Tecniche efficaci per l'alimentazione e la coltura ex situ di un corallo scleractiniano in cova, Pocillopora acuta

Molti ecosistemi delle barriere coralline a livello globale si stanno perdendo e degradando a causa dello stress da alte temperature causato dai cambiamenti climatici ^1,2. Lo sbiancamento dei coralli (cioè la rottura della simbiosi corallo-algale³) è stato considerato relativamente raro negli ultimi^{4 anni}, ma ora si sta verificando più frequentemente⁵, con uno sbiancamento annuale che dovrebbe verificarsi in molte regioni entro la metà o la fine del secolo ^6,7. Questo accorciamento del periodo intermedio tra gli eventi di sbiancamento può limitare la capacità di resilienza della barriera corallina⁸. Gli impatti diretti dello stress da alte temperature sulle colonie di corallo (ad esempio, danno tissutale⁹; esaurimento energetico¹⁰) sono intrinsecamente legati a impatti indiretti a livello di barriera corallina, di cui una riduzione della capacità riproduttiva/di reclutamento è di particolare interesse¹¹. Ciò ha stimolato una serie di ricerche applicate che esplorano, ad esempio, il miglioramento attivo in situ del reclutamento (ad esempio, la semina della barriera corallina¹²), nuove tecnologie per il ripristino dei coralli su larga scala¹³ e la simulazione di segnali riproduttivi per indurre la riproduzione in sistemi ex situ ¹⁴. Complementari a questi interventi attivi sono il recente riconoscimento dei vantaggi dell'alimentazione eterotrofica nei coralli sottoposti a stress ad alta temperatura¹⁵ e l'esplorazione del ruolo che la fornitura di cibo può svolgere nella riproduzione¹⁶.

È noto che l'alimentazione eterotrofica influenza le prestazioni dei coralli¹⁷ ed è stata specificamente collegata all'aumento della crescita dei coralli^18,19, nonché alla resistenza termica e alla resilienza^20,21. Tuttavia, i benefici dell'eterotrofia non sono onnipresenti tra le specie di corallo 22 e possono differire in base al tipo di cibo consumato²³, nonché al livello di esposizione alla luce²⁴. Nel contesto della riproduzione dei coralli, l'alimentazione eterotrofica ha mostrato risultati variabili, con osservazioni di capacità riproduttive superiori a²⁵ e inferiori a^{26 a} seguito dell'alimentazione eterotrofica. L'influenza dell'alimentazione eterotrofica sulla riproduzione dei coralli attraverso uno spettro di temperature è raramente valutata, ma nel corallo temperato Cladocora caespitosa, l'eterotrofia è risultata più importante per la riproduzione in condizioni di temperatura più bassa²⁷. Una migliore comprensione del ruolo della temperatura e dell'alimentazione sulla produzione riproduttiva è probabilmente necessaria per determinare se specifiche barriere coralline (ad esempio, barriere coralline associate ad un'elevata disponibilità di cibo²⁸) possiedono una maggiore capacità di reclutamento sotto il cambiamento climatico.

Analogamente alla produzione riproduttiva, l'effetto della temperatura e dell'alimentazione sui tempi riproduttivi nei coralli rimane relativamente poco studiato, nonostante la sincronizzazione della riproduzione con le condizioni abiotiche/biotiche sia una considerazione importante per il successo del reclutamento in un oceano che si sta riscaldando²⁹. È stato dimostrato che temperature più calde si traducono in una riproduzione più precoce negli studi di condizionamento termico dei coralli condotti in laboratorio³⁰, e questo è stato osservato anche nei coralli raccolti dalle barriere coralline naturali durante le stagioni³¹. Tuttavia, è interessante notare che la tendenza opposta è stata recentemente osservata nei coralli nutriti coltivati nel corso di 1 anno in un sistema di flusso ex situ (cioè, la riproduzione è avvenuta prima nel ciclo lunare a temperature invernali più fredde e più tardi nel ciclo lunare a temperature estive più calde)³². Questo risultato contrastante suggerisce che i tempi riproduttivi possono allontanarsi dai modelli tipici in condizioni associate a abbondanti risorse energetiche.

