Saggio dell'unità formante microcolonie per la valutazione dell'efficacia dei vaccini contro la tubercolosi

Sommario

La determinazione delle unità formanti colonie (CFU) è la tecnica gold standard per quantificare i batteri, tra cui il Mycobacterium tuberculosis che può richiedere settimane per formare colonie visibili. Qui descriviamo un micro-CFU per la determinazione di CFU con una maggiore efficienza temporale, una riduzione dello spazio di laboratorio e del costo dei reagenti e la scalabilità per esperimenti a media e alta produttività.

Abstract

La tubercolosi (TB), la principale causa di morte in tutto il mondo per un agente infettivo, ha ucciso 1,6 milioni di persone nel 2022, superata solo dal COVID-19 durante la pandemia 2019-2021. La malattia è causata dal batterio Mycobacterium tuberculosis (M.tb). Il ceppo di Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), l'unico vaccino contro la tubercolosi, è il più antico vaccino autorizzato al mondo, ancora in uso. Attualmente, ci sono 12 vaccini in fase di sperimentazione clinica e dozzine di vaccini in fase di sviluppo preclinico. Il metodo di scelta utilizzato per valutare l'efficacia dei vaccini contro la tubercolosi negli studi preclinici è l'enumerazione delle colonie batteriche mediante il test delle unità formanti colonie (CFU). Questo test richiede dalle 4 alle 6 settimane per essere concluso, richiede un notevole spazio in laboratorio e nell'incubatore, ha costi elevati per i reagenti ed è soggetto a contaminazione. Qui descriviamo un metodo ottimizzato per l'enumerazione delle colonie, il micro-CFU (mCFU), che offre una soluzione semplice e rapida per analizzare i risultati dell'efficacia del vaccino contro la tubercolosi . Il test mCFU richiede un numero dieci volte inferiore di reagenti, riduce di tre volte il periodo di incubazione, impiegando da 1 a 2 settimane per concludersi, riduce lo spazio di laboratorio e il costo dei reagenti e riduce al minimo i rischi per la salute e la sicurezza associati al lavoro con un gran numero di M.tb. Inoltre, per valutare l'efficacia di un vaccino contro la tubercolosi, è possibile ottenere campioni da una varietà di fonti, compresi tessuti di animali vaccinati infettati da micobatteri. Descriviamo anche un metodo ottimizzato per produrre una coltura micobatterica unicellulare, uniforme e di alta qualità per gli studi sulle infezioni. Infine, proponiamo che questi metodi siano universalmente adottati per gli studi preclinici sulla determinazione dell'efficacia dei vaccini, portando in ultima analisi a una riduzione dei tempi di sviluppo dei vaccini contro la tubercolosi.

Introduzione

La tubercolosi (TBC) è la principale causa di morte in tutto il mondo a causa di un singolo agente infettivo, il batterio Mycobacterium tuberculosis (M.tb), che uccide più persone di qualsiasi altro agente patogeno. Nel 2021, la tubercolosi è stata responsabile di 1,6 milioni di decessi ed è stata superata dalla COVID-19 durante la pandemia 2019-2021¹. Inoltre, secondo il rapporto globale sulla tubercolosi del 2022 dell'Organizzazione Mondiale della Sanità, la pandemia di COVID-19 è stata responsabile di un aumento dei nuovi casi di tubercolosi. L'OMS segnala anche un forte calo del numero di persone a cui è stata diagnosticat....

Protocollo

NOTA: Il protocollo qui descritto è per BCG ma può essere applicato a qualsiasi Micobatterio. Il BCG può essere utilizzato come batterio surrogato per gli esperimenti sulla tubercolosi quando le strutture BSL3 non sono disponibili²². Le seguenti procedure che utilizzano BCG devono essere eseguite in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 (BSL2) e seguire le linee guida di biosicurezza appropriate e le buone pratiche di laboratorio per la manipolazione di microrganismi del gruppo di pericolo 2.

1. Preparazione dei terreni di coltura

1. Preparare il brodo Middlebrook 7H9 integrato con il 10....

Risultati

Il test mCFU qui descritto aumenta la quantità di informazioni che possono essere recuperate da una singola capsula di Petri ad almeno 96 volte. La Figura 5 illustra un confronto tra due metodi di somministrazione del farmaco per l'uso riproposto di saquinavir (SQV)^31,32 come farmaco diretto all'ospite per il trattamento della tubercolosi. In questo test, quattro diversi ceppi di Mycobacterium tuberculosis sono stati utilizz.......

Discussione

La tubercolosi è un importante problema di salute pubblica con un'importanza crescente, in particolare nei paesi a basso e medio reddito. L'interruzione delle strutture sanitarie per la diagnosi e il trattamento della tubercolosi durante la pandemia di COVID-19 ha causato un impatto negativo sull'incidenza di nuovi casi¹. Inoltre, i ceppi di M.tb multi-farmaco ed estensivamente resistenti ai farmaci e la co-infezione di M.tb e HIV devono essere affrontati con urgenza per controll.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre a 96 pozzetti	VWR	734-2781
DSLR 15-55 mm	obiettivo Nikon	AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR fotocamera Nikon		D3400
DSLR macro	obiettivo macro Sigma	MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Siero di vitello fetale	Gibco	10270106
Fiji		Softwarehttps://fiji.sc/	Fiji è un software open source supportato da diversi laboratori, istituzioni e individui. Tutti i plugin necessari sono inclusi.
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	18896
L-glutammina	Gibco	25030-081
Middlebrook 7H10	BD	262710
Middlebrook 7H9	BD	271310
Pipetta multicanale (0,5 - 10 µ l)	Gilson	FA10013
Pipetta multicanale (20 - 200 &; micro; l)	Gilson	FA10011
Mycobacterium bovis BCG	Collezione di colture di tipo americano	ATCC35734	ceppo TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC arricchimento	BD	211886
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	NZYTech	MB25201
RPMI 1640 medio	Gibco	21875091
Piruvato di sodio	Gibco	11360-070
Spettrofotometro UV-6300PC	VWR	634-6041
Piastra di Petri quadrata 120 x 120 mm	Corning	BP124-05
Tyloxapol	Sigma-Aldrich	T8761
Bagno a ultrasuoni Elma P 30 H	VWR	142-0051