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Articolo metodologico

Delineare il fenotipo metabolico delle cellule renali derivate dalla biopsia

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DOI:

10.3791/65457

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17 giugno 2025

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1Soham and Shaila Ajmera Family Transplant Centre, University Health Network, 2Division of Nephrology, The Hospital for Sick Children, 3Division of General Surgery, University Health Network, 4Institute of Medical Science, University of Toronto, 5Program in Cell Biology, The Hospital for Sick Children Research Institute, 6Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 7Division of Nephrology, Tallaght University Hospital, 8Trinity Kidney Centre, Trinity College Dublin, 9Department of Immunology, University of Toronto, 10Division of Nephrology, McMaster University and St. Joseph's Healthcare, 11Division of Nephrology, Department of Medicine, University Health Network, 12Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo unico per condurre la profilazione metabolica delle cellule renali derivate dalla biopsia. L'approccio presentato è stato ottimizzato in suini maschi adulti sani e ha il potenziale per migliorare la valutazione in tempo reale della vitalità dell'allotrapianto renale. Questo metodo può anche aiutare a scoprire nuove biologie in più malattie renali basate sul metabolismo.

Abstract

Il trapianto di rene è il trattamento ottimale per la malattia renale allo stadio terminale; Tuttavia, i reni trapiantati vengono spesso persi prematuramente, con una perdita del trapianto fino al 50% a 10 anni dal trapianto. Una delle principali cause di perdita prematura del trapianto è la lesione subita dal trapianto al momento del trapianto, nota come danno da ischemia-riperfusione (IRI). La funzione ritardata del trapianto (DGF), definita come la necessità di dialisi nella prima settimana dopo il trapianto, è una manifestazione di IRI grave che mostra caratteristiche funzionali e istologiche di danno renale acuto (AKI). Sebbene i meccanismi che guidano l'AKI rimangano poco chiari, l'accumulo di prove suggerisce che l'alterazione della funzione metabolica nell'allotrapianto media l'AKI e potrebbe essere la ragione del DGF. Pertanto, decifrare e monitorare le basi metaboliche dell'IRI migliorerà la nostra capacità di diagnosticare e prevenire l'AKI. Questo articolo descrive un metodo unico per valutare la respirazione mitocondriale (mediante il tasso di consumo di ossigeno), la glicolisi (tasso di acidificazione extracellulare) e i livelli intracellulari di ATP in sospensioni di cellule renali derivate da agobiopsia. La metodologia è stata ottimizzata in suini maschi adulti sani e convalidata in un modello suino di autotrapianto. L'approccio presentato ha il potenziale per migliorare la valutazione in tempo reale della vitalità dell'allotrapianto renale in clinica. La profilazione del metabolismo nelle biopsie derivate da pazienti può anche scoprire nuova biologia in altre malattie renali basate sul metabolismo.

Introduzione

Il trapianto di rene è il trattamento ottimale per la malattia renale allo stadio terminale 1,2,3,4; Tuttavia, i reni trapiantati vengono spesso persi prematuramente, con una perdita di trapianto fino al 50% a 10 anni dopo il trapianto5. I pazienti affetti hanno un aumento della morbilità e della mortalità e rappresentano un grave onere economico per i sistemi sanitari6. Una delle principali cause di perdita prematura del trapianto è la lesione subita dal trapianto al momento del trapianto, nota come lesione da ischemia-riperfusione (IRI). L'IRI è una lesione inevitabile causata da una diminuzione del flusso sanguigno, seguita da riperfusione7. L'ischemia è caratterizzata dall'accumulo di succinato tissutale, che guida il flusso inverso di elettroni nella catena respiratoria mitocondriale, portando alla produzione di superossido e alla conseguente lesione precoce dopo la riperfusione8. L'IRI negli organi trapiantati aumenta il rischio di non funzione primaria, funzione ritardata del trapianto (DGF), rigetto ed esiti inferiori del trapianto 8,9. La DGF, definita come la necessità di dialisi nella prima settimana dopo il trapianto9, è una manifestazione di IRI10 grave. Istologicamente, la DGF associata a IRI si manifesta come necrosi tubulare acuta (ATN) e lesione della microvascolarizzazione. Dal punto di vista funzionale, vi è una diminuzione della velocità di filtrazione glomerulare (GFR) e della produzione di urina, caratteristiche del danno renale acuto (AKI) nell'allotrapianto11. Nonostante la sua importanza, attualmente non esistono trattamenti per l'AKI post-trapianto associata a ischemia e riperfusione. La mancanza di trattamenti deriva da una comprensione incompleta dei meccanismi della malattia e dalla mancanza di marcatori per identificare i pazienti a più alto rischio di disfunzione del trapianto durante i punti temporali critici in cui la lesione può essere reversibile12.

