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Articolo metodologico

Produzione di celle su larga scala basata su microcarrier porosi solubili di grado GMP

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DOI:

10.3791/65469

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7 luglio 2023

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1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, 2Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd.

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere la produzione su larga scala di cellule aderenti attraverso un sistema completamente chiuso basato su microcarrier solubili di grado GMP. La coltivazione di cellule staminali mesenchimali umane, cellule HEK293T e cellule Vero è stata convalidata e ha soddisfatto sia le richieste di quantità che i criteri di qualità per l'industria della terapia cellulare e genica.

Abstract

I ricercatori nel settore della terapia cellulare e genica (CGT) hanno affrontato a lungo una sfida formidabile nell'espansione efficiente e su larga scala delle cellule. Per affrontare le principali carenze del sistema di coltura planare bidimensionale (2D), abbiamo sviluppato in modo innovativo una piattaforma automatizzata di produzione di celle su scala industriale chiusa (ACISCP) basata su un microcarrier poroso e solubile di grado GMP per la coltura 3D di cellule aderenti, comprese le cellule staminali/stromali mesenchimali umane (hMSC), le cellule HEK293T e le cellule Vero. Per ottenere un'espansione su larga scala, è stata condotta un'espansione a due stadi con bioreattori a serbatoio agitato da 5 L e 15 L per produrre 1,1 x 1010 hMSC con un'espansione complessiva di 128 volte in 9 giorni. Le cellule sono state raccolte dissolvendo completamente i microcarrier, concentrate, lavate e formulate con un sistema di elaborazione cellulare basato su centrifuga a flusso continuo, e quindi aliquotate con un sistema di riempimento cellulare. Rispetto alla coltura planare 2D, non ci sono differenze significative nella qualità delle hMSC raccolte dalla coltura 3D. Abbiamo anche applicato questi microcarrier porosi solubili ad altri tipi di cellule popolari nel settore CGT; in particolare, le cellule HEK293T e le cellule Vero sono state coltivate per raggiungere densità cellulari di picco rispettivamente di 1,68 x 10 7 cellule/mL e 1,08 x 107 cellule/mL. Questo studio fornisce un protocollo per l'utilizzo di una piattaforma di ingegneria dei bioprocessi che sfrutta le caratteristiche dei microcarrier solubili di grado GMP e delle apparecchiature chiuse avanzate per ottenere la produzione su scala industriale di cellule aderenti.

Introduzione

L'industria CGT ha assistito a un'espansione esponenziale negli ultimi due decenni. Si prevede che l'evoluzione dei farmaci di nuova generazione tratterà e curerà numerose malattie refrattarie1. Dalla prima approvazione da parte della Food and Drug Administration (FDA) di un prodotto CGT, Kymriah, nel 2017, la ricerca e lo sviluppo relativi alla CGT nel mondo hanno continuato a crescere a un ritmo rapido, con la FDA che ha visto aumentare a 500 le domande di nuovi farmaci sperimentali attivi per CGT nel 20182. Era stato previsto che il numero di approvazioni dei prodotti CGT sarebbe stato probabilmente di 54-74 negli Stati Uniti entro il 20302.

Mentre la rapida crescita della ricerca e dell'innovazione CGT è entusiasmante, c'è ancora un grande divario tecnologico tra la ricerca di laboratorio e la produzione su scala industriale che potrebbe fornire questi farmaci promettenti per raggiungere il maggior numero di pazienti necessari a costi accessibili. Gli attuali processi adottati per questi studi clinici sono stati stabiliti in laboratori per esperimenti su piccola scala e sono necessari sforzi significativi per migliorare e innovare la produzione CGT3. Esistono molti tipi di prodotti CGT, la maggior parte dei quali basati su cellule vive, che possono essere allogenici, autologhi, ingegnerizzati o naturali. Questi farmaci viventi sono molto più complessi delle piccole entità molecolari o dei farmaci biologici, rendendo quindi la produzione su larga scala una sfida significativa 4,5,6. In questo lavoro, dimostriamo un protocollo di produzione cellulare su larga scala per tre cellule dipendenti dall'ancoraggio che sono ampiamente applicate nelle CGT. Questi includono le cellule staminali/stromali mesenchimali umane (hMSC), che sono state utilizzate per la terapia cellulare, e le cellule HEK293T e le cellule Vero, entrambe utilizzate per produrre virus per l'ingegneria genetica del prodotto cellulare terapeutico finale. Le cellule dipendenti dall'ancoraggio sono comunemente coltivate su sistemi planari, che richiedono un'elaborazione manuale. Tuttavia, i metodi di coltura manuale richiedono una notevole quantità di manodopera e sono soggetti a contaminazione, che può compromettere la qualità del prodotto finale. Inoltre, non vi è alcun controllo di processo in linea, il che porta a una sostanziale variabilità della qualità tra i lotti7. Prendendo come esempio la terapia con cellule staminali, con una promettente pipeline di oltre 200 candidati alla terapia con cellule staminali, si stima che sarebbero necessari 300 trilioni di hMSC all'anno per soddisfare le esigenze delle applicazioni cliniche8. Quindi, la produzione su larga scala di cellule terapeutiche è diventata un prerequisito per eseguire questi interventi terapeutici con una domanda cellulare così elevata9.

Per evitare le battute d'arresto dei sistemi planari, sono stati compiuti sforzi per sviluppare processi di produzione su larga scala in bioreattori a serbatoio agitato con microvettori convenzionali non solubili 10,11,12,13, ma questi soffrono di complicate procedure di preparazione e bassa efficienza di raccolta cellulare 14. Recentemente, abbiamo innovato un microcarrier solubile per l'espansione delle cellule staminali, con l'obiettivo di aggirare le sfide della raccolta cellulare da microcarrier commerciali convenzionali non solubili15. Questo nuovo microcarrier poroso solubile 3D di grado GMP, disponibile in commercio, 3D TableTrix, ha mostrato un grande potenziale per la produzione di cellule su larga scala. Infatti, la coltura 3D basata su questi microvettori porosi potrebbe potenzialmente ricreare microambienti biomimetici favorevoli per promuovere l'adesione, la proliferazione, la migrazione e l'attivazione cellulare16. Le strutture porose e le reti interconnesse di pori dei microvettori potrebbero creare un'area di adesione cellulare più ampia e promuovere lo scambio di ossigeno, nutrienti e metaboliti, creando così un substrato ottimale per l'espansione cellulare in vitro 17. L'elevata porosità di questi microcarrier porosi solubili 3D di grado GMP consente l'espansione su larga scala delle hMSC e la capacità delle cellule di essere completamente disciolte consente la raccolta efficiente di queste cellule espanse18. È anche un prodotto di grado GMP ed è stato registrato come eccipiente farmaceutico presso il Centro cinese per la valutazione dei farmaci (numeri di deposito: F20210000003 e F20200000496)19 e la FDA degli Stati Uniti (FDA, USA; Numero di Drug Master File: 35481)20.

