Questo protocollo prevede la trasfezione di sensori cAMP e bPAC-nLuc, una proteina optogenetica, per tracciare accuratamente la sua distribuzione cellulare e la risposta alla stimolazione luminosa. L'approccio innovativo di creare una mappa di risposta cAMP utilizzando un sistema di scansione puntuale ha il potenziale per far progredire la ricerca con le proteine optogenetiche in diversi campi.
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Articolo metodologico
Mappatura della distribuzione cellulare di una proteina optogenetica utilizzando una griglia di stimolazione luminosa
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il nostro obiettivo era tracciare accuratamente la distribuzione cellulare di una proteina optogenetica e valutarne la funzionalità all'interno di una specifica posizione citoplasmatica. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo co-trasfettato le cellule con sensori cAMP a bersaglio nucleare e la nostra proteina optogenetica sviluppata in laboratorio, l'adenilil ciclasi-nanoluciferasi fotoattivabile batterica (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc, quando stimolato con luce a 445 nm o substrati di luciferasi, genera adenosina 3',5'-monofosfato ciclico (cAMP). Abbiamo impiegato un illuminatore laser a stato solido collegato a un sistema di scansione puntiforme che ci ha permesso di creare un modello griglia/matrice di piccoli punti illuminati (~1 μm2) in tutto il citoplasma delle cellule HC-1. In questo modo, siamo stati in grado di tracciare efficacemente la distribuzione di bPAC-nLuc a bersaglio nucleare e generare una mappa completa della risposta cAMP. Questa mappa rappresentava accuratamente la distribuzione cellulare di bPAC-nLuc e la sua risposta alla stimolazione luminosa variava in base alla quantità di proteine nel punto illuminato. Questo approccio innovativo contribuisce all'espansione del kit di tecniche disponibili per lo studio delle proteine optogenetiche cellulari. La capacità di mappare la sua distribuzione e la sua risposta con alta precisione ha un potenziale di vasta portata e potrebbe far progredire vari campi di ricerca.
Introduzione
L'optogenetica, nata come strumento che ha rivoluzionato le neuroscienze, è ora un campo di ricerca in crescita e una tecnologia in ascesa utilizzata abitualmente da molti laboratori in tutto il mondo e in varie aree di ricerca in biologia. Abbiamo sviluppato bPAC-nLuc, una proteina optogenetica versatile, fondendo un'adenilil ciclasi (AC) sensibile alla luce da Beggiatoa sp. (adenilil ciclasi fotoattivabile batterica; bPAC) alla nanoluciferasi (nLuc)1,2,3. Quando stimolato con luce blu, il bPAC produce il secondo messaggero 3',5'-adenosina monofosfato ciclico (cAMP). nLuc è una piccola luciferasi di recente sviluppo che, in presenza di uno dei suoi substrati, può generare bioluminescenza e attivare la produzione di cAMP4. Pertanto, questa proteina optogenetica può essere attivata transitoriamente utilizzando brevi impulsi luminosi o costantemente con furimazina o altri substrati di luciferasi, permettendoci di imitare diversi modelli di segnalazione cAMP e valutare le risposte cellulari (attivazione di fattori di trascrizione, espressione genica, proliferazione cellulare, migrazione, ecc.). Recenti progressi nella segnalazione del secondomessaggero hanno enfatizzato l'importanza di eventi che si verificano in regioni citosoliche molto ristrette (ad esempio, la produzione endosomiale di cAMP per la fosforilazione della proteina legante l'elemento di risposta al cAMP (CREB) o i microdomini Ca2+ per la traslocazione del fattore nucleare delle cellule T attivate (NFAT) nel nucleo)5,6. Pertanto, è importante sviluppare strategie coerenti e sistematiche per valutare, imitare e bloccare la segnalazione da questi compartimenti nelle cellule vive. Per dimostrare la capacità di bPAC-nLuc di