Allineamento di dati di serie temporali sincronizzati utilizzando il modello caratterizzante della perdita di sincronia del ciclo cellulare per confronti cross-experiment

Summary

Una sfida nell'analizzare gli esperimenti sincronizzati di serie temporali è che gli esperimenti spesso differiscono nella durata del recupero dalla sincronia e nel periodo del ciclo cellulare. Pertanto, le misurazioni di diversi esperimenti non possono essere analizzate in forma aggregata o facilmente confrontate. Qui, descriviamo un metodo per allineare gli esperimenti per consentire confronti specifici di fase.

Abstract

Lo studio del ciclo cellulare spesso dipende dalla sincronizzazione delle popolazioni cellulari per misurare vari parametri in una serie temporale mentre le cellule attraversano il ciclo cellulare. Tuttavia, anche in condizioni simili, gli esperimenti replicati mostrano differenze nel tempo necessario per recuperare dalla sincronia e attraversare il ciclo cellulare, impedendo così confronti diretti in ogni punto temporale. Il problema di confrontare le misurazioni dinamiche tra gli esperimenti è esacerbato nelle popolazioni mutanti o in condizioni di crescita alternative che influenzano il tempo di recupero della sincronia e / o il periodo del ciclo cellulare.

Abbiamo precedentemente pubblicato un modello matematico parametrico chiamato Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) che monitora come le popolazioni sincrone di cellule si liberano dalla sincronia e progrediscono attraverso il ciclo cellulare. I parametri appresi dal modello possono quindi essere utilizzati per convertire i punti temporali sperimentali da esperimenti di serie temporali sincronizzati in una scala temporale normalizzata (punti della linea di vita). Piuttosto che rappresentare il tempo trascorso in minuti dall'inizio dell'esperimento, la scala della linea di vita rappresenta la progressione dalla sincronia all'ingresso del ciclo cellulare e quindi attraverso le fasi del ciclo cellulare. Poiché i punti vitali corrispondono alla fase della cellula media all'interno della popolazione sincronizzata, questa scala temporale normalizzata consente confronti diretti tra esperimenti, compresi quelli con periodi e tempi di recupero variabili. Inoltre, il modello è stato utilizzato per allineare gli esperimenti sul ciclo cellulare tra diverse specie (ad esempio, Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe), consentendo così il confronto diretto delle misurazioni del ciclo cellulare, che possono rivelare somiglianze e differenze evolutive.

Introduction

Le misurazioni di serie temporali effettuate su popolazioni sincronizzate di cellule mentre progrediscono attraverso il ciclo cellulare sono un metodo standard per studiare i meccanismi che controllano la progressione del ciclo cellulare 1,2,3,4,5,6,7,8 . La capacità di effettuare confronti tra esperimenti di sincronia / rilascio di serie temporali è vitale per la nostra comprensione di questi processi dinamici. L'uso di esperimenti replicati per corroborare i risultati può aumentare la fiducia nella riproducibilità delle conclusioni. Inoltre, i confronti tra le condizioni ambientali, tra i mutanti e persino tra le specie possono rivelare molte nuove intuizioni sulla regolazione del ciclo cellulare. Tuttavia, la variabilità intersperimentale nel recupero dalla sincronia e nella velocità di progressione del ciclo cellulare compromette la capacità di effettuare confronti punto-tempo-a-punto tra repliche o tra esperimenti con tempi alterati del ciclo cellulare. A causa di queste sfide, le repliche spesso non sono incluse per le serie temporali complete (ad esempio, Spellman et ^al.4). Quando vengono raccolte le repliche per l'intera serie temporale, i dati non possono essere analizzati in forma aggregata, ma piuttosto una singola replica viene utilizzata per l'analisi e altre repliche sono spesso relegate a cifre supplementari (ad esempio, Orlando et ^al.8). Inoltre, i confronti tra esperimenti con diverse caratteristiche di recupero o progressione del ciclo cellulare sono difficili. Le misurazioni di intervalli più piccoli tra un evento di interesse e un punto di riferimento del ciclo cellulare (ad esempio, emergenza delle gemme, ingresso della fase S o insorgenza dell'anafase) possono aiutare a ridurre gli errori se questi eventi di riferimento sono tracciati 1,2,3,9,10,11,12. Tuttavia, differenze sottili ma importanti possono rimanere inosservate o oscurate utilizzando questi metodi ad hoc. Infine, le analisi a singola cellula consentono di analizzare la progressione del ciclo cellulare senza fare affidamento sulla sincronizzazione o sull'allineamento¹³, sebbene le misurazioni su larga scala negli studi a singola cellula possano essere impegnative e costose.

