Imaging chimico iperspettrale non lineare multimodale mediante microscopia a scansione lineare con generazione di somma-frequenza vibrazionale

La generazione di somma-frequenza vibrazionale (VSFG), una tecnica ottica non lineare del secondo ordine ^1,2, è stata ampiamente utilizzata come strumento di spettroscopia per profilare chimicamente campioni simmetrici^consentiti 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13^, 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Tradizionalmente, il VSFG è stato applicato ai sistemi interfacciali 8,9,10,11 (cioè gas-liquido, liquido-liquido, gas-solido^, solido-liquido), che mancano di simmetria di inversione - un requisito per l'attività VSFG. Questa applicazione di VSFG ha fornito una vasta gamma di dettagli molecolari delle interfacce sepolte 12,13, delle configurazioni delle molecole d'acqua alle interfacce 14,15,16,17,18 e delle specie chimiche alle interfacce 19,20,21,22.

Sebbene il VSFG sia stato potente nel determinare le specie molecolari e le configurazioni alle interfacce, il suo potenziale nella misurazione delle strutture molecolari di materiali privi di centri di inversione non è stato realizzato. Ciò è in parte dovuto al fatto che i materiali potrebbero essere eterogenei nel loro ambiente chimico, nelle composizioni e nella disposizione geometrica, e uno spettrometro VSFG tradizionale ha un'ampia area di illuminazione dell'ordine di 100 μm². Pertanto, la spettroscopia VSFG tradizionale riporta informazioni mediate dall'ensemble del campione su una tipica area di illuminazione di 100 μm². Questa media d'insieme può portare a cancellazioni di segnale tra domini ben ordinati con orientamenti opposti e a un'errata caratterizzazione delle eterogeneità locali 15,20,23,24.

Con i progressi negli obiettivi per microscopi ad alta apertura numerica (NA), basati su riflessione (geometrie di Schwarzschild e Cassegrain), che sono quasi privi di aberrazioni cromatiche, la dimensione del fuoco dei due fasci negli esperimenti VSFG può essere ridotta da 100 μm 2 a 1-2 μm² e in alcuni casi submicron²⁵. Compreso questo progresso tecnologico, il nostro gruppo e altri hanno sviluppato VSFG in una piattaforma di microscopia 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Recentemente, abbiamo implementato un layout ottico invertito e uno schema di rilevamento a banda larga³⁷, che consente una raccolta senza soluzione di continuità di immagini multimodali (VSFG, generazione di seconda armonica (SHG) e ottica in campo chiaro). L'imaging multimodale consente una rapida ispezione dei campioni utilizzando l'imaging ottico, correlando tra loro vari tipi di immagini e localizzando le posizioni del segnale sulle immagini del campione. Con l'ottica di illuminazione acromatica e la scelta della sorgente di illuminazione laser pulsata, questa piattaforma ottica consente in futuro l'integrazione senza soluzione di continuità di tecniche aggiuntive come la microscopia a fluorescenza³⁸ e la microscopia Raman, tra le altre.

In questa nuova disposizione, sono stati studiati campioni come le organizzazioni gerarchiche e una classe di auto-assemblaggi molecolari (MSA). Questi materiali includono il collagene e la biomimetica, in cui sia la composizione chimica che l'organizzazione geometrica sono importanti per la funzione finale del materiale. Poiché VSFG è un segnale ottico non lineare del secondo ordine, è specificamente sensibile alle disposizioni intermolecolari^39,40, come la distanza intermolecolare o gli angoli di torsione^, il che lo rende uno strumento ideale per rivelare sia le composizioni chimiche che le disposizioni molecolari. Questo lavoro descrive le modalità VSFG, SHG e campo chiaro dello strumento principale costituito da un laser a stato solido a cavità drogato con itterbio che pompa un amplificatore parametrico ottico (OPA), un microscopio invertito multimodale costruito in casa e un analizzatore di frequenza monocromatore accoppiato a un rivelatore bidimensionale ad accoppiamento caricato (CCD)²⁷. Vengono fornite procedure dettagliate di costruzione e allineamento e un elenco completo delle parti della configurazione. Un'analisi approfondita di un MSA, la cui subunità molecolare fondamentale è costituita da una molecola di sodio-dodecilsolfato (SDS), un tensioattivo comune, e due molecole di β-ciclodestrina (β-CD), nota come SDS@2 β-CD, viene fornita anche come esempio per mostrare come VSFG può rivelare dettagli geometrici specifici della molecola della materia organizzata. È stato inoltre dimostrato che i dettagli geometrici chimicamente specifici dell'MSA possono essere determinati con un approccio risolutore di funzioni di rete neurale.