essere attivato in modo specifico in diversi compartimenti cellulari, abbiamo co-trasfettato una linea cellulare derivata dall'epatoma (HC-1) con il bPAC-nLuc a bersaglio nucleare e H208, un sensore di cAMP (FRET) (NLS-PAC-nLuc; NLS-H208). Le cellule HC-1 che derivano dalla linea HTC sono prive di attività AC analizzabile, il che si traduce in livelli basali di cAMP molto bassi, rendendole ideali per misurare la produzione di cAMP putativo sfruttando l'intera gamma dinamica dei sensori FRET7,8. Utilizzando un laser a stato solido (445 nm, LDI-7, 89 North) collegato a un sistema di scansione a punti (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic), descriviamo un protocollo per stimolare sistematicamente aree circolari molto piccole o punti (~1 μm2) all'interno delle singole cellule. Il sistema di scansione puntiforme è stato collegato a una delle porte posteriori di un microscopio a due piani, che ci ha permesso di stimolare le cellule ed eseguire misure FRET contemporaneamente tramite un percorso luminoso indipendente. Presentiamo un metodo in questo protocollo in cui il software SysCon Geo, fornito con il sistema di stimolazione da Rapp OptoElectronic, viene utilizzato per eseguire una scansione completa del citoplasma delle cellule. L'approccio prevede la generazione di una mappa di risposta cAMP impostando una sequenza di illuminazioni che stimolano le cellule in un modello a griglia (Figura 1).
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Protocollo
1. Coltura cellulare HC-1 e preparazione per l'imaging
- Mantenere le cellule HC-1 in DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), penicillina (100 UI/L), streptomicina (100 mg/L) e L-glutammina in piastre da 10 cm e incubate a 37 °C, 5% CO2, in aria umidificata al 95%.
- Far passare le cellule ogni 2-4 giorni una volta che le cellule sono confluenti ~90% utilizzando diluizioni 1:5 o 1:10.
- Cellule seme per trasfezione su vetrini coprioggetti 2 giorni prima dell'esperimento.
- Lavorando in condizioni sterili in una cappa di coltura tissutale con terreno preriscaldato e PBS, aspirare il terreno da una piastra di cellule quasi confluente e lavare delicatamente con 5 mL di PBS.
- Aspirare il PBS e aggiungere 1 mL di tripsina. Incubare a 37 °C per 3-5 minuti fino a quando le cellule non si sono staccate.
- Risospendere le cellule in 4 mL di terreno e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL.
- Utilizzare un emocitometro per contare il numero di cellule e calcolare la densità cellulare.
- Diluire le cellule a una densità di 1,5 x 104 cellule/mL.
- Pipettare 2 mL della sospensione cellulare su vetrini coprioggetti da 25 mm con rivestimento in poli-D-lisina in un piatto a 6 pozzetti.
- Incubare le cellule per circa 24 ore in un incubatore fino alla confluenza del 70%.
- Tranfettare le cellule utilizzando un kit di trasfezione seguendo le istruzioni del produttore utilizzando un rapporto di 0,25 μg di NLS-bPAC-nLuc DNA/0,75 μg di NLS-H208 DNA per 3 μL di reagente di trasfezione e 2 μL di reagente P3000 diluito in terreno Opti-MEM privo di rosso fenolo.
- Posizionare le cellule nell'incubatore per ~48 ore per consentire una sufficiente espressione di bPAC-nLuc, essenziale per produrre livelli rilevabili di cAMP.
NOTA: Il livello minimo richiesto di espressione di bPAC-nLuc varia a seconda della potenza del sistema di stimolazione e dei parametri della stimolazione. - Preparare le cellule sui vetrini coprioggetti per l'imaging.
- Aspirare il terreno da un pozzetto e lavare due volte con 2 ml di PBS.
- Sollevare con cautela il vetrino coprioggetti utilizzando un paio di pinze e posizionarlo nella camera di imaging.
- Aggiungere 1 mL di Opti-MEM privo di rosso fenolo alla camera di imaging. Le cellule possono anche essere visualizzate in HBSS o in qualsiasi altra soluzione compatibile con la fluorescenza fisiologica.