Per superare queste difficoltà, abbiamo sviluppato il modello CLOCCS (Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony) per aiutare l'analisi delle misurazioni di serie temporali effettuate su popolazioni sincronizzate^14,15. CLOCCS è un modello matematico flessibile che descrive la distribuzione delle cellule sincronizzate attraverso le fasi del ciclo cellulare mentre vengono rilasciate dalla sincronia e progrediscono attraverso il ciclo cellulare. La struttura del processo di ramificazione consente al modello di spiegare le qualità asimmetriche delle cellule madri e figlie dopo la divisione, come osservato in S. cerevisiae, pur essendo utile per gli organismi che si dividono per fissione, come S. pombe. Il modello può prendere input da una serie diversificata di tipi di misurazione per specificare la fase del ciclo cellulare. Può ingerire dati di fase del ciclo cellulare in erba, che includono misurazioni della percentuale di cellule gemmate nel tempo, consentendo la stima del numero di cellule al di fuori della fase G1 non gemmata^14,15. Il modello può anche acquisire dati citometrici a flusso che misurano il contenuto di DNA, consentendo così la valutazione delle transizioni di riferimento da G1 a S, S a G2 e da M a G1¹⁵. I marcatori morfologici fluorescenti possono anche essere utilizzati per identificare la fase del ciclo cellulare. La marcatura fluorescente degli anelli della miosina, dei nuclei e dei corpi dei poli del fuso (SPB) può essere utilizzata per determinare la fase del ciclo cellulare, e questi sono stati incorporati nel modello CLOCCS¹¹; Tuttavia, queste misurazioni non saranno descritte in questo protocollo. Inoltre, l'indice di settazione è stato utilizzato come input per la modellazione dei dati di S. pombe¹⁴. Pertanto, il modello può essere utilizzato per analisi del ciclo cellulare in una varietà di organismi e può essere ulteriormente ampliato.

CLOCCS è un modello parametrico che consente l'inferenza bayesiana completa di più parametri dai dati di input (ad esempio, percentuale di gemmazione, contenuto di DNA). Questi parametri includono il tempo di recupero dalla sincronia, la lunghezza del periodo del ciclo cellulare (stimato separatamente per le cellule madri e figlie) e la posizione media del ciclo cellulare delle cellule in ciascun punto temporale. Questi parametri rappresentano il comportamento della cellula media nella popolazione, consentendo al ricercatore di mappare ogni punto temporale una posizione del ciclo cellulare espressa come punto di vita. La conversione in punti linea vita dipende dai parametri CLOCCS lambda (λ) e mu0 (μ₀)^14,15. Il parametro λ corrisponde al periodo medio del ciclo cellulare delle cellule madri. Tuttavia, a causa del ritardo madre-figlia^14,15, questo non è il periodo medio del ciclo cellulare dell'intera popolazione che include sia le cellule madri che quelle figlie. CLOCCS deduce inoltre il parametro delta (δ), che corrisponde al ritardo madre-figlia e, quindi, consente il calcolo del periodo medio del ciclo cellulare dell'intera popolazione. Infine, poiché ogni esperimento inizia dopo il rilascio dalla sincronizzazione del ciclo cellulare, il tempo necessario per il ripristino dal metodo di sincronizzazione è rappresentato dal parametro CLOCCS μ₀. CLOCCS adatta un modello ai dati di fase del ciclo cellulare di input e quindi deduce questi parametri utilizzando un algoritmo Monte Carlo a catena di Markov a camminata casuale^14,15. Mappando più esperimenti su una scala temporale comune del ciclo di vita cellulare, è possibile effettuare confronti diretti specifici di fase tra repliche o esperimenti in cui il tempo di recupero o i periodi del ciclo cellulare non sono identici 8,14,15.

Poiché le popolazioni sincronizzate perdono sincronia ad un certo ritmo nel corso delle serie temporali^14,15,16,17, la variabilità nel tasso di perdita di sincronia può anche impedire confronti quantitativi tra esperimenti. Identificando la posizione delle popolazioni e la varianza nelle loro distribuzioni, CLOCCS tiene conto delle differenze nei tassi di perdita di sincronia. Questo potente strumento consente confronti specifici e dettagliati tra esperimenti, fornendo così la possibilità di effettuare direttamente confronti rilevanti non solo tra repliche ma anche tra condizioni ambientali, mutanti e persino specie che hanno tempi del ciclo cellulare drammaticamente diversi^14,15.