Esperimenti controllati a lungo termine in diversi scenari di temperatura potrebbero contribuire a una migliore comprensione dell'influenza dell'eterotrofia sulla riproduzione nei coralli scleractiniani. Mantenere le colonie di coralli che si riproducono in condizioni ex situ per cicli riproduttivi multipli, tuttavia, può essere difficile (ma si vedano ricerche precedenti^32,33). In questo articolo vengono descritte tecniche semplici ed efficaci per l'alimentazione attiva (fonte alimentare: naupli di Artemia) e la coltura a lungo termine di un corallo in cova (Pocillopora acuta) in un sistema di acquacoltura a flusso continuo; Tuttavia, va notato che tutte le tecniche descritte possono essere utilizzate anche nei sistemi di acquacoltura a ricircolo. Per dimostrare queste tecniche, è stato condotto un confronto preliminare della produzione riproduttiva e dei tempi delle colonie di coralli mantenute a 24 °C e 28 °C sotto trattamenti "nutriti" e "non nutriti". Queste temperature sono state scelte per approssimare le temperature dell'acqua di mare in inverno e in estate, rispettivamente, nel sud di Taiwan^30,34; Non è stata scelta una temperatura più alta perché la promozione di una coltura ex situ a lungo termine, piuttosto che testare la risposta dei coralli allo stress termico, era un obiettivo primario di questo esperimento. Inoltre, è stata quantificata la densità dei naupli di Artemia prima e dopo le sessioni di alimentazione per confrontare la fattibilità dell'alimentazione eterotrofica a entrambi i trattamenti di temperatura.

In particolare, 24 colonie di P. acuta (estensione lineare totale media ± deviazione standard: 21,3 cm ± 2,8 cm) sono state ottenute da vasche a flusso continuo presso le strutture di ricerca del Museo Nazionale di Biologia Marina e Acquario, nel sud di Taiwan. Pocillopora acuta è una specie di corallo comune che possiede sia una strategia riproduttiva di trasmissione, ma tipicamente cova^35,36. Le colonie parentali di questi coralli sono state originariamente raccolte dalla barriera corallina di Outlet (21.931°E, 120.745°N) circa 2 anni prima per un^{altro esperimento.} Di conseguenza, le colonie di corallo utilizzate nel presente esperimento sono state allevate per tutta la loro vita in condizioni di coltura ex situ; in particolare, le colonie sono state esposte a temperatura ambiente e a un ciclo luce:buio di 12 h:12 h a 250 μmol quanti m−²·s⁻¹ e sono state alimentate con naupli di Artemia due volte a settimana. Riconosciamo che questa coltura ex situ a lungo termine potrebbe aver influenzato il modo in cui le colonie hanno risposto alle condizioni di trattamento in questo esperimento. Vorremmo quindi sottolineare che l'obiettivo principale qui è quello di illustrare come le tecniche descritte possano essere efficacemente utilizzate per la coltura dei coralli ex situ, dimostrando un esempio applicato in cui sono stati valutati gli effetti della temperatura e dell'alimentazione sulla riproduzione dei coralli.