Prove crescenti suggeriscono che l'alterato metabolismo energetico nell'allotrapianto media l'AKI e può essere alla base di DGF 13,14,15. Le cellule renali generano energia attraverso due meccanismi principali: la respirazione mitocondriale e la glicolisi16. Nell'IRI, la riperfusione provoca disfunzione mitocondriale17. Di conseguenza, la glicolisi diventa la principale fonte di energia 13,18,19,20. Lo spostamento metabolico nell'IRI promuove la morte delle cellule endoteliali tubulari e microvascolari, portando all'AKI 21,22,23,24. In un lavoro precedente, l'ATN era associato ad un aumento dell'espressione di enzimi glicolitici e ad alterati livelli di proteine mitocondriali25, in linea con IRI nel trapianto13,18. Inoltre, in un modello di autotrapianto di rene suino, l'ischemia seguita da conservazione a freddo ha portato a una riduzione dei livelli di proteine mitocondriali renali e a un aumento dell'escrezione di lattato26. Nel complesso, questi risultati consolidano l'importanza clinica del monitoraggio del fenotipo metabolico degli allotrapianti renali, anche prima del trapianto, poiché le caratteristiche metaboliche basali nell'allotrapianto possono essere predittive della disfunzione dell'allotrapianto27.

Sono stati sviluppati modelli di previsione clinica del rischio a breve termine di rigetto e perdita dell'allotrapianto 28,29. Tuttavia, questi modelli mancano di precisione e non considerano le caratteristiche molecolari dell'innesto 30,31,32. Studi recenti miravano a rispondere a questo bisogno insoddisfatto attraverso l'identificazione di modelli molecolari a livello tissutale associati a risultati inferiori del trapianto, come la disfunzione dell'allotrapianto e il rigetto 13,14,15,25,33,34. Questi studi si basano su misurazioni molecolari allo stato stazionario al gene 33,34,35, alla proteina25,26 e al livello del metabolita13,14, lasciando un quadro incompleto del fenotipo metabolico dell'allotrapianto. Questa lacuna nelle conoscenze è in parte dovuta all'incapacità di misurare la funzione metabolica e lo stato energetico dei campioni derivati dai reni in un particolare momento. È giustificato lo sviluppo di un protocollo standardizzato per determinare il fenotipo metabolico delle cellule renali derivate dalla biopsia, che può potenzialmente essere tradotto nello studio di campioni di pazienti. Questo articolo descrive un flusso di lavoro unico per valutare la respirazione mitocondriale (mediante il tasso di consumo di ossigeno), la glicolisi (tasso di acidificazione extracellulare) e i livelli intracellulari di ATP nelle sospensioni di cellule renali derivate da biopsia. La metodologia è stata ottimizzata utilizzando nuclei bioptici di suini maschi adulti sani. Per facilitare la futura implementazione clinica, i nuclei bioptici sono stati ottenuti utilizzando un ago da 18 G, come nei protocolli clinici standard di campionamento del trapianto renale36,37. Infine, l'utilità dell'implementazione del protocollo in condizioni sperimentali discriminanti è stata convalidata in un modello suino di auto-trapianto.