Questo documento descrive un metodo che utilizza CLOCCS per stimare i parametri adattando i dati da esperimenti di serie temporali di sincronia/rilascio, mappare i dati su una scala di linea di vita comune e quindi effettuare confronti pertinenti tra repliche o esperimenti. L'allineamento della linea di vita consente confronti diretti specifici di fase tra questi esperimenti, che consentono l'aggregazione e il confronto delle repliche e di effettuare confronti più pertinenti tra esperimenti con diversi tempi di recupero e periodi del ciclo cellulare.

Protocol

1. Raccolta della fase del ciclo cellulare e dei dati sperimentali

1. Sincronizzare le cellule rispetto al ciclo cellulare usando il metodo di sincronizzazione desiderato (ad esempio, elutriazione centrifuga come descritto in Leman et al.18 o arresto del feromone di accoppiamento come descritto in Rosebrock 19; sia Leman et al.18 che Rosebrock ¹⁹ includono anche metodi per il rilascio dalla sincronia). Iniziare il campionamento in tutte le serie temporali, assicurandosi che la serie temporale sia lunga almeno due periodi di ciclo cellulare completo e, in modo ottimale, raccogliere almeno 10 campioni per ciclo cellulare. In ogni punto temporale, raccogliere un campione per i dati di fase del ciclo cellulare (gemmazione o citometria a flusso) e un campione per i dati sperimentali, come descritto di seguito.
2. Se si utilizzano dati di gemmazione come dati di fase del ciclo cellulare, raccogliere dati sul germogliamento per l'allineamento CLOCCS.
   1. Esempio in tutte le serie temporali. Per ogni punto temporale, raccogliere le cellule e fissarle mescolando 200 μL di coltura cellulare sonicata con 200 μL di soluzione fissativa, come descritto in Leman et ^al.18.
   2. Per il germogliamento standard, contare almeno 200 cellule per punto temporale utilizzando un microscopio a luce trasmessa con un obiettivo 40x e un emocitometro. Aggiungere il campione di cellule dal punto 1.2.1 all'emocitometro e diluire se la densità impedisce il conteggio. Registrare il numero di celle gemmate e non gemmate in ogni punto temporale. Calcola la percentuale di celle gemmate e traccia ogni punto temporale in una curva in erba.
      NOTA: sono disponibili altri metodi per specificare le informazioni sulla fase del ciclo cellulare, ma questi non sono descritti in questo protocollo. Gli altri metodi sono descritti nel readme del CLOCCS e in un precedente lavoro¹¹.
3. Se si utilizzano dati sul contenuto di DNA citometrico a flusso come dati della fase del ciclo cellulare, raccogliere i dati di colorazione del DNA della citometria a flusso per l'allineamento CLOCCS citometrico a flusso.
   1. Esempio in tutte le serie temporali. Per ogni punto temporale, raccogli le celle e correggile come descritto in Haase e Reed²⁰.
   2. Colorare il DNA e analizzarlo utilizzando l'analisi citometrica a flusso standard. Un protocollo di colorazione raccomandato per S. cerevisiae è descritto in Haase e Reed²⁰.
4. Raccogliere omics associati o dati sperimentali correlati. Per i dati trascrittomici standard, raccogliere come descritto in Leman et ^al.18 e Kelliher et ^al.21,22. Assicurarsi che i dati siano associati a punti temporali contenenti dati di fase del ciclo cellulare per consentire l'allineamento a valle. Per un allineamento ottimale, assicurarsi che a ogni punto temporale contenente dati sperimentali siano associati anche dati di fase.
   NOTA: I dati sperimentali possono assumere molte forme. Tradizionalmente, utilizziamo il metodo di allineamento descritto per allineare gli esperimenti trascrittomici di serie temporali. Tuttavia, qualsiasi tipo di dati associati ai punti temporali può essere allineato (ad esempio, proteomica²²).

2. Installazione del software richiesto

Nota : in questa sezione si presuppone che Conda, Java 19 e Git siano già installati (Tabella dei materiali).