Le colonie di corallo sono state distribuite uniformemente in sei vasche di coltura del sistema a flusso continuo (lunghezza interna vasca x larghezza x altezza: 175 cm x 62 cm x 72 cm; regime di luce della vasca: 12 h:12h ciclo luce:buio a 250 μmol quanti m−²·s⁻¹) (Figura 1A). La temperatura in tre dei serbatoi è stata fissata a 28 °C e la temperatura negli altri tre serbatoi è stata fissata a 24 °C; ogni serbatoio aveva un logger che registrava la temperatura ogni 10 minuti (vedi Tabella dei Materiali). La temperatura è stata controllata in modo indipendente in ogni serbatoio utilizzando refrigeratori e riscaldatori e la circolazione dell'acqua è stata mantenuta utilizzando motori di flusso (vedere la tabella dei materiali). Metà delle colonie in ogni vasca (n = 2 colonie/vasca) sono state nutrite con naupli di Artemia due volte a settimana, mentre le altre colonie non sono state nutrite. Ogni sessione di alimentazione ha avuto una durata di 4 ore ed è stata condotta in due vasche di alimentazione indipendenti e specifiche per la temperatura. Durante l'alimentazione, tutte le colonie sono state spostate nelle vasche di alimentazione, comprese le colonie non alimentate, per standardizzare il potenziale effetto di stress dello spostamento delle colonie tra le vasche. Le colonie nei trattamenti alimentati e non alimentati sono state posizionate nel proprio compartimento utilizzando un telaio a rete all'interno delle vasche di alimentazione specifiche per la temperatura, in modo che solo le colonie in condizioni di alimentazione ricevessero cibo. La produzione riproduttiva dei coralli e i tempi sono stati valutati per ogni colonia ogni giorno alle 09:00 contando il numero di larve che erano state rilasciate nei contenitori di raccolta larvale durante la notte.

1. Colonie di corallo sospesein vasche di acquacoltura ex situ

1. Posizionare una barra dentellata (lunghezza x larghezza x altezza: 75 cm x 1 cm x 3 cm), di seguito denominata "barra sospesa", attraverso la vasca di coltura in preparazione per appendere le colonie di coralli.
   NOTA: La barra appendiabiti utilizzata in questo esperimento è stata realizzata su misura, ma un semplice tubo in PVC con viti sporgenti (cioè per fungere da tacche) sarebbe sufficiente purché possa essere posizionato in modo stabile sulla parte superiore della vasca di coltura e sia abbastanza forte da contenere i coralli.
2. Misurare un pezzo di lenza (vedere la tabella dei materiali) a ~1,5 m di lunghezza, quindi piegarlo a metà due volte.
   NOTA: La lunghezza iniziale della lenza deve essere scelta in base alla posizione finale desiderata della colonia di corallo nella vasca di coltura.
3. Fai un piccolo nodo a rovescio all'estremità della lenza piegata che ha le estremità iniziali della lenza.
   NOTA: Dopo aver fatto il nodo, dovrebbero esserci due anelli grandi nella parte inferiore e un anello piccolo nella parte superiore.
4. Posiziona la colonia di coralli al centro dei due grandi anelli in modo che gli anelli siano posizionati intorno alla colonia e possano trattenere saldamente il corallo quando è appeso nell'acqua.
5. Agganciare il piccolo anello superiore della lenza in una tacca sulla barra di sospensione (Figura 1B).