1. Microscopio VSFG a scansione lineare iperspettrale

1. Sistema laser
   1. Utilizzare un sistema laser pulsato (vedi Tabella dei materiali) centrato a 1025 nm ± 5 nm. Il laser è impostato a 40 W, 200 kHz (200 μJ/impulso) con un'ampiezza di impulso di ~290 fs.
      NOTA: L'esatta frequenza di ripetizione può variare e un laser ad alta frequenza di ripetizione generalmente funziona meglio per questo microscopio VSFG.
   2. Guidare l'uscita del laser a semina in un amplificatore parametrico ottico (OPA) commerciale per generare un fascio nel medio infrarosso (MIR) (vedere la tabella dei materiali). Regolare il MIR sulla frequenza degli interessi (Figura 1A).
      NOTA: Nel presente studio, il MIR è centrato a 3450 nm ± 85 nm (~2900 ± 72 ^cm-1) con una durata dell'impulso di ~290 fs e un'energia dell'impulso di ~6 μJ, che comprende parte della regione del gruppo funzionale -CH_x .
2. Trave di conversione verso l'alto
   1. Far passare il fascio residuo di 1025 nm da OPA attraverso un etalon Fabry-Perot (vedi Tabella dei materiali) per produrre un fascio di conversione verso l'alto spettralmente ristretto con un FWHM di ~4,75 ^cm-1.
   2. Filtra spazialmente il fascio ristretto di 1025 nm con un foro stenopeico in zaffiro da 8 μm.
      NOTA: Il fascio di 1025 nm può essere visualizzato utilizzando una scheda NIR.
   3. Controllare la polarizzazione dell'impulso a 1025 nm con una piastra d'onda λ/2 (vedi Tabella dei materiali).
3. Trave MIR
   1. Guidare il fascio MIR attraverso uno stadio di ritardo per un controllo preciso della sovrapposizione temporale.
   2. Controlla la polarizzazione del MIR con una piastra d'onda λ/2.
4. Microscopio VSFG
   1. Sovrapponi spazialmente sia i fasci di conversione verso l'alto che i fasci MIR in uno specchio dicroico personalizzato (DM, Figura 1B) che è trasmissivo a MIR e riflettente a NIR (vedi Tabella dei materiali). Usa due iridi per guidare l'allineamento: uno subito dopo il DM e uno all'estremità. Utilizzare un misuratore di potenza dopo il diaframma per determinare se il MIR è centrato e utilizzare una scheda NIR per individuare le posizioni NIR.
      NOTA: Dopo la sovrapposizione, il raggio NIR può essere utilizzato per guidare entrambi i raggi.
   2. Dirigere i fasci sovrapposti in un microscopio invertito con uno scanner a fascio risonante monoassiale integrato a 325 Hz (montato su uno scanner integrato a due posizioni (I2PS), Figura 1B) (vedere la tabella dei materiali).
      NOTA: Lo scanner risonante proietta una linea dei due fasci sovrapposti sull'apertura posteriore dell'obiettivo a condensatore. È montato su un cursore che consente la riconfigurazione senza soluzione di continuità tra le modalità VSFG/SHG e campo chiaro.
   3. Focalizzare i due fasci spazialmente sovrapposti sul campione con un obiettivo Schwarzschild puramente riflettente (SO, Figura 1B,D) (vedi Tabella dei materiali).
   4. Raccogliere il segnale VSFG generato dal campione con un obiettivo refrattivo corretto all'infinito (RO, Figura 1B,D) (vedi Tabella dei materiali).
   5. Guidare il segnale VSFG in uscita collimato attraverso un polarizzatore lineare e quindi attraverso un sistema di lenti tubolari telecentriche composto da due lenti focali f = 60 mm (TL1 e TL2, Figura 1B,C) (vedi Tabella dei Materiali).
      NOTA: L'immagine ingrandita dalle lenti del tubo si forma nella fessura d'ingresso del monocromatore (MC, Figura 1B,C) e i dati risolti spazialmente/frequenza vengono rilevati su un rivelatore CCD bidimensionale (CCD, Figura 1B).
5. Modalità SHG
   1. Per passare all'imaging SHG, bloccare il fascio IR e ruotare il reticolo dello spettrografo a 501,5 nm per visualizzare il segnale SHG.
6. Modalità campo chiaro
   1. Per passare all'imaging ottico in campo chiaro, accendere la sorgente di luce bianca (vedere Tabella dei materiali). Spostare il cursore integrato (I2PS, Figura 1B) per raccogliere immagini in campo chiaro nella direzione di contropropagazione, con l'obiettivo di imaging (RO) che funge da condensatore e l'obiettivo a condensatore (SO) che funge da obiettivo di imaging.
   2. Formare un'immagine dell'uscita collimata dell'obiettivo rifrattivo sul piano del sensore di una fotocamera RGB in campo chiaro utilizzando un sistema tubo-obiettivo disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).