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Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dall'Animal Care Committee del Toronto General Research Institute (numero di protocollo sull'uso degli animali: 3652). Gli animali sono stati curati in conformità con la National Society of Medical Research and Guide for the care of laboratory animals, National Institute of Health (NIH), Ontario, Canada. In questo studio sono stati utilizzati cinque maiali maschi dello Yorkshire di 3 mesi, del peso di circa 30 kg ciascuno. Il protocollo per questa metodologia si articola nelle seguenti fasi: (1) Dissociazione di singoli nuclei di biopsia renale in sospensioni cellulari; (2) Profilo metabolico di cellule renali derivate da biopsia; e (3) Misurazione del contenuto di ATP nelle cellule renali derivate da biopsia. Tutti i campioni bioptici raccolti per le misurazioni della funzione metabolica o del contenuto di ATP sono stati dissociati entro 3 ore dal prelievo in una cabina di biosicurezza. Il flusso di lavoro della metodologia è mostrato nella Figura 1. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Dissociazione di nuclei di biopsia renale singola in sospensioni cellulari

  1. Raccogliere tre nuclei bioptici di tessuto dalla corteccia renale, utilizzando il sistema di pistole dell'ago coassiale (cioè un ago guida esterno e un ago per biopsia interno)38. Per la traduzione clinica, si consiglia l'uso di un ago pistola per biopsia da 18 G39.
    NOTA: Rispettare l'angolo dell'ago della pistola per biopsia (~45 °C) e la profondità della puntura (~20 mm) quando si eseguono biopsie della corteccia renale.
  2. Posizionare con cura il nucleo della biopsia in una provetta da 15 mL contenente 2 mL di RPMI 1640 su ghiaccio.
    1. Frammentare il tessuto bioptico in piccoli pezzi (lunghi ≤2 mm) utilizzando un bisturi su una capsula di Petri di 6 cm posta sul ghiaccio. Utilizzando una pinzetta curva a punta fine ultrasottile, posizionare i frammenti di tessuto di ciascuna biopsia in una diversa provetta da 1,5 ml contenente 1 ml di terreno di dissociazione.
      NOTA: Il terreno di dissociazione è costituito da un terreno RPMI 1640 contenente 0,1 mg/mL di DNasi I, 10 mg/mL di collagenasi e 2990 unità/mL di proteasi neutra da Bacillus polymyxa. La dissociazione delle biopsie renali umane utilizzando questa composizione del terreno ha dimostrato di massimizzare la vitalità cellulare e preservare la rappresentazione di popolazioni cellulari rare e fragili40.
  3. Lasciare che la dissociazione avvenga per 30 minuti a 37 °C (blocco riscaldante) con agitazione intermittente (si consiglia di agitare i tubi ogni 5 minuti).
  4. Dopo la dissociazione, filtrare le sospensioni cellulari attraverso tubi con tappo a scatto da 35 μm.
  5. Sciacquare il colino con 1:1 volume di siero fetale bovino al 100% (FBS).
  6. Raggruppare le tre sospensioni di cellule renali derivate da biopsia in una provetta da 15 mL.
  7. Pellettare le cellule mediante centrifugazione (400 x g, 5 min, 4 °C) e risospenderle in 1 mL di RPMI 1640 contenente il 10% di FBS. Questa sospensione cellulare produce normalmente 0,8-1,2 × 106 cellule.

2. Profilo metabolico di cellule renali derivate da biopsia

NOTA: La fase di profilazione metabolica integra la misurazione della glicolisi (ECAR) e del tasso di consumo di ossigeno (OCR) in un analizzatore di funzione metabolica, nonché i livelli intracellulari di ATP utilizzando un kit commerciale.