Qui, illustriamo un sistema automatizzato di produzione di celle su scala industriale chiusa (ACISCP)18 che utilizza questi microvettori porosi dispersibili e solubili per l'espansione di hMSC, HEK293T celle e celle Vero. Abbiamo ottenuto con successo un'espansione a due livelli di hMSC (128 volte l'espansione cumulativa in 9 giorni) da un bioreattore da 5 L a un bioreattore da 15 L e infine abbiamo ottenuto fino a 1,1 x 1010 hMSC da un singolo lotto di produzione. Le cellule sono state raccolte dissolvendo completamente i microcarrier, concentrate, lavate e formulate con un sistema di trattamento cellulare basato su centrifuga a flusso continuo, e quindi aliquotate con un sistema di riempimento cellulare. Inoltre, abbiamo valutato la qualità dei prodotti hMSC per confermarne la conformità. Abbiamo anche dimostrato l'applicazione di questi microcarrier solubili per la produzione su larga scala di altri due tipi di celle di ancoraggio, le celle HEK293T e le celle Vero, che sono ampiamente applicate nell'industria CGT. La densità cellulare di picco delle cellule HEK293T ha raggiunto 1,68 x 107 cellule/mL, mentre la densità di picco delle cellule Vero ha raggiunto 1,08 x 107 cellule/mL. Il sistema ACISCP potrebbe essere adattato per coltivare una varietà di cellule aderenti e potrebbe potenzialmente diventare una potente piattaforma che contribuisce ad accelerare l'industrializzazione della CGT.

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Protocollo

Il cordone ombelicale umano è stato ottenuto dall'ospedale Tsinghua Changgeng di Pechino. Tutte le procedure e i protocolli relativi all'acquisizione, all'isolamento e alla coltura di cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale umano (UCMSC) sono stati condotti con il consenso informato e con l'approvazione del Comitato Etico dell'Ospedale Tsinghua Changgeng di Pechino (numero di deposito 22035-4-02), e le procedure e i protocolli sono conformi alla dichiarazione di Helsinki del 1964 e ai suoi successivi emendamenti o a standard etici comparabili.

1. Coltura monostrato di hMSC, cellule HEK293T e cellule Vero

  1. Isolare le UCMSC umane primarie dalla gelatina di Wharton secondo il metodo21 riportato. Utilizzare terreno di coltura hMSC privo di siero (SF) per l'isolamento e la crescita delle UCMSC primarie, raccogliere le cellule al passaggio 2 e crioconservare come banca di cellule master (MCB).
  2. Inoculare 6 x 105 UCMSC umane (preferibilmente cellule di passaggio 2 o 3) in un matraccio T75 (cioè la densità di semina su recipienti planari 2D è di 8.000 cellule/cm2) per la coltura monostrato con 15 mL di terreno di coltura SF hMSC completo. Garantire una semina uniforme attraverso un movimento a forma di otto del pallone. Coltura a 37 °C in incubatore per colture cellulari al 5% di CO2 all'80%-90% di confluenza.
  3. Per la raccolta, decantare il terreno di coltura cellulare e sciacquare le cellule con 3-5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) due volte. Quindi, aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% e incubare a 37 °C per 1-2 minuti fino a quando la maggior parte delle cellule è diventata rotonda e si è staccata dal pallone, come osservato con un microscopio invertito in campo chiaro con un obiettivo 4x. Aggiungere 3 mL di terreno di coltura SF hMSC per terminare la digestione.
  4. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga conica da 15 mL e centrifugare a 179 x g per 5 minuti. Decantare il surnatante, sciacquare due volte il pellet cellulare con PBS e risospendere in circa 3-5 mL di terreno di coltura SF hMSC per la semina su microvettori in bioreattori.
    NOTA: Controllare la vitalità delle celle e assicurarsi che le cellule siano vitali al >90%. Preparare le cellule solo dopo aver completato tutto il lavoro di preparazione per i bioreattori (passaggi 2.1-3.6).
  5. Per la coltura monostrato di cellule HEK293T e cellule Vero, inoculare in 2 x 10 6-3 x 106 cellule in ciascun matraccio T75 e colare con DMEM contenente rispettivamente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e il 10% di siero di vitello neonato (NBS).
  6. Segui i passaggi 1.3-1.4 per raccogliere le cellule. Risospendere in 3-5 mL di DMEM contenente il 10% di FBS.

