche elettrofisiologiche su scala di singola cellula. Tuttavia, ci sono ancora alcune difficoltà, tra cui come mante.......
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Ringraziamenti
Questo studio è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (52207254 e 82301657) e dal China Postdoctoral Science Fund (2022M711833).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Adenosina 5'-trifosfato sale di magnesio | Sigma | A9187 | |
| Acido ascorbico | Sigma | A4034 | |
| CaCl2· 2H2O | Sigma | C5080 | |
| Cloruro di colina | Sigma | C7527 | |
| Pinzetta a scorrimento | di copertura VETUS | 36A-SA | Clip una fetta |
| D-Glucosio | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Forbici fini | RWD Life Science | S12006-10 | Taglia il diaframma |
| Sorgente luminosa a fluorescenza | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome Label il motoneurone | |
| Guanosina 5′-trifosfato sale di sodio idrato | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| telecamera CCD a infrarossi | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconato | Sigma | P1847 | |
| Basso punto di fusione agarosio | Sigma | A9414 | |
| MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | |
| Strumento Sutter | MP-200 | ||
| Estrattore per micropipette | Strumento Sutter | P1000 | |
| Micro-forbici | Jinzhong | wa1020 | Microscopio per laminectomia |
| per anatomia | Olimpo | Microscopio SZX10 | |
| per eclorofisiologia | Olympus | BX51WI | |
| Pinzetta microdentata | RWD Life Science | F11008-09 | Sollevare il corpo vertebrale tagliato |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Fosfocreatina | Sigma | P7936 | |
| Obiettivo per eclorotrofisiologia | Olympus | LUMPLFLN60XW | distanza di lavoro 2 mm |
| Osmometro | Avanzato | FISKE 210 | |
| Amplificatore patch-clamp | Assone | Multiclamp 700B | |
| Digitalizzatore patch-clamp | Axon | Misuratore di pH Digidata 1550B | |
| Mettler Toledo | FE28 | ||
| Slice Anchor | Sistema multicanale | SHD-27H | |
| Stimolatore del midollo spinale | PINS | T901 | |
| Pinzetta dentata | RWD Life Science | F13030-10 | Sollevare il |
| vibratomo | Leica | VT1200S | |
| Filtro di eccitazione ultravioletta a banda larga | Olympus | U-MF2 |
Riferimenti
- Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
- Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after....
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Ristampe e permessi