  1. Idratazione e calibrazione della piastra di utilità della cartuccia
    1. Un giorno prima del prelievo del campione, aggiungere 200 μL di ddH2O a ogni pozzetto della piastra di servizio della cartuccia dell'analizzatore di funzione metabolica.
    2. Incubare la piastra di servizio della cartuccia in un incubatore privo di CO2 a 37 °C per una notte.
    3. Il giorno del prelievo del campione, rimuovere il ddH2O per aspirazione utilizzando una pipetta Pasteur collegata a un sistema per vuoto e aggiungere 200 μL di soluzione calibrante (pH = 7,4) a ogni pozzetto della piastra di servizio della cartuccia.
    4. Incubare la piastra di servizio della cartuccia in un incubatore privo di CO2 a 37 °C per una notte.
  2. Placcatura cellulare e preparazione di terreni di analisi e composti stressanti per misure di funzione metabolica
    1. Aggiungere 100 μl di RPMI con il 10% di FBS in ciascun pozzetto di una piastra per il dosaggio della funzione metabolica a 96 pozzetti.
    2. Separare una piccola aliquota (ad es. 10 μL) della sospensione cellulare (ottenuta nella fase 1) in una provetta diversa e colorare le cellule utilizzando un colorante vitale di esclusione blu di tripano.
    3. Utilizzando una camera di conteggio, determinare la concentrazione di cellule vive (blu di tripano negativo)41 nella sospensione originale.
    4. Seminare le cellule in ciascuno dei pozzetti di studio della piastra di saggio della funzione metabolica, a una densità di 1,0 x 105 cellule vive/pozzetto. Questo numero di celle è stato determinato dopo l'ottimizzazione (vedere la sezione Risultati rappresentativi).
      NOTA: Non seminare le cellule in nessuno dei quattro angoli della piastra del saggio della funzione metabolica, poiché vengono utilizzate come spazi vuoti.
    5. Lasciare aderire le cellule incubando la piastra per il dosaggio della funzione metabolica in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 durante la notte (~16 h).
    6. Il giorno seguente, confermare al microscopio che le cellule si trovino a una confluenza minima del 70%-80% (un monostrato cellulare sano è importante per la determinazione ottimale dei parametri della funzione metabolica).
    7. Scongelare un'aliquota (40-50 mL) di terreno basale privo di rosso fenolo a 37 °C, per almeno 15 minuti.
    8. Preparare 35 mL di terreno di prova aggiungendo 2 mM di glutammina (350 μL), 1 mM di piruvato (350 μL) e 5,55 mM di glucosio (385 μL) in 33,915 mL di terreno basale pre-scongelato.
    9. Utilizzando una pipetta singola o multicanale, rimuovere delicatamente i terreni RPMI da ciascun pozzetto di studio della piastra per il dosaggio della funzione metabolica. Quindi, aggiungere 100 μl di terreno basale per lavare le cellule.
    10. Rimuovere delicatamente il terreno basale e aggiungere 150 μl di terreno di prova a ogni pozzetto, compresi i pozzetti senza cellule.
      NOTA: Lasciare i pozzetti senza terreno di analisi può influire sulle condizioni di umidità nell'ambiente della piastra e portare a misurazioni incoerenti della funzione metabolica (Figura supplementare 1).
    11. Collocare la piastra per il dosaggio della funzione metabolica in un incubatore privo di CO2 a 37 °C per ~1 h (fase di acclimatazione). Riportare la piastra di servizio della cartuccia (precedentemente incubata in soluzione calibrante) nella cappa di biosicurezza.
    12. Durante l'acclimatazione, preparare le seguenti quattro soluzioni di composti stressanti, in terreni di prova: 7 μM di oligomicina (7x, per una concentrazione finale di 1 μM di oligomicina); 2,4 μM di cianuro di carbonile-4 (trifluorometossi) fenilidrazone (FCCP) (8x, per una concentrazione finale di 0,3 μM FCCP); 450 mM 2-desossiglucosio (2-DG) (9x, per una concentrazione finale 50 mM 2-DG); 10 μM di Rotenone e 10 μM di Antimicina A (Rot + AA) (10x, per una concentrazione finale di 1 μM Rot + 1 μM di AA).
      NOTA: L'oligomicina inibisce l'attività dell'ATP sintasi e quindi interrompe la catena di trasporto degli elettroni (ETC). Ciò riduce l'OCR e l'afflusso di protoni guidato dall'ATP sintasi nei mitocondri. Di conseguenza, la glicolisi diventa la principale fonte di produzione di ATP42. FCCP è un farmaco cianuro (carica negativa) che agisce come disaccoppiatore della fosforilazione ossidativa, attirando i protoni (carica positiva) e inducendo un afflusso continuo di protoni nei mitocondri, che consente il consumo di ossigeno da parte dell'ETC indipendentemente dall'attività dell'ATP sintasi43. Il 2-DG è un analogo strutturale sintetico del glucosio in cui il gruppo 2-ossidrile è sostituito dall'idrogeno e agisce come inibitore competitivo della glicolisi44. Rot e AA sono farmaci inibitori dei complessi I e III della catena di trasporto degli elettroni, rispettivamente45. Gli effetti dell'iniezione di ciascun farmaco in diverse fasi del test della funzione metabolica sono illustrati nella Figura 2 supplementare.