Figura 1: Microscopio VSFG iperspettrale multimodale. (A) Vista dall'alto della configurazione principale. Un laser a pompa da 1025 nm è stato inviato a un OPA per generare un impulso modulabile nel medio infrarosso. I 1025 nm residui sono stati spesso ristretti da un etalon (E) e filtrati spazialmente in un fascio gaussiano da un filtro spaziale (SFG). I fasci di medio infrarosso e 1025 nm sono spazialmente sovrapposti a uno specchio dicroico (DM) personalizzato e guidati attraverso il microscopio invertito (regione scatolata in A). (B) I due fasci vengono inviati a uno scanner a fascio risonante a 325 Hz montato su un cursore integrato a 2 posizioni (I2PS), consentendo la commutazione senza soluzione di continuità tra le modalità ottiche in campo chiaro e non lineari. La piattaforma del microscopio è dotata di un obiettivo Schwarzschild (SO) con correzione all'infinito basato su riflessione che funge da condensatore e di un obiettivo di imaging (RO) con correzione all'infinito basato sulla rifrazione montato su uno stadio dell'asse z di nanoposizionamento verticale (VNP). Il SO focalizza la linea di fasci in arrivo che lo scanner del fascio risonante riflette sul campione, mentre l'RO raccoglie la sezione della linea VSFG dei segnali. È importante controllare con precisione la posizione dell'asse z dell'osmosi inversa con una precisione di 1 μm per garantire che il campione sia nelle migliori condizioni focali per un imaging di alta qualità. La linea collimata del segnale VSFG viene quindi diretta verso un sistema di lenti tubolari composto da 2 lenti a vasca (TL1 e TL2), formando un'immagine ingrandita nella fessura d'ingresso del monocromatore (MC). La linea di spettri risolta in frequenza viene quindi visualizzata in modo iperspettrale su un dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD). Dopo aver raccolto ogni linea iperspettrale, il campione viene scansionato nell'asse perpendicolare all'asse di scansione dello scanner a fascio risonante utilizzando il NP. Per raccogliere immagini in campo chiaro del campione, l'I2PS viene spostato nella posizione in campo chiaro e viene installato uno specchio che intercetta la sorgente di luce bianca (WLS). La luce viene quindi focalizzata dall'RO e ripresa dall'SO. Viene quindi formata un'immagine sul piano del sensore della fotocamera in campo chiaro (BC) nella parte superiore del microscopio invertito. (C) Vista dettagliata del percorso ottico attraverso l'area della lente del tubo nel MC e nel CCD. (D) Vista dettagliata dell'area del campione tra SO e RO. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Allineamento del microscopio iperspettrale e calibrazione spaziale dell'asse CCD verticale