2. Alimentazione dei coralli

1. Preparazione del contenitore di alimentazione
   1. Costruisci una cornice rettangolare usando un tubo acrilico (lunghezza x larghezza x altezza: 25 cm x 60 cm x 25 cm). Realizzare due compartimenti separati nel telaio in cui possono essere collocati rispettivamente i coralli nutriti e non nutriti (Figura 1C).
      NOTA: Il tubo acrilico è stato utilizzato perché è leggero (cioè al contrario del tubo in PVC più pesante) e, quindi, potrebbe facilitare il movimento del contenitore di alimentazione dentro/fuori dalle vasche di coltura.
   2. Utilizzare una pistola per colla a caldo per far aderire 100 μm di rete di plancton al fondo e ai lati del telaio.
   3. Praticare un totale di ~10 piccoli fori (0,5 cm di diametro) nei tubi (soprattutto lungo i lati e il fondo del telaio) per evitare che il contenitore di alimentazione galleggi quando viene posizionato nella vasca di coltura.
   4. Praticare dei fori (~0,5 cm di diametro) attraverso la rete di plancton in ogni angolo del contenitore di alimentazione.
   5. Posizionare un tubo di 8 cm di lunghezza di 0,5 cm di diametro attraverso i fori angolari e utilizzare una pistola per colla a caldo per fissarlo in posizione.
      NOTA: Questi pezzi di tubo saranno collegati a una pompa ad aria e a pietre a bolle durante l'alimentazione (vedere il passaggio 2.3.2 per maggiori dettagli).
2. Coltivazione dell'artemia
   1. Raccogliere 2 litri di acqua di mare da una vasca di alimentazione indipendente e versare l'acqua di mare in un contenitore per la schiusa di Artemia (Figura 1D).
      NOTA: Nel presente esperimento utilizzato per dimostrare i protocolli, sono state utilizzate due vasche di alimentazione indipendenti specifiche per il trattamento, che hanno richiesto la preparazione di due contenitori di schiusa per la coltivazione dell'Artemia .
   2. Collegare una pompa ad aria al tubo collegato al fondo del contenitore di schiusa per circa 10 minuti prima di aggiungere le cisti di artemia .
   3. Durante l'attesa, utilizzare una bilancia per misurare 8 g di cisti di Artemia (vedi Tabella dei Materiali).
      NOTA: Per ottenere una densità media di 35 singoli naupli di Artemia/mL, come suggerito da Huang et ^al.19, utilizzare un rapporto di 4 g di cisti di Artemia per 1 L di acqua di mare.
   4. Dopo 10 minuti, versare gli 8 g di cisti di Artemia nel contenitore di schiusa.
   5. Incubare le cisti di Artemia per 48 ore.
3. Preparazione della vasca di alimentazione
   1. Posizionare il contenitore di alimentazione nel serbatoio di alimentazione in modo che la parte superiore del contenitore sia sopra la superficie dell'acqua.
   2. Collegare la parte esterna del tubo angolare del contenitore di alimentazione a una pompa ad aria, che fornirà aria alle pietre a bolle per facilitare la circolazione dell'acqua durante l'alimentazione.
   3. Accendere la pompa dell'aria ~5 minuti prima dell'inizio dell'alimentazione.
4. Arricchimento e raccolta dei naupli di Artemia
   1. Aggiungere 1,5 ml di dieta di arricchimento (vedere la tabella dei materiali) nel contenitore di schiusa 2 ore prima dell'ora di alimentazione desiderata.
      NOTA: Un rapporto di 0,75 ml di dieta di arricchimento per 1 litro di acqua di mare è raccomandato da Huang et ^al.19.
   2. Dopo 2 ore, chiudere la valvola che fornisce aria al contenitore di schiusa.
   3. Coprire il contenitore di schiusa con una scatola di cartone per escludere la luce ambientale e posizionare una fonte di luce (è sufficiente una torcia per cellulare) alla base del contenitore di schiusa per 5 minuti per attirare i naupli di Artemia sul fondo del contenitore e facilitare così la separazione dei naupli di Artemia vivi dai gusci vuoti.
   4. Dopo 5 minuti, rimuovere la scatola e la fonte di luce.
   5. Posizionare una caraffa graduata da 3 L sotto il contenitore di schiusa.
   6. Staccare il tubo dal contenitore di schiusa per consentire ai naupli di Artemia e alla soluzione di acqua di mare di fluire nel misurino; raccogliere 1 L di soluzione di naupli e acqua di mare di Artemia .
      NOTA: Raccogliere solo metà del volume nel contenitore di tratteggio per escludere i gusci vuoti indesiderati.
   7. In prossimità della vasca di alimentazione, versare i naupli di Artemia e la soluzione di acqua di mare attraverso un colino da 100 μm per separare i naupli di Artemia (che rimarranno nel filtro) dall'acqua di mare.
   8. Sciacquare due volte i naupli di Artemia tenuti all'interno del colino con l'acqua del serbatoio di alimentazione.
   9. I naupli di Artemia sono ora pronti per essere utilizzati.
5. Nutrire le colonie di coralli
   1. Scaricare i naupli di Artemia posizionando il filtro dal punto 2.4.8 nel serbatoio di alimentazione.
   2. Mescolare a mano l'acqua nel serbatoio per distribuire uniformemente i naupli di Artemia .
      NOTA: Raccogliere campioni per la quantificazione "pre-alimentazione" della densità dei naupli di Artemia dopo questa fase (vedere il passaggio 3.1 per maggiori dettagli).
   3. Sposta ogni barra sospesa (con le colonie di corallo ancora appese alla barra) dalla vasca di coltura alla vasca di alimentazione e posiziona la barra in modo che sia saldamente appoggiata sulla parte superiore della vasca di alimentazione. La durata dell'esposizione dei coralli all'aria deve essere la più breve possibile.
      NOTA: Assicurarsi che le colonie non si tocchino e che abbiano spazio sufficiente per catturare il cibo (ad esempio, ~5 cm di distanza).
   4. Spegnere le luci nei serbatoi di alimentazione o utilizzare un coperchio non ermetico per coprire il serbatoio di alimentazione per evitare disturbi leggeri durante l'alimentazione.
   5. Lasciare che le colonie si nutrano indisturbate per 4 ore.
   6. Dopo 4 ore, raccogliere i campioni per la quantificazione "post-alimentazione" della densità dei naupli di Artemia (vedere il punto 3.1 per maggiori dettagli).
6. Pulizia post-alimentazione
   1. Al termine della sessione di alimentazione, rimuovere le colonie di corallo. Estrarre singolarmente le barre sospese dalla vasca di alimentazione e sciacquare accuratamente ogni corallo con acqua di mare dalla rispettiva vasca di coltura per rimuovere eventuali naupli residui di Artemia .
      NOTA: Sciacquare le colonie su una superficie stabile piuttosto che appese per ridurre il rischio di danni che potrebbero verificarsi se le colonie dovessero oscillare avanti e indietro durante il risciacquo. Come per il trasferimento iniziale, mantieni la durata per la quale i coralli sono esposti all'aria il più breve possibile.
   2. Rimetti le barre sospese (con i coralli appesi) nelle vasche di coltura.
   3. Staccare i tubi che collegano il contenitore di alimentazione alla pompa dell'aria e rimuovere il contenitore di alimentazione dal serbatoio di alimentazione.
   4. Sciacquare accuratamente il contenitore di alimentazione con acqua dolce per rimuovere tutti i naupli di Artemia rimanenti.