    13. Caricare 25 μl di ciascun farmaco nella porta corrispondente sulla parte superiore di ciascun pozzetto della piastra di utilità della cartuccia, compresi i pozzetti senza celle. Caricare i farmaci secondo la seguente sequenza: 7x oligomicina (porta A), 8x FCCP (porta B), 9x 2-DG (porta C), 10x Rot + AA (porta D).
    14. Incubare la piastra di servizio della cartuccia nell'incubatore privo di CO2 fino a quando non è necessario per impostare il test della funzione metabolica.
  3. Determinazione del consumo di ossigeno e dei tassi glicolitici in cellule renali derivate da biopsia
    1. Verificare che l'analizzatore di funzione metabolica sia acceso e collegato al software del controller in un computer accessorio.
    2. Avvia il software.
    3. Fare clic sul pulsante Modello > vuoto.
    4. Nella prima scheda, fai clic sul pulsante Strategia di iniezione. Fare clic su ciascun pulsante con le lettere A, B, C o D che corrispondono alle quattro porte di iniezione. Annotare il nome del farmaco che verrà iniettato attraverso ciascuna porta: oligomicina (porta A), FCCP (porta B), 2-DG (porta C), Rot + AA (porta D).
    5. Nella seconda scheda, definisci tutte le condizioni sperimentali. Fare clic sul pulsante Aggiungi condizione per introdurre una nuova condizione. Il software assegnerà automaticamente un colore a ciascuna condizione. Fare clic sul pulsante Mappa piastre e assegnare a ciascun pozzetto la condizione sperimentale corrispondente, che verrà colorata di conseguenza.
      NOTA: I quattro pozzetti angolari devono rimanere assegnati come vuoti (colore nero), poiché vengono utilizzati per sottrarre il segnale di fondo.
    6. Nella terza scheda, fai clic sul pulsante Iniezione quattro volte, in modo che le quattro iniezioni (porte A, B, C e D) vengano aggiunte alla sequenza. Il test può essere eseguito utilizzando la sequenza di iniezione predefinita (A, B, C, D), il numero di misurazioni (3 misurazioni basali + 3 misurazioni dopo ogni iniezione) e il tempo tra le misurazioni (3 minuti).
    7. Nella quarta scheda, compila le caselle con le informazioni essenziali sullo studio e fai clic su Esegui. Il vassoio si aprirà e il software chiederà all'utente di montare la piastra di utilità della cartuccia. Assicurarsi di rimuovere il coperchio verde prima di posizionare il piatto sul vassoio.
    8. Dopo la calibrazione (~15 min), il vassoio si aprirà nuovamente e il software chiederà all'utente di rimuovere la piastra di utilità della cartuccia e di posizionare la piastra del test della funzione metabolica sul vassoio. Anche in questo caso, rimuovere il coperchio della piastra prima di montare la piastra sul vassoio. La piastra di utilità della cartuccia può essere scartata.
    9. Il test terminerà in circa 2 ore. Trascorso questo tempo, salva il file '.asyr' corrispondente. Analizza i file .asyr in modo computazionale per esaminare le curve ECAR e OCR. Esporta i dati nel formato preferito.
  4. Misurazione del contenuto di DNA per la normalizzazione dei dati sulla funzione metabolica
    1. Determinare la quantità di DNA nelle cellule di ciascun pozzetto dopo il test della funzione metabolica utilizzando il kit di test di proliferazione cellulare specificato (vedere la Tabella dei materiali).
    2. Preparare il volume richiesto di 1x tampone di lisi cellulare diluendo 20x tampone di lisi cellulare in acqua deionizzata.
    3. Per preparare una curva standard, preparare campioni da 100 μL di batteriofago λ DNA standard (incluso nel kit del saggio di proliferazione cellulare) diluiti in serie in tampone di lisi cellulare a concentrazioni nell'intervallo 0 ng/mL, 12,5 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 200 ng/mL, 400 ng/mL, 800 ng/mL. Caricare ogni diluizione in un pozzetto diverso di una micropiastra nera a 96 pozzetti.
    4. Preparare 1x soluzione legante il colorante diluendo 400x reagente colorante in 1x tampone di lisi cellulare. Per ogni pozzetto di curva standard e di saggio della funzione metabolica sarà necessario 100 μL.
    5. Distribuire 100 μl di soluzione colorante 1x nella prima colonna, che contiene già gli standard. NOTA: Il processo fino a questo punto può essere avviato 30 minuti prima della fine dell'esecuzione del test della funzione metabolica.
    6. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra di analisi della funzione metabolica utilizzando una pipetta singola o multicanale.
    7. Con una pipetta multicanale, aggiungere 100 μl di soluzione legante il colorante 1x a ciascun pozzetto di studio della piastra del saggio della funzione metabolica. Pipettare su e giù un paio di volte per lisare le cellule e trasferire il contenuto sulla piastra nera.
    8. Proteggere la micropiastra dalla luce e incubare a 37 °C per 2-5 minuti.
    9. Misurare l'intensità di fluorescenza di ciascun campione utilizzando un lettore di micropiastre a fluorescenza con eccitazione a 480 nm e rilevamento delle emissioni a 520 nm.