1. Scarica il repository CLOCCS_alignment inserendo il seguente comando nel terminale:
   git clone git clone https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
2. Creare un ambiente Conda utilizzando il file conda_req.yml inserendo il seguente comando nel terminale nella cartella in cui è stato clonato il repository CLOCCS_alignment:
   conda env create -f conda_req.yml

3. Utilizzo di CLOCCS per parametrizzare gli esperimenti

1. Fare doppio clic sul file cloccs_v2023.jar nella cartella CLOCCS nel repository CLOCCS_alignment e attendere l'apertura di un'interfaccia utente grafica. Questa schermata consente di immettere le opzioni per l'esecuzione di CLOCCS e visualizza i risultati una volta eseguita.
2. Inserisci le impostazioni generali.
   1. Impostate Ricottura Sim, Masterizza e Iterazioni digitando le caselle di input di testo associate. Sim Anneal (ricottura simulata) identifica i buoni valori dei parametri di partenza, Burn In cerca le modalità posteriori e la fase finale consente di trarre tutte le inferenze posteriori. Valori più alti aumentano il tempo di esecuzione ma aumentano anche la precisione.
   2. Immettere le condizioni sperimentali specificando la temperatura in gradi Celsius e il metodo di sincronizzazione utilizzando la casella di testo denominata Temperatura e il menu a discesa Synchro. Metodo, rispettivamente.
   3. Facoltativamente, configurare le impostazioni avanzate nel menu Impostazioni avanzate. Le impostazioni avanzate consentono di impostare i priori per ciascuno dei parametri ("mu0", "sigma0", "sigmav", "lambda", "bud.start", "bud.end").
      Nota : ulteriori informazioni relative alle impostazioni avanzate sono disponibili nel file Leggimi.txt nella cartella CLOCCS del repository CLOCCS_alignment.
3. Immettere le impostazioni da utilizzare con i dati in erba.
   1. Scegliete la selezione appropriata dal menu a discesa Tipo modello . L'opzione predefinita Bud è per le informazioni standard sul germogliamento per il lievito in erba.
      NOTA: nel menu a discesa sono presenti anche altre opzioni più avanzate: Mutante per informazioni sul germogliamento per i mutanti che subiscono più cicli di gemmazione senza divisione, BudSSLSMR per informazioni sul germogliamento e informazioni aggiuntive sul corpo del palo del fuso e sull'anello della miosina e BudNucDivNeck per informazioni sul germogliamento e ulteriori informazioni sulla divisione e sui nuclei del collo del germoglio. Queste opzioni avanzate sono descritte nel file CLOCCS readme e nel lavoro precedente^11,14,15.
   2. Importare i dati utilizzando il pannello Importazione dati digitando nelle caselle di input di testo o caricando un file facendo clic sul pulsante Seleziona file . La prima colonna specifica i punti temporali. Le due colonne rimanenti specificano i dati di gemmazione e possono assumere una delle seguenti opzioni: il numero di celle non budded (No Budded ), il numero di budded cells (Bud) o il numero totale di celle (Totale).
4. Immettere le impostazioni da utilizzare con i dati citometrici a flusso. Per ogni esperimento, eseguire il passaggio 3.3 o il passaggio 3.4.
   NOTA: i dati citometrici a flusso e i dati di gemmazione possono essere utilizzati insieme. Anche se in precedenza abbiamo descritto l'esecuzione insieme¹⁵, per questo strumento, devono essere eseguiti in modo indipendente e quindi confrontati.
   1. Convertire i file .fcs nel formato di input CLOCCS corretto per la citometria a flusso seguendo le istruzioni nel file supplementare 1 (che si trova anche nel repository CLOCCS_alignment come CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt).
   2. Selezionate la selezione Flusso (Flow ) dal menu a discesa Tipo di modello (Model Type ).
   3. Importate i dati utilizzando il pannello Importazione dati. Fare clic su Seleziona file e selezionare il file generato nel passaggio 3.4.1.
   4. Selezionare i punti temporali per i quali deve essere tracciato un adattamento CLOCCS citometrico a flusso selezionando i punti temporali nella casella Tempi per raccordo .
5. Una volta selezionati tutti gli ingressi per la citometria in gemmazione o a flusso, fare clic sul pulsante Applica , quindi fare clic sul pulsante Campione nella parte superiore dello schermo.
6. Visualizzare la curva di gemmazione o i grafici di citometria a flusso con gli adattamenti previsti selezionando la scheda Fit previsti . Questa scheda si apre per impostazione predefinita subito dopo il passaggio precedente.
7. Visualizzare gli istogrammi dei parametri per ciascun parametro selezionando la scheda Istogrammi dei parametri e quindi selezionando la sottoscheda corrispondente al parametro di interesse tra le seguenti opzioni: mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, bud.start, bud.end, ecc.
8. Visualizzare il grafico del punteggio posteriore selezionando la scheda Punteggio posteriore .
9. Visualizzare le impostazioni e modificarle ulteriormente selezionando la scheda Impostazioni ; visualizzare il registro delle esecuzioni precedenti selezionando la scheda Log .
10. Ottenere i parametri CLOCCS dall'adattamento selezionando la scheda Parametri posteriori . La tabella risultante avrà la seguente forma: ogni riga è costituita da un parametro, con la riga finale che è la posteriore. Le colonne sono costituite dal parametro previsto per la media, dall'intervallo di confidenza inferiore del 2,5%, dall'intervallo di confidenza superiore del 97,5% e dal tasso di accettazione.
    1. Registrare i parametri utilizzati per l'allineamento per ogni esperimento: il tempo di recupero dalla sincronia (μ₀) e il periodo medio del ciclo cellulare delle cellule madri (λ).
    2. Calcolare il periodo del ciclo cellulare calcolando la media del periodo della cellula madre (λ) e del periodo della cellula figlia (λ + δ), dove δ è il ritardo specifico della figlia.
       NOTA: Ripetere la sezione 3 con tutti gli esperimenti da includere nei confronti.

