Profilazione genetica e screening dell'abbandono su scala genomica per identificare bersagli terapeutici in modelli murini di tumore maligno della guaina nervosa periferica

Summary

Abbiamo sviluppato un approccio oncogenomico comparativo cross-species utilizzando analisi genomiche e screening genomici funzionali per identificare e confrontare bersagli terapeutici nei tumori che insorgono in modelli murini geneticamente modificati e il corrispondente tipo di tumore umano.

Abstract

I tumori maligni della guaina dei nervi periferici (MPNST) derivano dalle cellule di Schwann o dai loro precursori. Nei pazienti con sindrome da suscettibilità tumorale neurofibromatosi di tipo 1 (NF1), le MPNST sono la neoplasia maligna più comune e la principale causa di morte. Questi sarcomi dei tessuti molli, rari e aggressivi, offrono un futuro difficile, con tassi di sopravvivenza libera da malattia a 5 anni del 34-60%. Le opzioni terapeutiche per gli individui affetti da MPNST sono deludentemente limitate, con la chirurgia deturpante che è l'opzione di trattamento principale. Molte terapie un tempo promettenti come il tipifarnib, un inibitore della segnalazione Ras, hanno fallito clinicamente. Allo stesso modo, anche gli studi clinici di fase II con erlotinib, che ha come bersaglio il fattore di crescita epidermico (EFGR), e sorafenib, che ha come bersaglio il recettore del fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF), il recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) e Raf, in combinazione con la chemioterapia standard, non sono riusciti a produrre una risposta nei pazienti.

Negli ultimi anni, i metodi di screening genomico funzionale combinati con la profilazione genetica delle linee cellulari tumorali si sono dimostrati utili per identificare le vie di segnalazione citoplasmatiche essenziali e lo sviluppo di terapie specifiche per il bersaglio. Nel caso di tipi di tumori rari, una variante di questo approccio, nota come oncogenomica comparativa cross-species, viene sempre più utilizzata per identificare nuovi bersagli terapeutici. Nell'oncogenomica comparativa interspecie, la profilazione genetica e la genomica funzionale vengono eseguite in modelli murini geneticamente modificati (GEM) e i risultati vengono quindi convalidati nei rari campioni umani e nelle linee cellulari disponibili.

Questo articolo descrive come identificare le mutazioni del gene driver candidato nelle cellule MPNST umane e murine utilizzando il sequenziamento dell'intero esoma (WES). Descriviamo quindi come eseguire screening shRNA su scala genomica per identificare e confrontare le vie di segnalazione critiche nelle cellule MPNST di topo e umane e identificare bersagli farmacologici in queste vie. Queste metodologie forniscono un approccio efficace per identificare nuovi bersagli terapeutici in una varietà di tipi di cancro umano.

Introduction

I tumori maligni della guaina dei nervi periferici (MPNST) sono neoplasie a cellule fusiformi altamente aggressive che insorgono in associazione con la sindrome da suscettibilità tumorale neurofibromatosi di tipo 1 (NF1), sporadicamente nella popolazione generale e nei siti di precedente radioterapia ^1,2,3. I pazienti affetti da NF1 nascono con una copia wild-type del gene oncosoppressore NF1 e un secondo allele NF1 con una mutazione con perdita di funzione. Questo stato di aploinsufficienza rende i pazienti affetti da NF1 suscettibili a una seconda mutazion....

Protocol

Prima dell'inizio degli studi, le procedure e i protocolli per la manipolazione dei vettori virali devono essere esaminati e approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) e dal Comitato istituzionale per la biosicurezza (IBC). Le procedure qui descritte sono state approvate dai consigli IACUC e IBC dell'Università di Medicina della Carolina del Sud e sono state eseguite da personale adeguatamente addestrato in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e le linee guida istituzionali per la cura degli animali del MUSC.

1. Analisi WES-SEQ e identificazione di varianti pa....

Results

I grafici della Figura 5 mostrano i punteggi di deplezione dei geni essenziali fondamentali (GEM) etichettati come TRUE rispetto ai non-CEG (etichettati come FALSE) in ciascuna linea cellulare umana sottoposta a screening. I punti rappresentano log2 dei punteggi di deplezione della piega per i singoli geni, che sono tracciati su una rappresentazione boxplot della distribuzione complessiva del punteggio. Il test t di Student è stato utilizzato per verificare una differenza significat.......

Discussion

I metodi dettagliati qui presentati sono stati sviluppati per studiare la neoplasia del sistema nervoso periferico e la patogenesi della MPNST. Sebbene abbiamo riscontrato l'efficacia di questi metodi, è necessario riconoscere che esistono alcune potenziali limitazioni ai metodi descritti in questa sede. Di seguito, discutiamo alcune di queste limitazioni e le potenziali strategie per superarle in altri sistemi modello.

Abbiamo scoperto che il sequenziamento dell'intero esoma identifica effica.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema di sonicazione Bioruptor	Diagenode	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, San Diego, CA N	/A
Celigo Citometro a immagini	Nexcelom	N/A
Cellecta Analizzatore di codici a barre e software
Citrisolve Hybrid	Decon Laboratories	5989-27-5
Micropiastra nera Corning a 96 pozzetti	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml tubi conici	Diagenode
dNTP miscela	Clontech	639210
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Tampone di eluizione	Qiagen	19086
Etanolo (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Excel	Microsoft
FWDGEX 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3'
FWDHTS 5'-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3'
GexSeqS (5' AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3'
Prisma GraphPad	HPLC Dotmatics
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, San Diego, CA	N/A
Paraformaldeide (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS Reagente di trasfezione	Thermo Scientific	11514015
Reagente di trasfezione in polibrene	Millipore Sigma	TR1003G
Kit di purificazione PCR rapida PureLink	Invitrogen	K310001
Qiagen Buffer P1	Qiagen	19051
Kit di estrazione del gel Qiagen	Qiagen	28704
RevGEX 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3'
RevHTS1 5'-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3'
Titanio Taq polimerasi	Clontech	639210
Software Trimmomatic		www.usadellab.org