Purificazione della cromatina del locus genico a copia singola in Saccharomyces cerevisiae

Summary

Questo protocollo presenta un metodo di isolamento della cromatina locus-specifico basato sulla ricombinazione sito-specifica per purificare un locus genico a singola copia di interesse nel suo contesto nativo della cromatina dal lievito in gemmazione, Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

L'unità organizzativa di base della cromatina eucariotica è la particella del nucleo del nucleosoma (NCP), che comprende il DNA avvolto ~ 1,7 volte attorno a un ottamero istone. La cromatina è definita come l'entità degli NCP e di numerosi altri complessi proteici, compresi i fattori di trascrizione, il rimodellamento della cromatina e gli enzimi modificanti. Non è ancora chiaro come queste interazioni proteina-DNA siano orchestrate a livello di specifici loci genomici durante le diverse fasi del ciclo cellulare. Ciò è dovuto principalmente alle attuali limitazioni tecniche, che rendono difficile ottenere misurazioni precise di tali interazioni dinamiche. Qui, descriviamo un metodo migliorato che combina la ricombinazione sito-specifica con un efficiente protocollo di purificazione di affinità in un'unica fase per isolare un locus genico di interesse a singola copia nel suo stato nativo della cromatina. Il metodo consente l'arricchimento robusto del locus bersaglio sulla cromatina genomica, rendendo questa tecnica una strategia efficace per identificare e quantificare le interazioni proteiche in modo imparziale e sistematico, ad esempio mediante spettrometria di massa. A seguito di tali analisi composizionali, la cromatina nativa purificata con questo metodo riflette probabilmente la situazione in vivo per quanto riguarda il posizionamento dei nucleosomi e le modificazioni degli istoni ed è, quindi, suscettibile di ulteriori analisi strutturali e biochimiche della cromatina derivata praticamente da qualsiasi locus genomico nel lievito.

Introduction

L'organizzazione dinamica dei genomi eucariotici in cromatina compatta il DNA per adattarsi ai confini del nucleo, garantendo al contempo una dinamica sufficiente per l'espressione genica e l'accessibilità per i fattori regolatori. In parte, questa versatilità è mediata dal nucleosoma, l'unità di base della cromatina, che comprende una particella centrale con 147 bp di DNA avvolto ~1,7 volte attorno all'ottamero^{istonico 1}. Il nucleosoma è una struttura altamente dinamica per quanto riguarda la sua composizione, con numerose varianti istoniche e modificazioni post-traduzionali (PTM) sulle code istoniche N- e C-terminali. Inoltre, la cromatina eu....

Protocol

Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e gli strumenti utilizzati in questo protocollo. Vedere la Tabella 1 per un elenco delle soluzioni, dei buffer e dei supporti utilizzati.

1. Costruzione del ceppo di lievito ricombinante

1. Per costruire un ceppo di lievito competente per la ricombinazione, trasformare il plasmide K238 digerito da SbfI in un ceppo di lievito con siti di legame LexA integrati e siti di ricombinazione RS nel locus di interesse^13,14.
   NOTA: Il frammento di restrizione ....

Results

La purificazione del dominio della cromatina ARS316 di ~1,4 kb è stata mediata dalla proteina adattatore LexA-TAP espressa costitutivamente. Per fungere da controllo negativo, abbiamo condotto purificazioni utilizzando un ceppo isogenico che esprime LexA-TAP ma non contiene RS integrati e siti di legame LexA. La Figura 3 illustra il risultato dell'analisi del DNA di un esperimento di purificazione standard eseguito sia sul ceppo di controllo che su un ceppo competente per la ricombinazione m.......