2. Simulazione della luce e imaging di cellule vive
- Eseguire colture cellulari e manipolazione di cellule che esprimono NLS-bPAC-nLuc in un ambiente buio. Per evitare l'esposizione a lunghezze d'onda <500 nm, utilizzare una lampada a luce di sicurezza rossa (Tabella dei materiali) con una lampadina a fluorescenza compatta ambra da 13 W (Tabella dei materiali).
- Esegui esperimenti in un microscopio motorizzato a due piani (Tabella dei materiali) dotato di un motore di luce multi-LED a 6 linee (Tabella dei materiali), una ruota portafiltri di emissione (Tabella dei materiali), uno stadio XY (Tabella dei materiali), una fotocamera CMOS digitale ORCA-Fusion (Tabella dei materiali) e un obiettivo per olio 100x/1,4 NA (∞/0,17/FN26.5). Acquisizione di immagini utilizzando il software di microscopia digitale (Tabella dei materiali). Questa configurazione è in grado di stimolare le cellule ed eseguire simultaneamente misure FRET utilizzando un percorso luminoso indipendente dotato di un filtro dicroico ZT458rdc (Tabella dei materiali).
NOTA: È possibile utilizzare qualsiasi configurazione di acquisizione se consente la stimolazione optogenetica simultanea e l'imaging FRET/intensiometrico con un sensore compatibile. - Accendere l'UGA - 42 Geosystem. Accendere il microscopio e impostarlo con i parametri appropriati da acquisire con il sensore FRET H208. La configurazione di acquisizione dipenderà dai livelli di espressione del sensore FRET. I parametri tipici sono un tempo di simulazione di 40 ms per YFP/mScarletI, una potenza del LED del 15% e 0,5 Hz.
- Aprire il software SysCon e il software di imaging che controlla il microscopio.
- Nella finestra Fotocamera, selezionare la scheda Calibrazione e scegliere la lunghezza d'onda del laser compatibile con la proteina optogenetica. Per stimolare bPAC-nLuc, utilizzare una lunghezza d'onda di 445 nm.
- Calibrare il sistema prima di ogni utilizzo. Questo è importante perché piccole variazioni nella configurazione, o anche cambiamenti nella temperatura ambiente (RT), possono alterare la precisione della stimolazione.
- Nella finestra della fotocamera, selezionare la scheda Fotocamera e fare clic su per avviare l'acquisizione dal software di immaginazione.
- Nella finestra Visualizzatore immagini, visualizzare un'acquisizione dal vivo o precedente della fluorescenza delle cellule prelevata dal software di imaging, che guiderà il posizionamento degli oggetti di stimolazione.
- Usa la modalità Click and Fire per valutare rapidamente la reattività di una singola cellula prima di iniziare l'esperimento.
- Utilizzando la finestra Gestione sequenze, selezionare per creare una nuova sequenza.
NOTA: Per verificare la corretta calibrazione del sistema, disegnare varie forme e dimensioni nella finestra del Visualizzatore immagini. Questi dovrebbero corrispondere esattamente ai modelli di stimolazione proiettati sulle cellule, garantendo un allineamento accurato con il design previsto. - Nella finestra Visualizzatore immagini , selezionare l'icona Rotondo nella barra degli strumenti a sinistra per disegnare oggetti di stimolazione circolare.
- Crea più piccoli cerchi identici e distribuiscili uniformemente per garantire la copertura omogenea dell'intero citoplasma delle cellule da stimolare.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse su ciascuno di essi per verificare l'omogeneità degli oggetti di stimolazione circolare. Apparirà una finestra; Usalo per esaminare il loro raggio, posizione, ecc.
- Imposta il raggio tra 1 e 5, a seconda dell'obiettivo utilizzato e delle dimensioni della cella.
- Per facilitare la spaziatura uniforme e l'allineamento dei cerchi, utilizzare il pulsante nella sottofinestra Visualizza. Inoltre, impostare le proprietà della griglia utilizzando il pulsante .
- Assicurarsi che la griglia o la matrice di oggetti di stimolazione circolare equidistanti copra completamente la cellula e che le sue dimensioni (ad esempio, 6 x 6 o 10 x 10) siano determinate dalle dimensioni della cellula. Come controllo per la stimolazione nulla che non dovrebbe innescare alcun evento cellulare, includere alcuni cerchi posizionati all'esterno della cellula.