2. Preparazione del bioreattore a vasca agitata prima della semina cellulare

  1. Il giorno −1, sciacquare accuratamente il recipiente di vetro con acqua corrente deionizzata (DI) una volta.
  2. Smontare tutti i tubi e le giranti in acciaio inossidabile dalla piastra di testata, immergerli in acqua deionizzata e sonicare con un pulitore a ultrasuoni a 40 kHz e 60 °C per 1 ora per pulire accuratamente.
    NOTA: I preparativi e le procedure saranno gli stessi per l'espansione di primo livello nel bioreattore da 5 L e per l'espansione di secondo livello nel bioreattore da 15 L. I parametri per il bioreattore da 15 L sono riportati tra parentesi. Se non sono indicati parametri tra parentesi, questi parametri sono gli stessi per i bioreattori da 5 L e 15 L.
  3. Controllare attentamente che tutti gli O-ring siano intatti e in posizione, quindi reinstallare le parti smontate sulla piastra di testa secondo le istruzioni del produttore.
    NOTA: Se necessario, sostituire eventuali O-ring usurati o strappati prima del montaggio. Gli O-ring usurati comprometteranno la tenuta all'aria e, quindi, la sterilità del recipiente.
  4. Aggiungere 7 L (18 L per il bioreattore da 15 L) di soluzione di NaOH 0,5 M nel recipiente da 5 L e posizionare la piastra di testa con i tubi assemblati sul bordo del recipiente per immergere i tubi nella soluzione di NaOH. Lasciare riposare per 12 ore o per tutta la notte per rimuovere le endotossine dalle provette e dal recipiente di vetro.
    NOTA: Non superare i 7 L (18 L) poiché questo è il volume massimo del recipiente di vetro da 5 L (15 L). Indossare dispositivi di protezione individuale adeguati quando si maneggia la soluzione di NaOH, poiché è corrosiva.
  5. Rimuovere la piastra di testa e travasare la soluzione di NaOH in un apposito flacone di scarto. Smaltire secondo le norme di sicurezza del laboratorio. Sciacquare accuratamente il recipiente, la piastra della testa e le sue parti con acqua deionizzata priva di endotossine o acqua per preparazioni iniettabili per rimuovere i residui alcalini.
  6. Aggiungere 2 L (5 L) di PBS al recipiente, rimontare tutte le parti e avvitare la piastra di testa al telaio metallico del recipiente secondo le istruzioni del produttore.
  7. Montare un pacchetto di consumabili del sistema chiuso sulle parti/tubi/porte in acciaio inossidabile (SS) appropriati sulla piastra della testa secondo le istruzioni del produttore. Bloccare tutti i morsetti Robert sui tubi e si consiglia di rinforzare bloccando con emostatici. Lasciare sbloccato uno dei tubi, con un filtro di sfiato dell'aria da 0,22 μm all'estremità collegato al condensatore.
    NOTA: Infilare i tubi di silicone sulle punte sugli emostatici per evitare di perforare i tubi di silicone. Clamp solo sui tubi in silicone ed evitare di clamp i tubi C-flex inclusi in questo kit. Lasciare un tubo sul condensatore sbloccato consentirà lo scarico della pressione durante la sterilizzazione in autoclave.
  8. Preparare 250 mL di soluzione di NaOH 0,1 M in una bottiglia di vetro GL 45 autoclavabile da 500 mL e inserire un tappo a vite per connettore multiporta GL 45 con due porte. Collegare un tubo in silicone lungo 180 mm, 0.13 pollici x 0.25 pollici (diametro interno x diametro esterno) su una delle porte sul lato inferiore del cappuccio; La lunghezza dovrebbe essere abbastanza lunga da toccare appena il fondo della bottiglia.
  9. Collegare un altro pezzo di tubo in silicone, con una lunghezza di 500 mm più lunga del precedente, alla stessa porta sul lato superiore del tappo e collegare l'altra estremità a una porta di alimentazione a goccia sulla piastra di testa del serbatoio da 5 L. Collegare un filtro di sfiato dell'aria da 0.22 μm all'altra porta sul tappo a vite.
  10. Eseguire una calibrazione a due punti sulla sonda di pH secondo le istruzioni del produttore. Quindi, inserire le sonde di pH, ossigeno disciolto (DO) e conta delle cellule vive nel recipiente nelle porte PG13,5 appropriate e avvitare saldamente sulla piastra della testata.
  11. Eseguire un controllo di tenuta all'aria del recipiente completamente assemblato secondo le istruzioni del produttore. Mantenere una pressione di 0,4 bar ± 0,01 bar per almeno 30 min. Rilasciare lentamente la pressione dopo che il sistema ha superato il test. Se il test di tenuta all'aria fallisce, cercare attentamente i punti di perdita e rinforzare il gruppo del recipiente.
  12. Autoclavare il recipiente completamente assemblato con il kit di consumo a 15 psi e 121 °C per 60 min. Dopo la sterilizzazione in autoclave, controllare tutti i filtri di sfiato dell'aria per assicurarsi che siano intatti e asciutti. Rimuovere tutti gli emostatici.
    NOTA: Un filtro di sfiato dell'aria umida non filtrerà il gas in modo efficiente e potrebbe compromettere la sterilità del recipiente durante la coltura cellulare. Sostituire i filtri di sfiato dell'aria se sono bagnati e sterilizzare nuovamente in autoclave l'intero serbatoio.
  13. Trasferire il recipiente autoclavato in una camera bianca e attendere che si raffreddi completamente a temperatura ambiente. Inserire la sonda di temperatura nel tubo del pozzetto e collegare i cavi per il motore, la sonda pH e la sonda DO dal controller alle rispettive parti sul recipiente. Avvolgere saldamente il tappetino termico attorno al recipiente.
  14. Sganciare i morsetti Robert sui tubi flessibili sul condensatore dei gas di scarico, sullo sparger ad anello, sulla porta di alimentazione a goccia per NaOH e sulla porta di sovrapposizione dell'aria. Accendere il controller, accedere e inserire i parametri elencati nella Tabella 1 nel sistema secondo le istruzioni del produttore. Queste provette non devono essere bloccate in nessun momento durante il processo di coltura.
  15. Fare clic su Start e assegnare un nome all'esperimento per avviare il bioreattore. Lasciare che il bioreattore funzioni con queste impostazioni per almeno 12 ore, o durante la notte, per saturare il PBS con ossigeno al fine di eseguire una calibrazione a un punto per la sonda DO in un secondo momento.
  16. Calibrare la velocità del volume di manipolazione dei liquidi della pompa 1 e della pompa 2 sul controller del bioreattore. Installare separatamente un tubo in silicone da 0.13 pollici x 0.25 pollici su ciascuna pompa, con un'estremità immersa in una bottiglia d'acqua e l'altra estremità del tubo inserita in un cilindro graduato.
  17. Impostare la velocità di rotazione della pompa a 300 giri/min e il tempo per 1 minuto. Annotare la quantità di acqua erogata nel cilindro graduato per entrambe le pompe. Questi numeri saranno necessari per i passaggi successivi.
  18. Preparare 500 mL di terreno di coltura SF hMSC secondo le istruzioni del produttore e sostituire il tappo del flacone del terreno di coltura cellulare con una chiusura monouso per contenitore C-Flex EZ Top e un tappo compatibile. Eseguire la sostituzione del tappo all'interno di una cabina di sicurezza biologica (BSC).
  19. Saldare il tubo di uscita del flacone di terreno al tubo C-flex di ingresso del flacone da 10 g di microcarrier W01 presterilizzati per MSC. Installare una sezione del tubo sulla pompa 1 del controller del bioreattore, impostare la rotazione della pompa a 300 giri/min e pompare tutto il terreno di coltura dal flacone al flacone dei microcarrier. Conservare questi microcarrier a 4 °C fino all'uso il giorno 0.
    NOTA: I microcarrier devono essere preparati il giorno −1. Per la coltura del bioreattore da 15 L, preparare quattro flaconi (cioè 40 g, con 4 x 500 mL di terreno SF) in totale.