Discussion

L'identificazione dei fattori e del paesaggio cromatinico di una specifica regione genomica bersaglio continua a rappresentare una sfida importante nella ricerca sulla cromatina¹⁸. Questo protocollo descrive un sistema efficiente per asportare e purificare in modo specifico domini cromatinici distinti dai cromosomi del lievito. Per quanto ne sappiamo, la purezza e la resa di questa purificazione in un'unica fase superano molti dei limiti dei metodi di purificazione della cromatina locus-specifici,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ceppi di lievito
Ceppo di controllo: MATa; ura3Δ 0; leu2Δ 0; suo3Δ 1; met15Δ 0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR			Sezione 1, vedi riferimenti 13 e 14
Recombination Strain: MATa; ura3Δ 0; leu2Δ 0; suo3Δ 1; met15Δ 0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR			Sezione 1, vedere riferimento 13 e 14
Plasmid
K238 plasmide			Sezione 1, vedere riferimento 13 Conservazione: Conservare a -20 ° C
K071 DNA plasmidico			Sezione 7.1, vedere riferimento 13 Conservazione: Conservare a -20 gradi C
Reagents
Acetone	Carl Roth	5025.1	Sezione 2 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Acetato di ammonio (NH4Ac)	Sigma Aldrich	A7262	Sezione 6 e 7.1 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Soluzione di ammonio (NH4OH) 25%	Merck Millipore	533003	Sezione 6 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Solfato di ammonio	Santa Cruz	Sc-29085	Sezione 2 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Bacto agar	BD (VWR)	90000-760	Sezione 3 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Bacto peptone	BD (VWR)	211820	Sezione 3 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
β-Mercaptoetanolo	Sigma Aldrich	07604	Sezione 7.2 Stoccaggio: Conservare a 4 gradi; C
Kit substrato chemiluminescente	ThermoFisher	34580	Sezione 7.2 Conservazione: Conservare a 4 gradi; C
Di-Sodium idrogeno fosfato dodecaidrato	Merck	1.06579.1000	Sezione 2 e 7.1 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Ditiotreitolo (DTT)	ThermoFisher	15508013	Sezione 4 Conservazione: Conservare a 4 gradi; C
Etanolo	Merck	100983	Sezione 7.1 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Sigma Aldrich	ED	Sezione 7.1 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Galattosio (20% (p/v) stock)	Sigma Aldrich	G0625-1KG  /  5KG	Sezione 3 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Gel caricamento colorante (6x)	BioLabs	B7024A	Sezione 7.1 Conservazione: Conservare a -20 ° C
Glusose	Sigma-Aldrich	G8270	Sezione Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Glycine	Carl Roth.0079.4		Sezione 2 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Glicogeno (5 mg/mL)	Invitrogen	AM9510	Sezione 7.1 Conservazione: Conservare a -20 ° C
Acido cloridrico (HCl)	PanReac AppliChem	182109.1211	Sezione 2, 4 e 7.1 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Acetato di magnesio (MgAc)	Bernd Kraft	15274.2600/C035	Sezione 4 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Cloruro di magnesio (MgCl2)	Sigma Aldrich	M8266	Sezione 6 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Nu PAGE LDS sample buffer (4x)	Invitrogen	2399549	Sezione 7.2 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Fenolo/Cloroformio/Alcool isoamilico (25:24:1 v/v)	Invitrogen	15593-031	Sezione 7.1 Conservazione: Conservare a 4 ° C
Cloruro di potassio (KCl)	Sigma	P9541	Sezione 4 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Marcato radioattivamente α-32P dATP (3.000 Ci/mmol, 10 mCi/mL)	Hartmann Analytic	SRP-203	Sezione 7.1 Conservazione: Conservare a 4 gradi; C
Sistema di etichettatura RadPrime	ThermoFisher	18428-011	Sezione 7.1 Stoccaggio: Conservare a -20 gradi; C