4. Conversione di punti temporali in punti vita utilizzando le funzioni di conversione Python e i parametri CLOCCS

NOTA: la conversione tra punti temporali e punti linea vita richiede due formule di conversione²¹. Un'implementazione Python per la conversione e la visualizzazione dei dati è disponibile nel repository CLOCCS_alignment e descritta di seguito.

1. Attivare l'ambiente Conda inserendo il seguente comando nel terminale: conda activate CLOCCS_alignment
2. Apri un notebook Python interattivo digitando il seguente comando nel terminale: jupyter notebook
3. Creare un nuovo notebook Python nella cartella desiderata.
   NOTA: è stato incluso un blocco appunti di esempio per dimostrare l'utilizzo standard ed è disponibile in Alignment/JOVE_example.ipynb nel repository di allineamento CLOCCS_.
4. Importare il file Python contenente le funzioni di allineamento eseguendo il seguente comando nella prima cella:
   %run path_to_repo/cloccs_alignment/Alignment/utilities.py
   1. Sostituire il percorso del repository CLOCCS_alignment con path_to_repo.
5. Se utilizzate dati di gemmazione come dati della fase del ciclo cellulare, importate un frame di dati contenente la percentuale di spostamento in corrispondenza di ogni punto temporale eseguendo il comando seguente in una nuova cella:
   budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
   1. Sostituire il percorso e il nome del file appropriati. Se il file è un file .csv, rimuovere sep ="\t"
6. Se si utilizzano dati di gemmazione come dati di fase del ciclo cellulare, allineare i dati di gemmazione a una scala temporale del punto di vita immettendo la seguente funzione in una nuova cella:
   aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, timepoints, param_mu0, param_lambda)
   1. Per i timepoint, sostituisci un elenco dei punti temporali come indice del frame di dati budding_df.
   2. Per param_mu0 e param_lambda, sostituire i parametri appresi dal CLOCCS in erba eseguito nella sezione 3 per l'esperimento.
7. Se si utilizzano i dati della citometria a flusso, importare i dati della citometria a flusso eseguendo il seguente comando in una nuova cella:
   flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
   1. Per flow_input_folder, sostituire il percorso appropriato della cartella contenente i file .fcs di citometria a flusso.
8. Se si utilizzano i dati della citometria a flusso, generare una tabella di conversione tra i punti temporali e i punti della linea di vita per ogni esperimento digitando il seguente comando in una nuova cella:
   flow_converter = convert_tp_to_ll(timepoints, param_mu0, param_lambda)
   1. Per i punti temporali, sostituire un elenco dei punti temporali dai dati di citometria a flusso.
   2. Per param_mu0 e param_lambda, sostituire i parametri appresi dalla citometria a flusso CLOCCS eseguita nella sezione 3 per l'esperimento.
9. Importare il frame di dati contenente i dati sperimentali nel blocco appunti eseguendo il comando seguente in una nuova cella:
   data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
   1. Sostituire il percorso e il nome del file appropriati. Se il file è un file .csv, rimuovere sep ="\t".
      NOTA: questa operazione può essere eseguita per qualsiasi dato tabulare. I dati sperimentali devono semplicemente avere i punti temporali come colonne o indice del frame di dati. I dati di esempio sono disponibili nel repository CLOCCS_alignment.
10. Allineare i dati sperimentali a una scala temporale dei punti vitali immettendo la seguente funzione in una nuova cella:
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, timepoints, param_mu0, param_lambda, interpolate, lowerll, upperll)
    1. Per i timepoint, sostituire un elenco dei punti temporali come indice o le colonne del data_df sperimentale del passaggio precedente.
    2. Per param_mu0 e param_lambda, sostituire i valori ottenuti nella sezione 3 da CLOCCS.
       NOTA: i parametri possono provenire da qualsiasi esecuzione CLOCCS eseguita su uno qualsiasi dei tipi di dati di fase del ciclo cellulare accettati.
    3. Facoltativamente, sostituire Interpola con True o False oppure lasciare vuoto (il valore predefinito è False).
       Nota : quando impostato su False, i dati non verranno interpolati. Se impostato su True, i punti della linea vita verranno arrotondati e interpolati per riempire i valori tra i punti della linea vita, in modo che vi sia un punto per intero nell'intervallo dei punti della linea del vita. Ciò consente un migliore confronto tra i set di dati.
    4. Facoltativamente, sostituire lowerll e upperll con valori None o integer.
       NOTA: se impostato su Nessuno, tutti i punti della linea di vita dopo l'interpolazione vengono mantenuti. Quando vengono forniti numeri interi, questo tronca i dati in modo che i punti della linea di vita vadano dal più basso all'alto. Ciò consente il confronto tra set di dati con un lowerll o upperll diverso.
11. Scaricare il set di dati allineato alla linea di vita immettendo il comando seguente in una nuova cella: lifeline_aligned_df.to_csv("path_to_desired_location/name_of_file.tsv", sep = "\t")
12. Ripetere i passaggi 4.5-4.11 con tutti gli esperimenti da includere nei confronti.