3. Misurazione del contenuto di ATP in cellule renali derivate da biopsia

NOTA: Misurare la quantità di ATP nelle cellule renali derivate da biopsia utilizzando il reagente di rilevamento ATP specificato e lo standard ATP ricombinante (rATP) (vedere la Tabella dei materiali).

  1. Se congelato, scongelare il reagente di rilevazione ATP a 4 °C per una notte.
  2. Dopo l'acquisizione di sospensioni cellulari derivate da biopsia e la conta cellulare, piastra 1,0 x 104 cellule vive/pozzetto in ciascun pozzetto di una micropiastra bianca a 96 pozzetti contenente 100 μL di terreno RPMI 1640 con il 10% di FBS. Lasciare vuota la prima colonna della micropiastra, poiché verrà utilizzata per caricare una curva standard rATP il giorno successivo.
  3. Incubare la micropiastra a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per una notte.
  4. Il giorno successivo, preriscaldare il reagente di rilevamento ATP a temperatura ambiente.
  5. Generare la curva standard rATP. Preparare campioni da 100 μl di rATP standard diluiti in serie in PBS alle seguenti concentrazioni: 0 nM, 0,001 nM, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM.
  6. Caricare 50 μl di ciascun campione standard di rATP nella prima colonna della micropiastra.
  7. Rimuovere il terreno RPMI 1640 contenente il 10% di FBS da ciascun pozzetto di studio della micropiastra, utilizzando una pipetta singola o multicanale.
  8. Lavare bene ogni studio con 100 μl di PBS (preriscaldato a bagnomaria a 37°C).
  9. Rimuovere il PBS e aggiungere 50 μL di nuovo PBS in ogni pozzetto dello studio.
  10. Aggiungere 50 μl di reagente di rilevazione ATP sia nel pozzetto standard che in quello di studio.
  11. Mescolare, incubare a 37 °C per 2 minuti e successivamente a RT per 10 minuti.
  12. Lettura e registrazione della luminescenza in un lettore di micropiastre.