3. Semina, coltura e raccolta cellulare in un bioreattore a serbatoio agitato da 5 L

  1. Il giorno 0, eseguire una calibrazione a un punto, in particolare al 100%, per la sonda DO sul controller del bioreattore secondo le istruzioni del produttore. Il bioreattore a vasca agitata è ora pronto per la coltura cellulare.
  2. Preparare una bottiglia di vetro da 2 L (5 L) per la raccolta dei rifiuti, dotarla di un tappo a vite per connettore multiporta GL 45 con due porte, con tubi C-Flex da 30 mm, 0.25 pollici x 0.44 pollici collegati a entrambe le porte e autoclave per sterilizzare. Saldare il tubo C-flex da una delle porte dalla bottiglia di scarico al tubo di raccolta sulla piastra di testa del contenitore del bioreattore con una saldatrice per tubi.
  3. Interrompere temporaneamente il controllo della temperatura, del pH e dell'ossigeno disciolto sul controller del bioreattore, installare il tubo di silicone collegato al tubo di raccolta sulla pompa peristaltica 2 nella corretta direzione del flusso del liquido ed erogare completamente tutto il PBS dal recipiente nella bottiglia di scarto. Rimuovere il tubo dalla pompa e sigillare e scollegare la bottiglia di scarico.
    NOTA: Sganciare sempre eventuali Robert clamps sui tubi flessibili coinvolti nel flusso del liquido in ogni fase. Clamp indietro dopo che il trasferimento del liquido è stato completato prima di sigillare e scollegare. Clamp più vicino al lato della piastra della testata. Lo sbloccaggio e il bloccaggio devono essere eseguiti per tutte le fasi successive, salvo diversa indicazione.
  4. Preparare 7 L (30 L) di terreno SF hMSC completo e sostituire ogni tappo di bottiglia originale con una chiusura per contenitore C-Flex EZ Top monouso e un tappo compatibile. Saldare un modulo di filtrazione monouso a una delle porte della custodia monouso da 10 L (50 L). Eseguire l'operazione di sostituzione dei tappi all'interno di un BSC.
  5. Filtrare e trasferire il terreno di coltura nel sacchetto di conservazione, un flacone alla volta, saldando i flaconi di terreno di coltura cellulare all'altra estremità del filtro della capsula e utilizzando la pompa sul controller del bioreattore. Designare come sacchetto di alimentazione.
  6. Saldare una porta di uscita dal sacchetto di alimentazione al tubo C-flex sul tubo di alimentazione della piastra di sterzo e installare il tubo alla pompa 1 sul controller del bioreattore. Saldare l'altra porta di uscita dal sacchetto di alimentazione al tubo di spurgo e installare il tubo per pompare 2 sul controller del bioreattore nella direzione corretta del flusso del liquido.
    NOTA: Installare la sezione sulla linea di flusso del fluido, realizzata con tubi in silicone, sulla pompa per una migliore resistenza all'usura rispetto ai tubi C-Flex. Assicurarsi che i tubi siano installati nella direzione corretta.
  7. Impostare la velocità della pompa 1 su 300 giri/min e arrestare la pompa dopo aver erogato 1 L (5 L) di fluido dal sacchetto di alimentazione nel recipiente, in base alla velocità di erogazione del volume indicata al punto 2.17. Riavviare il controllo della temperatura, del pH e dell'ossigeno disciolto, con le stesse impostazioni descritte al punto 2.14.
  8. Sigillare e scollegare il tubo che collega il sacchetto di alimentazione al tubo di alimentazione sulla piastra di sterzo. Saldare il tubo C-Flex dal flacone dei microcarrier dispersi preparati al punto 2.18 al tubo di alimentazione e pompare tutto il contenuto dal flacone nel recipiente. Sigillare e scollegare il flacone vuoto della sospensione del microcarrier. Disinfettare l'intera superficie del flacone con etanolo al 75% e metterlo in un BSC da utilizzare come flacone per il trasferimento di sospensioni cellulari.
    NOTA: Lasciare un pezzo più lungo di tubo C-Flex sul lato della piastra di testa durante la sigillatura e lo scollegamento degli accessori monouso, poiché verranno eseguite più fasi di saldatura e scollegamento sullo stesso tubo nei passaggi successivi.
  9. Assicurarsi che la temperatura indicata sul controller raggiunga uno stato stazionario di 37 °C, che di solito richiede circa 30 minuti, prima di procedere alla preparazione delle celle del seme come nei passaggi 1.3-1.4. Risospendere 2,5 x 108 hMSC in 500 mL di terreno SF e trasferire nel flacone vuoto precedentemente contenente la sospensione del microcarrier.
    NOTA: Le cellule seme per l'espansione del bioreattore da 15 L devono essere preparate secondo la fase 3.21, con l'obiettivo di inoculare 1,0 x 109 cellule in 500 mL.
  10. Saldare il tubo C-Flex dal flacone che ora contiene la sospensione cellulare alla porta di alimentazione sulla piastra di testa e pompare tutto il contenuto dal flacone nel recipiente per avviare l'inoculazione cellulare ai microcarrier. Sigillare e scollegare il flacone vuoto. Risaldare la porta di alimentazione dal sacchetto di alimentazione al tubo di alimentazione sulla piastra di sterzo.
  11. Regolare le impostazioni di agitazione sul controller per consentire l'agitazione intermittente per una maggiore efficienza di inoculazione delle hMSC impostando i seguenti parametri: V1 = 35 (30) giri/min/5 min; V2 = 0 giri/min/25 min; numero di cicli = 12 (24); Velocità di agitazione finale = 35 (30) giri/min.
    NOTA: La velocità di agitazione può essere regolata a 40 (35) giri/min o 45 (40) giri/min se si osserva una distribuzione o una sedimentazione non uniforme dei microvettori durante il processo di coltura.
  12. Impostare un regime automatizzato di integrazione e sostituzione del mezzo sul controller del bioreattore nell'interfaccia di scambio del fluido. Impostare i parametri per la coltivazione dell'hMSC come indicato nella Tabella 2.
    NOTA: Sbloccare eventuali morsetti Robert sui tubi flessibili coinvolti nel flusso del liquido in questa fase, in particolare per il tubo di alimentazione e spurgo. Tienili sbloccati durante l'intero processo di coltura.