3. Quantificazione della densità dei naupli di Artemia prima e dopo l'alimentazione

1. Raccolta dei campioni
   1. Raccogliere i campioni in due momenti: in primo luogo, quando i naupli di Artemia sono stati scaricati e distribuiti uniformemente nel contenitore di alimentazione (passaggio 2.5.2) e di nuovo dopo che la sessione di alimentazione è stata completata (passaggio 2.5.6).
   2. Per ogni punto temporale, utilizzare tre siringhe per prelevare 20 ml di acqua rispettivamente dalla superficie, dallo strato intermedio e dallo strato inferiore del contenitore di alimentazione.
2. Diluizione del campione
   1. Per ogni siringa, trasferire i 20 mL di campione d'acqua in un becher indipendente da 500 mL.
   2. Aggiungere 180 mL di acqua calda (~60 °C) nel becher (diluizione 1:10).
      NOTA: L'acqua calda viene utilizzata per immobilizzare i naupli di Artemia per aumentare l'accuratezza dell'enumerazione.
   3. Aggiungere 2 ml del campione d'acqua dal becher in ciascun pozzetto di una piastra a 9 pozzetti.
      NOTA: Mescolare il campione nel becher per distribuire uniformemente i naupli di Artemia nella colonna d'acqua prima di prelevare i 2 ml di campione.
   4. Contare il numero di naupli di Artemia in ciascun pozzetto sotto uno stereomicroscopio utilizzando un ingrandimento 6,5x (vedere la tabella dei materiali).
3. Calcolo della densità dei naupli di Artemia
   1. Dividere il numero di naupli di Artemia in ciascun pozzetto per 2 per ottenere il numero di naupli di Artemia per ml. Quindi, moltiplica quel numero per 10 (per tenere conto della diluizione) per calcolare la densità dei naupli di Artemia .
   2. Calcolare la densità media dei naupli di Artemia (cioè la densità media tra le repliche dei 27 pozzetti prima e dopo l'alimentazione) per confrontare la densità dei naupli di Artemia tra pre e post-alimentazione.