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Risultati

Il flusso di lavoro è stato testato in cellule renali derivate da biopsia di maiali maschi sani dello Yorkshire di 3 mesi. Il protocollo per la dissociazione tissutale e la placcatura cellulare è stato seguito come descritto sopra. Dopo aver lasciato aderire le cellule per 16 ore, OCR ed ECAR sono stati misurati in tempo reale nelle cellule renali suine derivate da biopsia utilizzando un analizzatore di funzione metabolica, come marcatori rispettivamente della respirazione mitocondriale e della glicolisi.

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Discussione

Questo articolo descrive un metodo unico per valutare la funzione metabolica delle cellule renali ottenute dalle biopsie. Un protocollo per ottenere sospensioni di singole cellule da biopsie renali con nucleo fresco è stato accoppiato con un'analisi della funzione metabolica e dei livelli intracellulari di ATP. La glicolisi viene valutata misurando l'ECAR e la respirazione mitocondriale misurando l'OCR. Per ottimizzare la metodologia sono state utilizzate biopsie renali porino.

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Dichiarazioni

Nessuno dei coautori ha interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

AK è stato sostenuto dalla University Health Network Foundation (premi 579067450776, 579072310776 e 579068260776). SC-F è stato supportato dal programma Kidney Research Scientist Core Education and National Training (KRESCENT) (2019KPPDF637713 e 24KNIA-1291062).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-Deossi-D-glucosioSigmaD6134Inibitore competitivo della glicolisi
5 mL Provetta in polistirene
a fondo tondo, con filtro cellulare Tappo a scatto		Falcon352235Provette per dissociazione
Antimicina A da  Streptomyces  sp.SigmaA8674Inibitore del complesso III della catena respiratoria
AOF BP ProteasiVitaCyte003-1000Enzima di dissociazione
Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)
fenilidrazone (FCCP)		SigmaC2920Disaccoppiatore della fosforilazione ossidativa
CellTiter-Glo 2.0 Assay, 100mLPromegaG9242Misurazione dell'ATP
Collagenasi MAVitaCyte001-2030Enzima di dissociazione
CyQUANT Saggio di proliferazione cellulare, per cellule in colturaInvitrogenC7026Misurazione del DNA intracellulare
D-glucosio, anidro, grado reagenteBioshopGLU501Substrato metabolico
DNasi IStemcell07469Enzima
di dissociazioneSiero fetale bovino, Premium,
Origine USA, inattivato dal calore, 500 mL		Wisent080-450Integratore di terreni di dissociazione
L-Glutammina-200 mM (100x) liquido (100 mL)Gibco25030081Substrato metabolico
Oligomicina ASigma75351Inibitore dell'ATP sintasi
PBS, -/-, 500 mLWisent311-010-CLLavaggio cellulare
rATP,  10 mM,  0?5 mLPromegaP1132Misurazione dell'ATP intracellulare
RotenoneSigmaR8875Inibitore del complesso I della catena respiratoria
RPMI 1640Gibco11875119Mezzi di dissociazione
Seahorse Wave Controller Software 2.6AgilentN/ASet up delle misurazioni della funzione metabolica
Seahorse Wave Desktop Software 2.6AgilentN/AAnalisi dei dati sulla funzione metabolica
Terreno base Seahorse XF, senza rosso fenolo, 500 mLAgilent103335-100Misurazione della funzione metabolica
Seahorse XFe96 FluxPak (20 piastre, 18 cartucce,
e 500 ml di soluzione calibrante)		Agilent102416-100Misurazione della funzione metabolica
Cavalluccio marino XFe96 Analizzatore di funzione metabolicaAgilent101991-100Misurazione della funzione metabolica
Piruvato di sodio Soluzione 100 mM (100X), liquido 100 mLGibco11360070Substrato metabolico
intracellulare

Riferimenti

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