  13. Prelevare i campioni attraverso la provetta di campionamento collegando le sacche di campionamento monouso tramite connettori Luer nei punti temporali desiderati, di solito una volta al giorno, e aliquotando 10 mL ogni volta nella sacca di campionamento. Aliquotare 2-3 mL di campione nella prima sacca di campionamento, scartare, quindi aliquotare ogni volta i 10 mL effettivi di campione in una nuova sacca di campionamento.
    NOTA: Il campione iniziale di 2-3 mL potrebbe essere liquido lasciato nella provetta dal precedente punto di campionamento e potrebbe non rappresentare accuratamente le condizioni nel recipiente. Eseguire sempre questi passaggi con misure extra asettiche disinfettando i connettori Luer prima e dopo aver effettuato o interrotto i collegamenti con etanolo al 75%.
  14. Trasferire i campioni prelevati in una provetta da centrifuga conica da 15 mL. Eseguire i seguenti test sui campioni.
    1. Prelevare 200 μL della sospensione di microcarrier carica di cellule e colorare con Calcein-AM/PI Cell Double Staining secondo le istruzioni del produttore. Osservare al microscopio a fluorescenza.
    2. Sedimentare i microvettori per gravitazione, che di solito richiede 5-10 minuti. Aspirare il surnatante e testare la concentrazione di glucosio con un glucometro secondo le istruzioni del produttore. Traccia un grafico del livello di glucosio.
    3. Incubare i microcarrier sedimentati carichi di cellule con 3-5 mL di soluzione digesta da 1 mg/mL a 37 °C appena preparati per 20-30 minuti per sciogliere completamente i microcarrier. Contare le cellule dopo la colorazione con AO/PI con un analizzatore automatico di celle a fluorescenza. Tracciare una curva di crescita delle cellule. Correlare con la curva di crescita delle cellule vive in tempo reale generata sul controller.
  15. Il giorno 4 o il giorno 5 della coltura, preparare 50 ml (200 ml) di soluzione digestativa a 30 mg/ml. Il rapporto di massa di lavoro tra la soluzione digestata e i microcarrier solubili varia da 3:20 a 5:20. Filtro sterile con capsula da 0,22 μm e ulteriore diluizione in 500 mL (2 L) di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con calcio e magnesio. Trasferire in una custodia monouso da 3 litri.
    NOTA: Preparare la soluzione digestativa solo appena prima del prelievo delle cellule. Cerca di puntare ad almeno 1,0 x 10 9-1,2 x 109 celle per l'espansione di primo livello e 1,0 x 10celle per l'espansione di secondo livello. Se le cellule crescono più velocemente, raccogli al giorno 4; In caso contrario, raccogli al giorno 5. Si sconsiglia di andare oltre il giorno 5.
  16. Impostare la velocità di agitazione su 0 sul controller per far sedimentare i microcarrier, cosa che di solito avviene entro 20 minuti. Disattivare il protocollo di scambio automatico del fluido e interrompere il controllo della temperatura, del pH e dell'ossigeno disciolto sul controller del bioreattore. Avviare manualmente la pompa 2 a 300 giri/min sul controller ed erogare il surnatante nel regime di alimentazione per lasciare circa 1 L (2 L) di sospensione di coltura nel recipiente (utilizzando la velocità di erogazione del volume indicata al punto 2.17 o misurando dai segni di graduazione sul corpo del recipiente). Sigillare e scollegare completamente il sacchetto di alimentazione.
  17. Saldare il sacchetto di soluzione digestativa appena preparata dal passaggio 3.15 al tubo di alimentazione e pompare tutto il contenuto nel recipiente. Avviare la velocità di agitazione a 45 (40) giri/min. Assicurarsi che il controllo della temperatura mantenga ancora la temperatura a 37 °C. I microcarrier si dissolvono entro 40-60 minuti. Prelevare 1 mL del campione con una siringa Luer lock sterile a 30 minuti e successivamente ogni 5-10 minuti per osservare al microscopio in campo chiaro per verificare la dissoluzione dei microcarrier.
  18. Dopo che i microvettori si sono dissolti, saldare un sacchetto di stoccaggio da 3 L (due sacchetti di stoccaggio da 3 L per il bioreattore da 15 L) al tubo di raccolta e pompare completamente la sospensione cellulare utilizzando la pompa 2 a 300 giri/min. Preparare 1 L (3,5 L) di soluzione fisiologica contenente l'1% di albumina sierica umana (HSA) come tampone di lavaggio e 500 mL di terreno SF completo (500 ml di tampone di crioconservazione cellulare, come esempio una formulazione di 10% di dimetilsolfato (DMSO) e terreno SF al 90%) in sacchetti di conservazione monouso separati utilizzando i metodi e gli accessori menzionati nei passaggi precedenti per altri trasferimenti di liquidi.
  19. Accendere il sistema di elaborazione delle cellule, installare un kit di elaborazione cellulare monouso sullo strumento secondo le istruzioni del produttore, saldare i sacchetti di sospensione cellulare, tampone di lavaggio e mezzo SF (tampone di crioconservazione) al kit di elaborazione cellulare monouso e seguire attentamente tutte le istruzioni visualizzate sull'interfaccia utente per inizializzare e verificare l'integrità e la corretta installazione del kit.
  20. Una volta completata l'installazione, inserire nel software i parametri elencati in Tabella 3 per il lavaggio delle celle con tampone di lavaggio e la risospensione in mezzo SF (tampone di crioconservazione) per avviare il processo di lavaggio e risospensione. L'intera procedura verrà eseguita automaticamente con diversi punti di controllo manuali.
  21. Prelevare un campione di cellule dalla camera della centrifuga, come indicato dal sistema di elaborazione delle celle, e calcolare la densità delle celle con un analizzatore di celle automatizzato secondo le istruzioni del produttore. Regolare il volume di risospensione per una densità di 2 x 106 cellule/mL o un volume totale massimo di 250 mL.
  22. Sigillare e scollegare la sacca di trasferimento delle cellule dal kit di elaborazione cellulare monouso dopo che il sistema ha aspirato le cellule dalla camera. Se necessario, regolare nuovamente la densità cellulare a 2 x 106 cellule/mL con terreno SF completo in una sacca di trasferimento cellulare più grande/sacca di conservazione media. Queste saranno le cellule seme per l'espansione di secondo livello nel bioreattore da 15 L.