4. Raccolta delle larve di corallo

1. Realizzazione del contenitore per la raccolta delle larve (Figura 1E)
   1. Scegli una bottiglia d'acqua di plastica da 6 L e taglia completamente il fondo della bottiglia.
      NOTA: Questa apertura verrà utilizzata per trasferire le colonie dentro e fuori dal contenitore di raccolta delle larve.
   2. Crea due finestre ritagliando un rettangolo di ~15 cm x 20 cm da ciascun lato della bottiglia.
      NOTA: Una bottiglia d'acqua in plastica da 6 L è adatta per coralli di ~15 cm di diametro; Modificare la dimensione della bottiglia in base alla dimensione dei coralli studiati.
   3. Utilizzare una pistola per colla a caldo e poi resina epossidica per far aderire una rete di plancton da 100 μm su ciascuna delle finestre.
   4. Crea due piccoli fori (~0,5 cm di diametro) su ciascun lato del fondo della bottiglia.
   5. Metti uno spago attraverso i due piccoli fori e lega entrambe le estremità per creare una maniglia per agganciare il contenitore di raccolta delle larve alla barra appendiabiti.
   6. Prima dell'uso iniziale, posizionare i flaconi in una vasca a flusso continuo (senza coralli) per almeno 24 ore per rimuovere eventuali residui di colla.
2. Preparazione per la raccolta dei coralli
   1. Immergere completamente il contenitore di raccolta delle larve nella vasca di coltura.
   2. Posizionare la colonia nel contenitore di raccolta delle larve mantenendo sia la colonia che il contenitore immersi nell'acqua.
   3. Agganciare la maniglia del contenitore per la raccolta delle larve alla barra appendiabiti.
      NOTA: Dopo averlo appeso, assicurarsi che la parte superiore del contenitore di raccolta sia ~3 cm sopra l'acqua.
   4. Ripetere i passaggi da 4.2.1 a 4.2.3 fino a quando tutte le colonie sono nei loro contenitori di raccolta delle larve.
3. Raccolta ed enumerazione delle larve di corallo
   1. Preparare un misurino da 3 litri, una ciotola, una pipetta da 3 ml e provette da 50 ml.
   2. Sganciare la lenza dalla barra sospesa e rimuovere una colonia dal contenitore di raccolta delle larve. Rimetti immediatamente la colonia nella vasca di coltura.
      NOTA: Assicurarsi che la durata dell'esposizione all'aria sia la più breve possibile.
   3. Posizionare una mano sull'estremità del tappo del contenitore di raccolta delle larve.
      NOTA: Quando il contenitore di raccolta delle larve è pieno d'acqua, può essere pesante. Senza un supporto adeguato, il contenitore può rompersi quando viene rimosso dall'acqua.
   4. Sganciare la "maniglia" del contenitore di raccolta delle larve dalla barra appendiabiti.
   5. Sollevare lentamente il contenitore di raccolta delle larve dall'acqua.
   6. Tenere il contenitore di raccolta con un angolo di circa 45° sopra il serbatoio di coltura per alcuni secondi per consentire all'acqua in eccesso di rifluire nel serbatoio attraverso le finestre del contenitore di raccolta delle larve.
      NOTA: Non inclinare il contenitore oltre i 45° per mitigare la possibilità di fuoriuscire larve dalla parte superiore del contenitore.
   7. Rimuovere il contenitore di raccolta delle larve dal serbatoio e posizionarlo sopra la caraffa graduata.
   8. Prima di svitare il tappo, utilizzare un dito per applicare una moderata pressione contro il tappo, quindi svitare il tappo.
      NOTA: L'acqua all'interno del contenitore di raccolta può essere rilasciata rapidamente quando il tappo viene rimosso se non viene prima sostenuto da un dito (ad esempio, con conseguente potenziale perdita di larve).
   9. Trasferisci un po' d'acqua all'interno della caraffa graduata in una ciotola.
   10. Contare manualmente il numero di larve nella ciotola utilizzando una pipetta da 3 ml per spostare le larve in una provetta da 50 ml.
       NOTA: Tenere presente che alcune larve potrebbero rimanere bloccate all'interno della pipetta. In tal caso, aspirare un po' di acqua di mare nella pipetta e agitare delicatamente sigillando la pipetta con un dito per sciogliere le larve.
   11. Continuare i passaggi 4.3.9 e 4.3.10 fino a contare tutte le larve. In questa fase, le larve possono essere utilizzate in esperimenti successivi.
   12. Ripetere i passaggi 4.3.2-4.3.10 per tutte le altre colonie di corallo.
       NOTA: Il misurino e la ciotola devono essere risciacquati tra una colonia e l'altra.
   13. Al termine del conteggio, sciacquare accuratamente ogni contenitore di raccolta con acqua dolce, in particolare le finestre.