5. Confronto tra curve di gemmazione e dati di citometria a flusso

1. Tracciare le curve in erba prima dell'allineamento usando la funzione delle utilità Python immettendo il seguente comando in una nuova cella:
   plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, titolo = str_title)
   1. Sostituite un elenco contenente i frame di dati di tutte le curve di gemme desiderate per il plottaggio per list_of_budding_curves-[bud_df1, bud_df2 bud_df3].
   2. Sostituire un elenco di etichette per la legenda-[Esperimento 1, Esperimento 2, Mutante] per leg_list se lo si desidera. In caso contrario, escludere o sostituire Nessuno.
   3. Sostituisci il tempo per str_type.
   4. Se lo si desidera, sostituire il titolo della stringa Confronto Curve in erba con str_title . In caso contrario, sostituire Nessuno o escludere.
2. Tracciare le curve in erba dopo l'allineamento usando la funzione delle utilità Python seguendo le istruzioni nel passaggio 5.1, ma con un elenco di curve gemmeggianti allineate sostituite per list_of_budding_curves e con la linea di vita per point_type anziché per il tempo.
3. Per tracciare i dati della citometria a flusso, tracciare i dati associati dai file .fcs nei punti della linea vita corrispondenti utilizzando il convertitore generato nel passaggio 4.8.
4. Convertire i punti della linea vita nella fase del ciclo cellulare utilizzando la tabella dei convertitori (Tabella 1).
   NOTA: questo può anche essere tracciato seguendo le istruzioni nel passaggio 5.1, ma con fase per point_type anziché tempo.