1. Ottimizzare approssimativamente la posizione del piano del campione (asse z del nano posizionatore) utilizzando un campione standard di ZnO (1 μm di spessore) rivestito di sputtering 15 mm x 15 mm x 0,170 mm ± vetrino coprioggetto da 0,005 mm e portandolo a fuoco in campo chiaro utilizzando la modalità di imaging in campo chiaro.
   NOTA: Potrebbe essere necessario regolare la posizione z dell'RO e l'allineamento della luce bianca, se necessario. Un'immagine rappresentativa dello ZnO sul modello di vetro utilizzato per la calibrazione dell'allineamento è mostrata nella Figura 2.
2. Riportare l'I2PS sul braccio di illuminazione non lineare e ottimizzare l'altezza del campione per la massima intensità VSFG non risonante generata dalle regioni ZnO osservate sulla telecamera CCD.
   NOTA: La posizione z dell'osmosi inversa deve essere regolata per la massima intensità. Potrebbe essere necessario ripetere i passaggi 2.1 e 2.2 alcune volte prima di raggiungere l'altezza ottimale del campione e l'osmosi inversa.
3. Accendi lo scanner a fascio risonante e raccogli una linea delle immagini.
4. Raccogli immagini di intensità non risonante scansionando il campione perpendicolarmente alla direzione dello scanner del fascio. Prendi sezioni verticali dei dati dell'immagine e stabilisci il rapporto pixel:micron. (fare riferimento alla Figura 3 e alla relativa legenda).
   NOTA: La derivata di queste sezioni di linea viene analizzata per produrre il rapporto pixel:micron dell'asse verticale CCD che verrà utilizzato per le immagini future.

Figura 2: Qualità dell'immagine rappresentativa per l'allineamento approssimativo della modalità di imaging in campo chiaro di un modello ZnO. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Flusso di lavoro di calibrazione dell'asse verticale. Questa figura illustra come convertire i pixel del CCD in dimensioni spaziali verticali nell'unità di μm. (A) Viene raccolta e ricostruita un'immagine del vetrino coprioggetto con motivo ZnO. Quindi, la distanza in pixel da uno all'altro bordo del motivo (piccola barra verticale in A). Poiché la croce del modello ZnO è progettata per avere una larghezza di 25 μm, è possibile utilizzare il rapporto tra larghezza fisica e larghezza in pixel per calcolare il rapporto dimensione fisica/pixel. Un'immagine rappresentativa calibrata sull'asse verticale è mostrata in (B). (C) Infine, viene presa una fetta verticale come indicato dalla linea rossa. (D) La derivata della fetta verticale viene presa per ottenere la risoluzione spaziale. La derivata della sezione verticale viene utilizzata per ottenere la risoluzione spaziale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Raccolta di dati iperspettrali

1. Raccogliere gli spettri di una linea verticale dei segnali VSFG sul CCD, i cui spettri sono dispersi lungo l'asse orizzontale e le posizioni spaziali sono registrate sull'asse verticale del CCD.
   NOTA: In questo modo si ottiene un set di dati bidimensionale per una sezione a riga singola.
2. Dopo che la sezione della linea del campione è stata sottoposta a imaging iperspettrale, scansionare il campione nell'asse perpendicolare all'asse di scansione della linea utilizzando il nano-posizionatore tridimensionale (NP, Figura 1).
   NOTA: Il posizionatore nano 3D è importante per un'elevata precisione e riproducibilità nell'individuazione delle regioni del campione (piano x-y) e per mettere a fuoco il campione (asse z).
3. Eseguire l'iterazione tra il passaggio 3.1 e il passaggio 3.2 per raccogliere un'immagine iperspettrale VSFG.

4. Analisi dei dati iperspettrali

1. Spettrale i dati utilizzando il flusso di lavoro della libreria di imaging iperspettrale^{MatLab toolbox 41}.
   NOTA: L'unmixing spettrale correla le posizioni spaziali a spettri univoci. Il codice Matlab per l'analisi dei dati iperspettrali è fornito nel file supplementare 1.
   1. Crea un ipercubo a 4 dimensioni (x = spaziale, y = spaziale, z = intensità dipendente dalla frequenza, ω = frequenza) utilizzando la funzione ipercubo nella libreria di imaging iperspettrale^{Matlab image processing toolbox 41}.
   2. Identificare il numero di spettri univoci con la funzione countEndmembersHFC con un valore di probabilità di falso allarme (PFA) compreso tra 10 ^{e 7}.
   3. Identifica gli spettri unici utilizzando la funzione di demiscelazione spettrale di nfindr .
   4. Infine, utilizzando la funzione sid , associare ogni pixel a uno degli spettri univoci identificati nel passaggio precedente.
      NOTA: Ulteriori metodi di dismixing e matching spettrale possono essere eseguiti con funzioni/algoritmi alternativi offerti nella MatLab Hyperspectral Imaging Library⁴¹.
2. Adattare i dati di somma per ogni foglio isolato alla funzione Voigt⁴² (File supplementare 1).
   NOTA: La funzione lorentziana rappresenta il limite della forma di linea omogenea pura, mentre la funzione gaussiana ha origine da limiti disomogenei. In realtà, i sistemi potrebbero trovarsi in una combinazione di limiti omogenei e disomogenei, che richiede una funzione di Voigt - una pratica comune per la spettroscopia in fase condensata, incluso il VSFG.

