Attività adiuvante del Mycobacterium paratuberculosis nel migliorare l'immunogenicità degli autoantigeni durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo alternativo per indurre attivamente l'encefalomielite autoimmune sperimentale in topi C57BL / 6, utilizzando l'epitopo immunogenico mielinico oligodendrocitario glicoproteina (MOG) _35-55 sospeso in adiuvante di Freund incompleto contenente la sottospecie di Mycobacterium avium uccisa dal calore paratuberculosis.

Abstract

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) indotta dalla glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG) richiede l'immunizzazione con un peptide MOG emulsionato in adiuvante completo di Freund (CFA) contenente Mycobacterium tuberculosis inattivato. I componenti antigenici del micobatterio attivano le cellule dendritiche per stimolare le cellule T a produrre citochine che promuovono la risposta Th1 attraverso i recettori toll-like. Pertanto, la quantità e la specie di micobatteri presenti durante la sfida antigenica sono direttamente correlate allo sviluppo di EAE. Questo documento sui metodi presenta un protocollo alternativo per indurre EAE in topi C57BL / 6 utilizzando un adiuvante di Freund incompleto modificato contenente il ceppo K-10 della sottospecie di Mycobacterium avium paratuberculosis ucciso dal calore.

M. paratuberculosis, un membro del complesso Mycobacterium avium, è l'agente eziologico della malattia di Johne nei ruminanti ed è stato identificato come un fattore di rischio per diverse malattie umane mediate da cellule T, tra cui la sclerosi multipla. Nel complesso, i topi immunizzati con Mycobacterium paratuberculosis hanno mostrato un esordio precoce e una maggiore gravità della malattia rispetto ai topi immunizzati con CFA contenenti il ceppo di M. tuberculosis H37Ra alle stesse dosi di 4 mg/ml. I determinanti antigenici del ceppo K-10 della sottospecie di Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) sono stati in grado di indurre una forte risposta cellulare Th1 durante la fase effettrice, caratterizzata da un numero significativamente più elevato di linfociti T (CD4+ CD27+), cellule dendritiche (CD11c+ I-A/I-E+) e monociti (CD11b+ CD115⁺) nella milza rispetto ai topi immunizzati con CFA. Inoltre, la risposta proliferativa delle cellule T al peptide MOG sembrava essere più alta nei topi immunizzati con M. paratubercolosi. L'uso di un encefalogeno (ad esempio, MOG_35-55) emulsionato in un adiuvante contenente M. paratuberculosis nella formulazione può essere un metodo alternativo e convalidato per attivare le cellule dendritiche per l'innesco delle cellule T CD4⁺ specifiche dell'epitopo mielinico durante la fase di induzione dell'EAE.

Introduzione

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello comune per lo studio dei disturbi demielinizzanti umani¹. Esistono diversi modelli di EAE: immunizzazione attiva utilizzando diversi peptidi di mielina in combinazione con potenti adiuvanti, immunizzazione passiva mediante trasferimento in vitro di linfociti CD4⁺ specifici della mielina e modelli transgenici di^{EAE 2} spontanei. Ognuno di questi modelli ha caratteristiche specifiche che consentono di studiare diversi aspetti dell'EAE, come l'insorgenza, la fase effettrice o la fase cronica. Il modello di glicoproteina oligodendrocitaria mielin....

Protocollo

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Juntendo University School of Medicine (numero di approvazione 290238) e sono stati condotti in conformità con le linee guida del National Institutes of Health per la sperimentazione animale.

1. Osservazioni generali sull'esperimento

1. Ospitare i topi in gabbie individuali nella struttura per animali in condizioni controllate e prive di agenti patogeni a 23 °C ± 2 °C con 50% ± 10% di umidità e un ciclo luce/buio di 12 ore con accesso ad libitum a cibo e acqua.
2. Iniettare i topi con....

Risultati

Gruppi di topi C57BL/6 (totale n = 15/gruppo) sono stati immunizzati con MOG_35-55 in un'emulsione contenente M. paratubercolosi o con il metodo comune con CFA. Tutti i gruppi di topi hanno manifestato una malattia monofasica acuta caratterizzata da un singolo picco di disabilità osservato a 14-17 giorni, seguito da un parziale recupero dei sintomi nei successivi 10 giorni (Figura 1A). I topi immunizzati con l'adiuvante contenente M. pa.......

Discussione

Abbiamo dimostrato un robusto protocollo alternativo per indurre attivamente EAE grave in topi C57BL / 6J utilizzando il peptide MOG_35-55 emulsionato in un adiuvante contenente M. paratuberculosis¹⁰. L'induzione di EAE con questo metodo ha provocato una malattia più grave di quella indotta dal protocollo comune con CFA. Questa differenza potrebbe essere dovuta alle diverse componenti lipidiche nella parete cellulare dei micobatteri¹¹. Infatti, a differen.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
anticorpo CD115 anti-topo	Biolegend, USA	135505	per citofluorimetria Anticorpo CD11b anti-topo 1:1.000
	Biolegend, USA	101215	per citofluorimetria Anticorpo CD11c anti-topo 1:1.000
	Biolegend, USA	117313	per citofluorimetria
Anticorpo CD16/32  Anti-topo	Biolegend, USA	101302	per citofluorimetria 1:1.000
anticorpo CD4  di topo	Biolegend, USA	116004	per citofluorimetria
anticorpo CD8a	Biolegend, USA	100753	per citofluorimetria 1:1.000
anticorpo I-A/I-E di topo	Biolegend, USA	107635	per citofluorimetria 1:1.000
anticorpo Ly-6C  di topo	Biolegend, USA	128023	per citofluorimetria 1:1.000
BBL Middlebrook OADC Enrichment	Thermo Fisher Scientific, USA	BD 211886	per l'isolamento e la coltivazione di
micobatteri C57BL/6J topi	Charles River Laboratory, Giappone		3 settimane di età, maschio e femmina
FBS 10279-106	Gibco Life Techologies, USA	42F9155K	per coltura cellulare, caldo a 37 ° gradi; C prima dell'uso
Macchina per liofilizzazione	Eyela, Tokyo, Giappone	FDU-1200	per liofilizzazione batterica
incompleta e Freund' s adiuvante	Difco Laboratories, MD, USA	263810	per l'uso in adiuvante
Middlebrook 7H9 Brodo	Difco Laboratories, MD, USA	90003-876	aiuta nella crescita di micobatteri
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10	ATCC, USA	BAA-968	batteri di origine bovina
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, essiccato	BD Biosciences, USA	743-26880-EA	per l'uso in adiuvante
Micobactina J	Allied Laboratory, MO, USA		promotore della crescita
Mielina Oligodendrocita Glicolipide (MOG) 35-55	AnaSpec, USA	AS-60130-10	peptide encefalotigenico
Ovoalbumina (257-264)	Sigma-Aldrich, USA	Antigene di controllo negativo	S7951-1MG
soluzione di tossina della pertosse	Fujifilm Wako, Osaka Giappone	168-22471	Da batteri gram-negativi Bordetella pertussi, aumenta la permeabilità della barriera emato-encefalica
Omogeneizzatore Polytron PT 3100	Cinematica		per miscelare l'antigene con l'adiuvante
RPMI 1640 con L-glutammina	Gibco Life Techologies, USA	11875093	Per colture cellulari
Timidina, [Metil-3H], in etanolo al 2%, 1 mCi	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	NET027W001MC	per il saggio di proliferazione, l'uso (1 μ Kit
vitalità riparabile NIR Zombie	Biolegend, USA	423105	per citofluorimetria, per vitalità cellulare

1:1.000 1:1.000 di topo per test proliferativo di