4. Formulazione, riempimento e finitura delle cellule

  1. Iniziare a preparare il bioreattore da 15 L 1 giorno prima del prelievo di cellule dal bioreattore da 5 L. Seguire completamente i passaggi nelle sezioni 2 e 3 del protocollo, ad eccezione dei parametri per 15 L indicati tra parentesi.
  2. Risospendere le cellule in 250 mL di tampone di crioconservazione e sigillare e scollegare la sacca di trasferimento cellulare dal kit di trattamento cellulare monouso dopo che il sistema ha aspirato le cellule dalla camera.
  3. Trasferire 2.000 mL di tampone di crioconservazione insieme ai 250 mL di cellule risospese dalla fase 4.2 a una sacca di trasferimento cellulare da 3 L. Saldare questa sacca di trasferimento a un kit di materiali di consumo monouso Fill&Finish.
    NOTA: Il volume aggiuntivo del tampone di crioconservazione utilizzato qui deve essere determinato dalle specifiche della formulazione e dal calcolo del numero totale di cellule in base ai risultati del conteggio ottenuti nel passaggio 3.21
  4. Assemblare il kit di materiali di consumo monouso Fill&Finish al sistema di riempimento delle celle e accendere il sistema di preraffreddamento secondo le istruzioni del produttore. Seguire le istruzioni sul sistema e impostare il riempimento di 20 ml/sacchetto per un totale di 20 sacchetti per lotto. Sigillare e scollegare queste sacche dal kit e seguire le procedure standard di crioconservazione. Utilizzare sacchetti per la crioconservazione.
  5. Saldare un nuovo set di 20 sacche di crioconservazione al kit di consumo monouso Fill&Finish e ripetere la procedura di riempimento e finitura fino a quando tutte le cellule non sono aliquote. Seguire le procedure standard per crioconservare queste cellule.

5. Caratterizzazione della qualità cellulare

  1. Campionare le hMSC raccolte dai microcarrier solubili e utilizzare un sistema di processamento cellulare per la caratterizzazione mediante citometria a flusso per la determinazione dell'identità cellulare seguendo i metodi descritti in letteratura18.
  2. Scongelare le cellule crioconservate e riplaccare su matracci o micropiastre 2D convenzionali per un'ulteriore caratterizzazione delle caratteristiche cellulari, inclusa la morfologia cellulare e la capacità di differenziamento a tre linee, seguendo i metodi descritti in letteratura18.

6. Espansione HEK293T su microcarrier G02 nel bioreattore a serbatoio agitato

  1. Preparare un bioreattore da 5 L come indicato al punto 2. Per HEK293T cellule, coltivare le cellule con microcarrier sterili G02 invece di W01. Il processo di coltura è simile a quello descritto nella sezione 3 del protocollo, anche se alcuni parametri sono diversi, come verrà illustrato in dettaglio nei passaggi seguenti. Installare una speciale provetta di perfusione nel bioreattore in sostituzione del tubo di spurgo, poiché la perfusione è necessaria per la coltura di cellule HEK293T.
  2. A differenza del protocollo descritto nella sezione 3 del protocollo, preparare 20 g di microcarrier G02 (cioè due flaconi) in DMEM con FBS al 10% per il bioreattore da 5 L, con il volume di coltura del giorno 0 fissato a 3,5 L (cioè una concentrazione finale di circa 5,71 g/L). Erogare 2 L di terreno nel recipiente prima dei due flaconi di microcarrier G02 e inoculare 500 mL di 1,75 x 109 HEK293T cellule (cioè ad una densità finale di 5 x 105 cellule/mL).
  3. Eseguire un regime di agitazione e un regime di scambio del terreno (in base alla quantità di terreno che deve essere scambiata al giorno, espressa come volume di coltura al giorno, CVD), che è diverso dalla sezione 3 del protocollo ed è dettagliato nella Tabella 4.
    NOTA: Attivare manualmente la pompa 1 e la pompa 2 in modo che entrambe possano pompare continuamente per la perfusione. Regolare la velocità della pompa ogni giorno per soddisfare la velocità di perfusione in base alla calibrazione della velocità di erogazione del volume delle pompe. Di solito, questo sarà nell'intervallo a una cifra. Per HEK293T cellule, utilizzare un terreno fresco come mangime e gettare il terreno esausto completamente in una bottiglia di scarto, a differenza delle hMSC, per le quali il terreno viene fatto circolare.
  4. Per l'espansione di secondo livello del bioreattore da 15 L, utilizzare il trasferimento da microsfere a perle delle celle HEK293T invece della dissoluzione completa dei microvettori come utilizzato con le hMSC. In particolare, interrompere l'agitazione per sedimentare i microvettori dopo aver raggiunto la densità cellulare desiderata, quindi aspirare quanto più surnatante possibile dal tubo di perfusione, alimentare PBS con 3 volte il volume di sospensione rimanente per lavare i microvettori e ripetere tre volte. Aspirare e scartare quanto più PBS possibile nel lavaggio finale.
  5. Somministrare 3,5 L di tripsina ricombinante 1x per staccare le cellule dai microcarrier mentre i microcarrier G02 rimangono intatti. Impostare la temperatura a 37 °C e la velocità di agitazione a 60 giri/min. Terminare il distacco entro 45 minuti, quando più dell'80% delle cellule si è staccato, con una quantità uguale di terreno completo.
  6. Trasferimento direttamente dal porto di raccolta a un recipiente da 15 L preparato per l'espansione di secondo livello.

7. Espansione cellulare Vero su microcarrier V01 nel bioreattore a serbatoio agitato

  1. Preparare i microcarrier V01 trasferendo i microcarrier liofilizzati nel contenitore del bioreattore insieme al PBS a una concentrazione di 20 mg/mL. Assemblare e sterilizzare il recipiente come indicato nella sezione 2 del protocollo, ma sterilizzarlo in autoclave per 30 minuti.
  2. Dopo la sterilizzazione, i microcarrier V01 si stabilizzano naturalmente. Sostituire il surnatante con DMEM basico due volte utilizzando le provette di spurgo e di alimentazione e aggiungere il DMEM completo contenente il 10% di NBS al 50%-75% del volume del recipiente prima di procedere alla sezione 3 del protocollo per l'inoculazione e la coltura cellulare.
  3. A differenza del protocollo descritto nella sezione 3 del protocollo, utilizzare 24 g di microcarrier V01 per una coltura di 4 L di cellule Vero (cioè una concentrazione finale di 6 g/L) e inoculare 500 mL di 4 x 109 cellule Vero (cioè a una densità finale di 1 x 106 cellule/mL).
  4. Seguire i passaggi 6.3-6.6 per i parametri del processo di coltura e il passaggio all'espansione di secondo livello nel bioreattore a serbatoio agitato da 15 litri.