5. Analisi geometrica del campione

1. Determinare la geometria dei campioni seguendo la procedura indicata nei punti 5.2-5.3. In questo studio, SDS@2 β-CD viene utilizzato come esempio. Derivare gli elementi tensoriali consentiti alla simmetria di χ⁽²⁾ in base alla simmetria C₇ della subunità molecolare del campione di mesofogli SDS@2 β-CD.
   NOTA: La simmetria consentita χ⁽²⁾ dipende dalla simmetria. Per calcolare la suscettibilità non lineare ammessa di qualsiasi simmetria, fare riferimento al riferimento⁴³.
2. Applicare la rotazione di Eulero²⁷ per mettere in relazione le misure del frame di laboratorio con il frame molecolare.
   NOTA: Nel caso di SDS@2 β-CD, la sua simmetria C₇ porta a otto equazioni indipendenti che mettono in relazione 8 uscite (lab frame χ(2)) e 8 ingressi (6 iperpolarizzabilità indipendenti β(2) e due angoli: Θ, l'angolo di inclinazione rispetto al piano campione di tutti i fogli e φ, la rotazione nel piano del foglio ⁽Figura 4⁾). Due fogli vengono utilizzati per estrarre gli allineamenti molecolari comuni dei due fogli. Le relazioni tra φ₁ e φ₂ (angolo di rotazione nel piano dei due fogli) possono essere estratte dalle immagini in campo chiaro. Nell'esempio corrente, φ₂ = φ₁ + 60°. Si assume che tutte le unità molecolari si aggiungano allo stesso angolo, quindi Θ₁ = Θ₂. Ciò si traduce in 11 incognite (9 indipendenti, di cui 6 indipendenti di iperpolarizzabilità β(2), Θ 1 e φ₁, e il rapporto di copertura relativo tra i fogli N e i due angoli dipendenti_, che sono φ 2 e Θ₂) per 16 noti ⁽8 polarizzazioni del frame di laboratorio per foglio e due fogli).
3. Mettere in relazione il frame di laboratorio χ(2) e l'iperpolarizzabilità del frame molecolare β⁽²⁾ con un risolutore di funzioni di rete neurale.
   NOTA: una sintesi dettagliata di questo approccio è disponibile nel riferimento²⁷.
   1. Crea un modello di rete neurale a più livelli in Python⁴⁴usando Keras composto da una struttura di 200-100-50 nodi e una funzione di attivazione tangente iperbolica.
   2. Creare una matrice 100000 x 11 generata in modo casuale dei valori di β(2), Θ 1, Θ 2, φ₁, φ 2 e N. Calcolare il corrispondente frame di laboratorio 16 χ(2), utilizzando l'equazione determinata in ^5.2 dalle rotazioni di Eulero.
   3. Usa i valori χ(2) calcolati (un totale di 100.000 per 16 valori) come input e impara a prevedere 11 valori (β(2), Θ 1, Θ 2, φ₁, φ 2 e N) quando vengono forniti 16 valori χ^(2).
   4. Dopo il training, usare un altro set di 1000 voci con gli input e gli output per testare il modello sottoposto a training. L'output previsto e l'output reale devono mostrare una relazione lineare con una pendenza pari a 1.
   5. Infine, fornire la χ(2) misurata sperimentalmente da due fogli (ogni foglio ha 8 χ⁽² ) misurati⁾ e utilizzare il modello addestrato per prevedere l'angolo di inclinazione Θ, insieme ad altre proprietà.