Raffinosio (20% (p/v) di magazzino)	SERVA	34140.03	Sezione 3 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Cloruro di sodio (NaCl)	Merck	K53710504142	Sezione 7.1 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Citrato di sodio (Na3C6H5O7)	Sigma-Aldrich	71402	Sezione 7.1 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Idrossido di sodio (NaOH)	Sigma Aldrich	S5881	Sezione 7.1 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Sodio n-dodecil solfato (SDS) (5% stock (p/v) )	Alfa Aesar	A11183	Sezione 7.1 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Fosfato di sodio monobasico	Sigma-Aldrich	71496	Sezione 2 e 7.1 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Sodio  azide	Santa Cruz  Biotecnologia	sc-208393	Sezione 2 Conservazione: Conservare a -20 ° C
Trietilammina	Sigma Aldrich	90340	Sezione 2 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Tris base	Chem Cruz	SC-3715B	Sezione 2 e 4 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Sezione 2 e 4 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Tween-20	Bernd Kraft	18014332	Sezione 4 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Estratto di lievito	BD (VWR)	212720	Sezione 3 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Fattore di accoppiamento del lievito alfa (1 &; micro; g/mL di riserva )	Biomol	Y2016.5	Sezione 3 Conservazione: Conservare a -20 gradi C
Lievito Sintetico Drop-out Medium Integratori senza LEUCINA	Sigma Aldrich	Y1376	Sezione 1, vedere riferimento 14
Enzymes
HpaI restriction enzyme (5.000 U/mL)	NEB	R0105S	Sezione 7.1 Conservazione: Conservare a -20 ° C
Cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi (100x)	ThermoFisher Scientific	78446	Sezione 4 Conservazione: Conservare a4 ° C
Proteinasi K (10 mg/mL)	SERVA	33756	Sezione 7.1 Conservazione: Conservare a -20 ° C
RNasi A (10 mg/mL)	ThermoFisher	EN0531	Sezione 7.1 Conservazione: Conservare a -20 ° C
TEV proteasi (10000 U/µ L)	NEB	P8112S	Sezione 5 Stoccaggio: Conservare a -20 ° C
Materiali
BcMag Perle magnetiche attivate con resina epossidica	Bioclone Inc.	FC-102	Sezione 2 Stoccaggio: Conservare a 4 gradi C
Ghiaccio			Sezione 4
Provette da centrifuga a basso legame 2,0 mL	Eppendorf	22431102	Sezione 4
Microspin  G-25 Colonne	Cytiva	27-5325-01	Sezione 7.1 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Parafilm	Merck	P7793	Sezione 4
Membrana in nylon positivo	Biozol	11MEMP0001	Sezione 7.1 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Membrana di trasferimento PVDF	Immobilon-Merck Millipore	IPVH00010	Sezione 7.2 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente temperatura
SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 pozzetti, 1,5 mm)	Invitrogen	NP0336BOX	Sezione 7.2 Conservazione: Conservare a 4 gradi C
Siringa (25 mL) con raccordo luer	Henke Sass Wolf	4200-000V0	Sezione 3
Carta Whatman (Grado 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet)	Cytiva	3030-917	Sezione 7.1 Conservazione: Conservare a temperatura ambiente
Antibodies
Anti-LexA, IgG policlonali di coniglio, anticorpo Merck della regione di legame del DNA	Millipore	06-719	Sezione 7.2 Stoccaggio: Conservare a -20 gradi C
Capra Anti-coniglio IgG (H+L), Coniugato perossidasi di rafano	Invitrogen	G21234	Sezione 7.2 Conservazione: Conservare a -20 °
C Perossidasi Anti-Perossidasi (PAP) prodotto nel coniglio per la rilevazione di proteine marcate con TAP	Sigma Aldrich	P1291-500UL	Sezione 7.2 Conservazione: Conservare a -20 °
C Anticorpi IgG di coniglio	Sigma	I5006-100MG	Sezione 2 Conservazione: Conservare a 4 gradi C
Primer (10 & micro; M)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT			Sezione 7.1
K071 DNA plasmidico spike-in: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCCCAACAT			Sezione 7.1
PCR frammento da DNA genomico di lievito come modello   per amplificazione ARS316 (per Southern Blot): fwd 5'- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                                                                  rev 5'- TTTGTTTATCTCATCACTAAT			Sezione 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT			Sezione 7.1
Equipment
Macinacaffè	Gastroback	42601	Sezione 4
Fiaschetta Dewar	NAL GENE	4150-2000	Sezione 3
DynaMag TM-2 rack magnetico	Invitrogen	12321D	Sezione 4, 5 e 6
Forno di ibridazione	Hybaid Mini10	Ri418	Sezione 2
Microcentrifuga	Eppendorf	5424R	Sezione 4 e 7.1
UV-crosslinker	Analytikjena	95-0174-02	Sezione 7.1