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Risultati

La piattaforma ACISCP è un sistema completamente chiuso che impiega una serie di bioreattori a serbatoio agitato per l'espansione dello scale-up, un sistema di elaborazione cellulare per la raccolta e la formulazione automatizzata delle cellule e un sistema di riempimento delle cellule (Figura 1). Le cellule aderenti si attaccano ai microcarrier porosi, che possono essere dispersi nel bioreattore, ottenendo così la coltivazione in sospensione delle cellule aderenti.

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Discussione

Sia l'immunoterapia che la terapia con cellule staminali utilizzano cellule vive come farmaci; Tuttavia, i loro prodotti finali non devono essere purificati o sterilizzati allo stesso modo delle piccole molecole o dei virus. Pertanto, il principio della Quality by Design (QbD) dovrebbe essere sempre tenuto presente e applicato praticamente al processo di produzione e controllo chimico (CMC) durante la produzione di celle23. Un sistema di coltura a cellule completamente chiuso, nonché un sistema di...

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Dichiarazioni

Y.D. è un consulente scientifico e H.X., Y.Z., L.G., M.L., Y.Y., W.L. e X.Y. sono dipendenti di Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. Gli altri autori non hanno alcun interesse commerciale, proprietario o finanziario nei prodotti o nelle aziende descritte in questo articolo. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla National Science Foundation for Distinguished Young Scholars (82125018).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,25% tripsina EDTABasalMediaS310JVUtilizzato per la raccolta di cellule 2D.
3D FloTrix DigestCytoNiche BiotechR001-500Si tratta di un reagente che dissolve specificamente i microcarrier 3D TableTrix.
3D FloTrix MSC Terreno senza sieroCytoNiche BiotechRMZ112Questo è un terreno privo di siero e di origine animale per l'espansione e il mantenimento delle cellule staminali mesenchimali in coltura planare 2D e coltura 3D su microcarrier 3D TableTrix.
Modulo di filtrazione monouso 3D FloTrixCytoNiche BiotechR020-00-10Questo modulo contiene 0,22 μ M Capsule filtranti utilizzate per la filtrazione del terreno di coltura e della soluzione digestiva.
3D FloTrix Custodia Monouso (10 L)CytoNiche BiotechR020-00-03Utilizzato come sacca di alimentazione per bioreattore da 5 L.
Sacca di stoccaggio monouso 3D FloTrix (3 L)CytoNiche BiotechR020-00-01Utilizzata come sacca per la semina o il trasferimento di cellule.
Sacca di stoccaggio monouso 3D FloTrix (50 L)CytoNiche BiotechR020-00-04Utilizzata come sacca di alimentazione per bioreattore da 15 L.
3D FloTrix vivaPACK Riempimento monouso Kit di materiali di consumo per finituraCytoNiche BiotechPACK-01-01Si tratta di un kit standard adattato al sistema di riempimento e finitura 3D vivaPACK.
Sistema di riempimento e finitura 3D FloTrix vivaPACK per celluleCytoNiche BiotechvivaPACKQuesto sistema è un dispositivo chiuso per la gestione dei liquidi, con funzioni automatizzate di miscelazione ed esaurimento dei gas. Le cellule risospese nel tampone di crioconservazione possono essere aliquotate rapidamente e uniformemente in 20 sacche per lotto.
Sistema di elaborazione cellulare 3D FloTrix vivaPREP PLUSCytoNiche BiotechvivaPREP PLUSQuesto sistema è un dispositivo basato su centrifuga a flusso continuo. Le cellule possono essere concentrate, lavate e risospese con procedure completamente chiuse.
Kit monouso per l'elaborazione cellulare 3D FloTrix vivaPREP PLUSCytoNiche BiotechPREP-PLUS-00Si tratta di un kit standard adattato all'elaborazione cellulare 3D vivaPREP PLUS.
Bioreattore 3D FloTrix vivaSPIN  15 LCytoNiche BiotechFTVS15Questo prodotto bioreattore utilizza un controller, un recipiente con serbatoio agitato in vetro da 15 L e valutatori. È disponibile uno speciale tubo di perfusione.
Bioreattore 3D FloTrix vivaSPIN  5 LCytoNiche BiotechFTVS05Questo bioreattore utilizza un controller, un recipiente con serbatoio agitato in vetro da 5 L e assessori. È disponibile uno speciale tubo di perfusione.
Pacchetto di materiali di consumo 3D FloTrix vivaSPIN Closed System (10/15 L)CytoNiche BiotechR020-10-10Si tratta di un kit di tubi standard adattato al bioreattore 3D vivaSPIN 15 L, contenente sacche di campionamento.
Pacchetto di materiali di consumo 3D FloTrix vivaSPIN Closed System (2/5 L)CytoNiche BiotechR020-05-10Si tratta di un kit di tubi standard adattato al bioreattore 3D vivaSPIN da 5 L, contenente sacche di campionamento.
Microcarrier 3D TableTrix G02CytoNiche BiotechG02-10-10gQuesti microcarrier porosi e degradabili sono adatti per HEK293T colture cellulari. Vengono forniti pre-sterilizzati in 10 g/flacone con tubi C-Flex per la saldatura ai tubi dei bioreattori.
Microcarrier 3D TableTrix V01CytoNiche BiotechV01-100-10gQuesti microcarrier porosi e degradabili sono adatti per colture cellulari aderenti, si presentano come microcarrier non sterilizzati che devono essere sterilizzati in autoclave in PBS prima dell'uso. Sono particolarmente adatti per la produzione di vaccini.
3D TableTrix microcarrier W01CytoNiche BiotechW01-10-10g (confezione monouso);
W01-200 (compresse)		Questi microcarrier porosi e degradabili sono adatti per colture cellulari aderenti, in particolare per le cellule che devono essere raccolte come prodotti finali. Vengono forniti pre-sterilizzati in 10 g/flacone con tubi C-Flex per la saldatura ai tubi dei bioreattori. Il prodotto ha ottenuto 2 qualifiche per eccipienti farmaceutici da CDE, con i numeri di registrazione di [F20200000496; F20210000003]. Ha anche ricevuto la qualifica DMF per gli eccipienti farmaceutici dalla FDA, con il numero di registrazione di [DMF:35481]
APC anticorpo CD45BioLegend368512 Utilizzato nella citometria a flusso per la valutazione dell'identità MSC