Figura 4: Illustrazione della trasformazione di Eulero. (A) Illustrazione della trasformazione di Eulero tra la suscettibilità del secondo ordine delle coordinate di laboratorio (XYZ) χ(2) e l'iperpolarizzabilità delle coordinate molecolari (xyz⁾ β_ijk. La rotazione di Eulero z-y'-z'' viene eseguita sulle coordinate molecolari, dove φ è l'angolo di rotazione nel piano, θ l'angolo di inclinazione e ψ l'angolo di torsione. ψ è integrato per angoli di torsione arbitrari attorno all'asse molecolare. φ non è integrato perché tutte le molecole ruotano ad un angolo specifico rispetto al telaio del laboratorio per formare i fogli autoassemblati. N è la copertura superficiale relativa dei due fogli. (B) Visualizzazione delle subunità inclinate che formano un foglio determinato dai risultati della rete neurale. Questa cifra è stata modificata da Wagner et ^al.27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Struttura molecolare, morfologia e orientamento potenziale di SDS@β-CD. (A) Vista dall'alto e (B) vista laterale struttura chimica di SDS@β-CD. (C) Distribuzione rappresentativa del campione eterogeneo dei fogli a mesoscala sul piano del campione. La subunità molecolare potrebbe avere diversi orientamenti e allineamenti sul substrato, che non è noto. Questa cifra è stata modificata da Wagner et al.27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La capacità del microscopio di discriminare tra strutture molecolari organizzate in modo univoco e massa isotropa è dimostrata con il campione SDS@2 β-CD23,34 (Figura 5). In questo studio, il campione è stato preparato aggiungendo β-CD e SDS all'acqua deionizzata (DI) in rapporto 2:1 fino a quando i due soluti non hanno raggiunto una concentrazione del 10% m/m. La sospensione è stata quindi riscaldata fino a diventare limpida e raffreddata a temperatura ambiente durante la notte. CuCl2 è stato aggiunto ad una concentrazione di 1:10 CuCl2:SDS per regolare le interazioni elettrostatiche e la miscela è stata lasciata riposare per 3-5 giorni affinché i meso-fogli SDS@2 β-CD si formassero completamente. Infine, i meso-fogli isolati sono stati prodotti mediante colata a goccia di 5 μL della sospensione del foglio su un vetrino coprioggetto di 15 mm x 15 mm x 0,170 mm ± 0,005 mm apposto su una spatolatrice operante a 10.000 giri/min.

I fogli a mesoscala si sono formati dal loro autoassemblaggio con una specifica simmetria C7. Tuttavia, non è chiaro l'orientamento molecolare della singola unità molecolare in questo auto-assemblaggio, una conoscenza fondamentale che può influenzare le funzioni del materiale. (Figura 5C). Sono state acquisite le immagini VSFG dei fogli autoassemblati dispersi su un vetrino coprioggetto (Figura 6A). Attraverso l'identificazione spettrale (fase 4 Analisi dei dati iperspettrali) utilizzando la funzione di imaging iperspettrale di Matlab, è stato riscontrato che tutti i fogli possono essere classificati in due tipi, uno con maggiore intensità VSFG (spettri blu nella Figura 6B e fogli etichettati in blu nella Figura 6A) e l'altro con intensità inferiore. Ispezionando e confrontando con l'immagine ottica (Figura 6C,D), il grande foglio al centro delle immagini sembrava avere fogli doppi impilati, attribuendo così la minore intensità VSFG dovuta all'interferenza distruttiva tra i due diversi fogli di orientamento. Il singolo foglio è stato focalizzato per estrarre l'orientamento delle singole unità molecolari (quelle blu nella Figura 6A). Due dei fogli (evidenziati in quadrati rossi e blu nella Figura 6A) sono stati misurati da varie polarizzazioni VSFG e gli spettri sono stati adattati utilizzando le funzioni di Voigt. Si noti che la polarizzazione VSFG è descritta nel segnale d'ordine, nella conversione verso l'alto e nel MIR. Ad esempio, SSP significa polarizzazione P dell'IR, polarizzazione S della conversione verso l'alto e polarizzazione S dei segnali.