I protocolli descritti hanno permesso (1) il confronto della produzione riproduttiva e dei tempi delle singole colonie di coralli tra diversi trattamenti di alimentazione e temperatura e (2) una valutazione della fattibilità dell'alimentazione dei naupli di Artemia a diverse temperature. Di seguito, viene fornita una breve panoramica dei risultati, ma è necessario prestare attenzione per quanto riguarda l'interpretazione estensiva degli effetti riportati della temperatura e dell'alimentazione sulla riproduzione dei coralli a causa della natura a breve termine di questo esperimento (cioè, un solo ciclo riproduttivo) e dell'uso di colonie di coralli acclimatate a condizioni ex situ .

Ogni colonia si è riprodotta nel corso del nostro periodo di monitoraggio (settembre lunare 2022) e la produzione riproduttiva mensile totale ha mostrato un'elevata variazione tra le colonie. Il numero totale di larve rilasciate dalle colonie variava da 6 a 319, ad eccezione di una colonia (nel trattamento non nutrito a 24 °C) che ha prodotto 528 larve; i dati per tutte le colonie sono mostrati nella Figura 2, ma la colonia anomala ad alta produzione non è stata inclusa nell'analisi dei dati. La produzione riproduttiva è stata influenzata dalla temperatura (modello lineare generalizzato a effetti misti; z = 5,35, p < 0,001) e dall'alimentazione (z = 3,01, p < 0,003), con una significativa interazione riscontrata tra la temperatura e i trattamenti di alimentazione (z = 12,22, p < 0,001). Le colonie coltivate a 28 °C hanno rilasciato più larve quando non sono state nutrite (media ± deviazione standard; 151 ± 82) rispetto a quando sono state alimentate (131 ± 133) (modello lineare generalizzato a effetti misti, contrasto post hoc; z = 3,01, p = 0,014), ma la tendenza opposta è stata riscontrata nelle colonie coltivate a 24 °C, per cui le colonie alimentate (80 ± 78) hanno prodotto più larve rispetto alle colonie non nutrite (12 ± 6) (z = 11,91, p < 0,001).

La riproduzione in tutte le colonie avveniva prima della luna piena (giorno lunare 15) (Figura 3). Il giorno lunare medio (MLD) di rilascio larvale (ponderato in base alla produzione riproduttiva) variava dal giorno lunare 6,5 al giorno lunare 11,1, con una differenza significativa tra i trattamenti rilevata solo tra le colonie "non nutrite a 28 °C", che si riproducevano all'inizio del ciclo lunare, e le colonie "alimentate a 24 °C", che si riproducevano più tardi nel ciclo lunare (modello lineare a effetti misti, Contrasto post hoc, t = 4,10, p = 0,006).