doppia colorazione Calcein-AM/PI DojindoC542Il kit di doppia colorazione Calcein-AM/PI viene utilizzato per la colorazione a fluorescenza simultanea di cellule vitali e morte. Questo kit contiene soluzioni di calceina-AM e ioduro di propidio (PI), che colorano rispettivamente le cellule vitali e quelle morte.
Tappo per chiusure per contenitori EZ Top per contenitori NALGENE (500mL)Saint-GobainCAP-38Le marche e i numeri di catalogo sono solo ad esempio, prodotti simili sono disponibili da vari fornitori e purché abbiano la stessa funzionalità, gli articoli potrebbero essere sostituiti con altre marche.
Tubi C-Flex, formulazione 374 (0,25 pollici x 0,44 pollici)Saint-Gobain374-250-3Utilizzato per la saldatura e la disconnessione di tubi.
CryoMACS Sacca di Congelamento 50Miltenyi Biotec 200-074-400Utilizzato per espandere il 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill& Finisci il kit di consumabili.
Dimetilsolfato (DMSO) SigmaD2650-100mLUtilizzato per la preparazione di soluzioni di crioconservazione.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)BasalMediaL120KJUtilizzato per la coltivazione di cellule HEK293T e Vero.
DURAN Original GL 45 Flacone da laboratorio (2 L)DWK life sciences218016357Utilizzato per la raccolta dei rifiuti dal bioreattore da 5 L.
DURAN Original GL 45 Flacone da laboratorio (5 L)DWK life sciences218017353Utilizzato per la raccolta dei rifiuti dal bioreattore da 15 L.
DURAN Original GL 45 Flacone da laboratorio (500 mL)DWK life sciences218014459Utilizzato per il flacone supplementare di NaOH 0,1 M.
Chiusure per contenitori EZ Top per contenitori NALGENE (500mL)Saint-GobainEZ500 ML-38-2Le marche e i numeri di catalogo sono solo ad esempio, prodotti simili sono disponibili da vari fornitori e purché abbiano la stessa funzionalità, gli articoli potrebbero essere sostituiti con altre marche.
Siero fetale bovino (FBS) di qualità superioreWisent086-150Utilizzato per la coltivazione di cellule HEK293T.
Anticorpo CD14 umano FITCBioLegend301804Utilizzato nella citometria a flusso per la valutazione dell'identità delle MSC.
Anticorpo CD34 umano FITCBioLegend343504Utilizzato nella citometria a flusso per la valutazione dell'identità delle MSC.
FITC anti-umano CD90 (Thy1) AntibodyBioLegend328108Utilizzato nella citometria a flusso per la valutazione dell'identità delle MSC.
Citometria a flussoBeckman CoulterCytoFLEXUtilizzato per la valutazione dell'identità cellulare.
Analizzatore cellulare a fluorescenzaAlit life scienceCountstar Rigel S2Utilizzato per il conteggio cellulare. La vitalità cellulare può essere calcolata colorando con coloranti AO/PI.
Tappo a vite per connettore multiporta GL 45 con 2 porte marchi e idi DWK life sciences292632806 sono solo ad esempio, prodotti simili sono disponibili da vari fornitori e, purché abbiano le stesse funzionalità, gli articoli potrebbero essere sostituiti con altri marchi.
GlucometroSinocare 6243578Utilizzato per rilevare la concentrazione di glucosio nel terreno di coltura cellulare e nel surnatante.
La soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS), con calcio e magnesioGibco14025092utilizzata per la preparazione della soluzione digestiva.
Albumina umana 20% Behring (HSA)CSL BehringN/AUtilizzato per la preparazione del tampone di lavaggio.
Microscopio a fluorescenza invertitaOLYMBUSUtilizzato per l'osservazione e l'imaging a fluorescenza e a campo brifgt.
Cilindro graduato Nalgene (500 mL)Thermo Scientific3662-0500PKUtilizzato per calibrare la velocità del volume di movimentazione dei liquidi delle pompe peristaltiche.
Siero di vitello neonato (NBS) superfinoMINHAI BIOSC101.02Utilizzato per la coltivazione di cellule Vero.
Kit di differenziazione e caratterizzazione adipogenica delle cellule staminali mesenchimali umaneOriCell CyagenHUXUC-90031Utilizzato per la differenziazione tri-lineage delle hUCMSCs.
Kit di differenziazione e caratterizzazione condrogenica delle cellule staminali mesenchimali umaneOriCell CyagenHUXUC-90041Utilizzato per la differenziazione tri-lineage delle hUCMSCs.
Kit di differenziazione e caratterizzazione osteogenica delle cellule staminali mesenchimali umaneOriCell CyagenHUXUC-90021Utilizzato per la differenziazione tri-lineage di hUCMSCs.
PE anti-umano CD105 AnticorpoBioLegend800504Utilizzato nella citometria a flusso per la valutazione dell'identità delle MSC.
PE anti-umano CD19 AnticorpoBioLegend302208Utilizzato nella citometria a flusso per la valutazione dell'identità delle MSC.
PE anti-umano CD73 (Ecto-5'-nucleotidasi) AnticorpoBioLegend344004Utilizzato nella citometria a flusso per la valutazione dell'identità delle MSC.
PE anti-umano HLA-DR AnticorpoBioLegend307605Utilizzato nella citometria a flusso per la valutazione dell'identità delle MSC.
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Wisent311-010-CLUtilizzato nella sterilizzazione in autoclave di recipienti in vetro e microcarrier V01 e nella sostituzione di terreni di coltura.
Tubi in silicone sanitario polimerizzato al platino Sani-Tech (0,13 pollici x 0,25 pollici)Saint-GobainULTRA-C-125-2FUtilizzato per il trasferimento di soluzioni azionato da pompe peristaltiche.
Soluzione salina sterileHopebiolHBPP008-500Utilizzato per la preparazione del tampone di lavaggio.
Tripzima Ricombinante TripsinaBasalMediaS342JVQuesto reagente viene utilizzato per il trasferimento da microsfera a perlina di cellule HEK293T e Vero.
Sigillante per tubiYingqi BiotechSigillante per tubi IQuesto sigillante è compatibile sia con i tubi C-Flex che con i tubi in PVC.
Saldatrice per tubi in PVCChu BiotechTube Welder Micro IUtilizzato per la saldatura di tubi in PVC.
Saldatrice per tubi in TPEYingqi BiotechSaldatrice per tubi I-V2Utilizzata per la saldatura di tubi in TPE.
ViaStain AO / PI Viability StainsNexcelomCS2-0106-25mLDual-Fluorescence Viability, utilizzando l'arancio acridina (AO) e lo ioduro di propidio (PI), è il metodo raccomandato per un'analisi accurata della vitalità delle cellule primarie, come le PBMC, e delle cellule staminali in campioni contenenti detriti.
umano Kit di I numeri di catalogo CKX53SF

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