Figura 6: Sovrapposizione di immagini VSFG risolte in polarizzazione con modalità in campo chiaro . (A) Immagine VSFG iperspettrale risolta in polarizzazione (SSS) di SDS@2 β-CD. I colori viola e rosa rappresentano le aree in cui risiedono spettri diversi e gli spettri corrispondenti sono tracciati in (B), che sono spettri rappresentativi per singoli pixel con rapporto segnale/rumore per gli spettri blu e magenta ~56 e ~26, rispettivamente. I fogli nelle caselle rosse e blu sono analizzati in modo esplicito di seguito per estrarre gli angoli di inclinazione della sopramolecola. (C) Immagine in campo chiaro della stessa area di quella di (A). (D) Immagine iperspettrale VSFG sovrapposta a un'immagine ottica di un'area identica. (E) Da sinistra a destra: spettri risolti di polarizzazione PPS, PPP, SSP e SSS sommati su 180 e 480 pixel all'interno dei due fogli singoli evidenziati nei riquadri rosso e blu in (A). Tutti gli spettri avevano una caratteristica dominante centrata a circa 2910 cm-1 e un rapporto segnale/rumore dell'ordine di 1000. Gli spettri sono stati dotati di molteplici funzioni di Voigt, rappresentate dalle aree ombreggiate, e utilizzate per ulteriori analisi di orientamento. Questa cifra è stata modificata da Wagner et al.27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Quindi, per estrarre gli orientamenti molecolari, è stata prima determinata l'iperpolarizzabilità consentita dalla simmetria, consentita dalla regola di selezione della simmetria, utilizzando la procedura43 precedentemente pubblicata. Quindi la relazione tra il sistema di riferimento del laboratorio e il sistema di riferimento molecolare è derivata dalla rotazione di Eulero27. L'angolo di inclinazione θ viene quindi estratto utilizzando il metodo della rete neurale descritto sopra e l'angolo di inclinazione è risultato essere ~23° (Figura 6).

Infine, viene mostrata la capacità dell'imaging multimodale in questa piattaforma37(Figura 7). Qui tre diversi campioni, vale a dire, SDS@2 β-CD, collagene e L-fenilalanil-L-fenilalanina (FF), vengono studiati al microscopio con modalità di imaging in campo chiaro, SHG e VSFG. Innanzitutto, tutti i campioni hanno mostrato morfologie simili in diverse modalità di imaging. Sia SHG che VSFG hanno mostrato variazioni di intensità spazialmente, che mancano nelle immagini ottiche. Poiché SHG e VSFG richiedono entrambi strutture ordinate non centrosimmetriche, la variazione dell'intensità del segnale potrebbe derivare da variazioni nell'ordinamento molecolare locale o nell'orientamento molecolare. A differenza di SHG, è possibile sintonizzare il fascio MIR di VSFG in modo che sia risonante con diversi modi vibrazionali. Nel caso qui mostrato, sono stati studiati i modi vibrazionali CHx a 3,5 μm e i modi Amid-I a 6 μm. Per FF, sono state ottenute immagini VSFG con segnali forti e uniformi, suggerendo una struttura ben ordinata e auto-assemblata per tutti i gruppi vibrazionali, in accordo con la sua natura cristallina. Al contrario, il campione di collagene ha mostrato un segnale VSFG più forte nella regione CHx rispetto alla regione Amide, indicando che i campioni sono flessibili e i loro gruppi vibrazionali hanno diversi gradi di ordine.

Figura 7: Immagini multimodali di tre diversi campioni. (A i-A iii) SDS@2 campo chiaro β-CD, SHG (polarizzazione PP) e VSFG (polarizzazione PPP) di immagini di regioni da 3,5 μm, rispettivamente. Le immagini non lineari sono sovrapposte a immagini in campo chiaro. Le strutture chimiche di SDS e 2β-CD sono mostrate nel riquadro di ai. (B i-B iv) Collagene liofilizzato in campo chiaro, SHG (polarizzazione PP), VSFG (polarizzazione PPP) rispettivamente di regioni da 3,5 μm e 6 μm. La struttura chimica del residuo trimerico proteico primario del collagene, composto da glicina, prolina e idrossiprolina, è mostrata nel riquadro di Bi. (C i-Civ) Campo chiaro FF, SHG (polarizzazione PP) e VSFG (polarizzazione PPP) rispettivamente di regioni di 3,5 μm e 6 μm. La struttura chimica delle subunità molecolari FF è mostrata nel riquadro di ci. Tutte le immagini da 6 μm vengono scattate in un ambiente con strumenti di azoto spurgato per rimuovere l'attenuazione dall'umidità dell'aria ambiente. SDS@2 β-CD non ha un'immagine VSFG a 6 μm perché non ha gruppi Amid. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Codice Matlab per l'analisi dei dati iperspettrali Fare clic qui per scaricare questo file.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.