6. Confronto dei dati sperimentali

1. Determinare l'elenco dei geni da tracciare nei grafici a linee in base alle informazioni della letteratura o ai geni di interesse per la ricerca.
2. Usare il plot_linegraph_comparison fornito nel file delle utilità Python per eseguire confronti grafici a linee sul frame di dati originale, allineato o allineato e interpolato digitando il comando seguente in una nuova cella:
   plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelista, point_type = str_type, titolo = str_title)
   1. Sostituire un elenco dei frame di dati degli esperimenti da confrontare per list_of_dfs.
      NOTA: i frame di dati possono essere non allineati o allineati; Tuttavia, il point_type corrispondente deve essere inserito nel punto 6.2.4.
   2. Sostituite un elenco dei titoli per ogni frame di dati nello stesso ordine dell'elenco dei frame di dati per list_for_legend.
   3. Sostituire un elenco dei nomi dei geni (che devono essere inclusi nell'indice dei frame di dati) da tracciare per genelist.
   4. Sostituite il tipo di punto con str_type. Utilizzare la linea di vita (l'impostazione predefinita è la scala dei punti della linea di vita) o la fase (la scala della linea di vita della fase del ciclo cellulare) per i frame di dati allineati nel passaggio 6.2.1 o il tempo per i frame di dati non allineati nel passaggio 6.2.1.
   5. Sostituire un titolo stringa facoltativo per str_title.
3. Determinare l'elenco dei geni da includere nella mappa di calore utilizzando la letteratura o gli algoritmi per determinare i geni periodici principali.
   NOTA: per un corretto confronto delle mappe di calore, i dati devono essere allineati, interpolati e regolati nella scala temporale nel passaggio 6.2; Dovrebbe avere lo stesso valore di linea di vita iniziale e finale per ogni esperimento.
   1. Eseguire algoritmi di periodicità per determinare i geni periodici principali^23,24 o utilizzare i metodi alternativi desiderati per determinare l'elenco dei geni (cioè i risultati della letteratura).
   2. Importare un file di elenco dei geni .csv o .tsv nel blocco appunti utilizzando il comando seguente in una nuova cella:
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv", sep="\t", index_col=0)
   3. Sostituire il percorso e il nome del file appropriati. Se il file è un file .csv, rimuovere sep="\t".
4. Usare la funzione fornita plot_heatmap_comparison nel file delle utilità Python per eseguire un confronto della mappa termica sul frame di dati allineato, interpolato e allineato in fase digitando il comando seguente in una nuova cella:
   plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelista, titolo = str_title)
   1. Sostituire un elenco dei frame di dati allineati degli esperimenti da confrontare per list_of_dfs.
   2. Sostituite un elenco dei titoli per ogni frame di dati nello stesso ordine dell'elenco dei frame di dati per list_for_legend.
   3. Sostituire un elenco dei nomi dei geni (che devono essere inclusi nell'indice dei frame di dati) da tracciare per genelist.
   4. Sostituire un titolo stringa facoltativo per str_title.
      NOTA: Il primo frame di dati nell'elenco è quello che verrà utilizzato per ordinare i geni nella mappa di calore. I geni saranno ordinati in base al massimo nel primo periodo per quel frame di dati e lo stesso ordine verrà utilizzato per i frame di dati successivi nell'elenco.

Results

I passaggi descritti nel protocollo di cui sopra e nel flusso di lavoro in Figura 1 sono stati applicati a cinque esperimenti di serie temporali sincronizzati con ciclo cellulare per dimostrare due confronti rappresentativi: tra repliche con diversi metodi di sincronia (feromone di accoppiamento ed elutriazione centrifuga¹⁸) e piattaforme di sequenziamento (sequenziamento dell'RNA [RNA-seq] e microarray), nonché in condizioni sperimentali. Sono stati eseguiti più espe...

Discussion

Questo articolo presenta un metodo per valutare in modo più accurato e quantitativo i dati provenienti da esperimenti di serie temporali su popolazioni sincronizzate di cellule. Il metodo utilizza i parametri appresi da CLOCCS, un modello di inferenza bayesiana che utilizza i dati di fase del ciclo cellulare di input, come i dati di gemmazione e i dati del contenuto di DNA citometrico a flusso, per parametrizzare ogni esperimento^14,15. CLOCCS utilizza i dati di f...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x PBS			per soluzione fissativa. Descritto in Leman 2014.
4% formaldeide			per soluzione fissativa.
100% etanolo			per la fissazione della citometria a flusso. Descritto in Haase 2002.
Citometro
flusso.
Git			https://git-scm.com/
Java 19
https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19 Microscopio			Per contare cellule e gemme.
Soluzione di Miniconda			https://docs.conda.io/en/latest/
Proteasi			Per il protocollo di citometria a flusso. Descritto in Haase 2002.
Soluzione RNAsi A			Per il protocollo di citometria a flusso. Descritto in Haase 2002.
SYTOX Colorazione verde per acido nucleico	Invitrogen	S7020	per la colorazione con citometria a flusso. Descritto in Haase 2002.
Tris			pH 7,5