Nel mese precedente al monitoraggio formale della riproduzione (agosto lunare 2022), la densità dei naupli di Artemia è stata valutata prima e dopo le sessioni di alimentazione; questo è stato ripetuto in tre momenti: all'inizio della coltura del corallo per questo esperimento (T0) e 2 settimane e 4 settimane nella coltura del corallo in condizioni di trattamento (Figura 4). La valutazione iniziale a T0 non ha mostrato alcuna differenza tra la densità pre e post-alimentazione dei naupli di Artemia in entrambi i trattamenti di temperatura. Dopo 2 settimane e 4 settimane di coltura, la densità dei naupli di Artemia era inferiore dopo l'alimentazione in entrambi i trattamenti termici (settimana 2: ANOVA a due vie, F 1.104 = 128,45, p < 0,001; settimana 4: ANOVA a due vie, F1.104 = 294,71, p < 0,001). Non c'è stata alcuna differenza nella densità di pre-alimentazione tra i trattamenti di temperatura (p > 0,05) o nella densità di post-alimentazione tra i trattamenti di temperatura (p > 0,05) in nessuno dei tre punti temporali valutati.

Tutte le analisi sono state condotte in R utilizzando i pacchetti lme437, lmerTest 38, emmeans39, car 40 e Hmisc41. I dati e lo script R usati per le analisi sono disponibili pubblicamente su GitHub (https://github.com/CJ-McRae/Lam-et-al_JoVE-submission).

Figura 1: Schema del disegno sperimentale e dei materiali rappresentativi per l'alimentazione e la coltura ex situ di un corallo scleractiniano in cova. (A) Le colonie di Pocillopora acuta sono state coltivate in vasche di acquacoltura a flusso continuo a 24 °C o 28 °C in condizioni di alimentazione e non alimentazione; I cerchi neri rappresentano le colonie. (B) Le colonie sono state appese con lenze da pesca per ridurre lo stress da manipolazione e per promuovere un movimento efficiente tra la coltura e le vasche di alimentazione. (C) Durante le sessioni di alimentazione, tutte le colonie sono state spostate in un telaio a maglie all'interno di vasche di alimentazione specifiche per la temperatura. Le colonie alimentate sono state posizionate in un compartimento del telaio, mentre le colonie non alimentate sono state posizionate nell'altro compartimento del telaio; Solo le colonie nutrite ricevevano cibo. (D) I naupli di Artemia arricchita sono stati somministrati alle colonie in trattamento alimentare due volte a settimana. (E) Le colonie sono state messe in contenitori per la raccolta delle larve durante la notte per quantificare la produzione riproduttiva giornaliera nel corso di un ciclo lunare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Produzione riproduttiva delle colonie di Pocillopora acuta a diverse temperature (24 °C vs. 28 °C) e trattamenti di alimentazione (fed vs. non fused). Le lettere sono rappresentative di differenze significative nella produzione riproduttiva tra i trattamenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Tempi riproduttivi delle colonie di Pocillopora acuta a diverse temperature (24 °C vs. 28 °C) e trattamenti di alimentazione (fed vs. non fused). La linea tratteggiata verticale mostra il giorno lunare medio (MLD) di riproduzione per ogni trattamento. Le tonalità di colore all'interno di ciascuna barra degli appezzamenti specifici per il trattamento (A-D) indicano il contributo delle singole colonie alla riproduzione totale giornaliera. Le lettere sono rappresentative di differenze significative nei tempi riproduttivi tra i trattamenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Densità dei naupli di Artemia prima e dopo le sessioni di alimentazione dei coralli all'interno dei trattamenti di temperatura di 24 °C e 28 °C. La densità di pre-alimentazione è stata calcolata prima dell'alimentazione dei coralli e la densità di post-alimentazione è stata calcolata dopo il completamento di una sessione di alimentazione dei coralli di 4 ore. La densità dei naupli di Artemia è stata valutata all'inizio della coltura del corallo (T0) e poi dopo 2 settimane e 4 settimane in condizioni di trattamento in un sistema di acquacoltura a flusso continuo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.