- Ogni oggetto creato nella finestra del Visualizzatore immagini apparirà nella finestra Timeline.
- Nella sottofinestra Temporizzazione Oggetto, configurare le proprietà temporali di ciascun oggetto di stimolazione (ora di inizio, durata, ritardo).
- Nella sottofinestra Sorgente luminosa, configurare la lunghezza d'onda e l'intensità di ciascun oggetto. Per questo protocollo, assicurati che ogni oggetto utilizzi la stessa lunghezza d'onda e sia identico in termini di durata e intensità. L'ora di inizio sarà diversa per ogni oggetto e il ritardo tra di loro può essere variato a seconda del risultato atteso per evitare di sovrapporre l'effetto di diverse stimolazioni.
- Nella finestra Timeline, modificare la sequenza in cui ciascun oggetto di stimolazione verrà attivato, se necessario. Configurare le stimolazioni in uno schema regolare (ad esempio, da sinistra a destra, dall'alto verso il basso) o in uno schema casuale, a seconda dell'esperimento particolare.
- Caricare la sequenza nel sistema e configurare il numero di cicli di sequenza (esecuzioni) che il sistema eseguirà.
- Posiziona le regioni di interesse (ROI) nel software di imaging nelle posizioni desiderate.
- Inizia ad acquisire immagini a fluorescenza con il microscopio e premi nella finestra UGA-42.
3. Analisi dei dati
- Sebbene il software fornito dal sistema di stimolazione consenta di salvare le sequenze per un ulteriore utilizzo, non registra le informazioni effettive dell'esperimento. Pertanto, documenta meticolosamente tutti i dettagli relativi ai punti di stimolazione e alle sequenze impiegate durante l'esperimento, inclusi parametri come posizione, intensità, durata, numero di corse, ecc. Documentare qualsiasi altra condizione sperimentale pertinente, come agenti farmacologici o soluzioni specifiche.
- Durante l'esperimento, posizionare le ROI designate sul software di imaging per acquisire le variazioni di intensità della fluorescenza dall'intera cellula o da posizioni specifiche all'interno delle cellule.
- Prestare particolare attenzione al posizionamento delle ROI rispetto ai punti di stimolazione. Misurare le variazioni dell'intensità della fluorescenza all'interno o lontano dalle aree stimolate. Regolare le posizioni delle ROI post-esperimento, fornendo al software di imaging il modo di salvare le immagini acquisite durante l'esperimento e non solo i valori di intensità della ROI.
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Risultati
I risultati presentati nella Figura 1 mostrano che solo le stimolazioni dirette al nucleo cellulare sono state in grado di generare aumenti misurabili di cAMP. Questo conferma che NLS-bPAC-nLuc è espresso esclusivamente nel compartimento nucleare delle cellule HC-1. È possibile stimolare con precisione una proteina optogenetica utilizzando questo schema a griglia/matrice per mapparne la distribuzione intracellulare. Inoltre, gli aumenti maggiori di cAMP verso...
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Discussione
L'obiettivo di questo studio è stato quello di monitorare con precisione la distribuzione intracellulare di una proteina optogenetica e valutarne le prestazioni all'interno di un particolare compartimento citoplasmatico. Abbiamo anche mostrato le precise capacità di stimolazione di un sistema di scansione puntiforme su cellule che esprimono una proteina optogenetica. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo impiegato un bPAC-nLuc a bersaglio nucleare con alti livelli di espressione ma una distribuzione molto ristretta l...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse concorrente.
Ringraziamenti
Il finanziamento è stato fornito dal National Institutes of Health (NIH) concede R01 GM099775 e GM130612 a D.L.A.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Lampadina a fluorescenza compatta ambra da 13 W - Luci blu basse | Sviluppi fotonici | ||
| 3-isobutile-1-metilxantina (IBMX) | Sigma | I7018 | |
| 6-line multi-LED Lumencor Spectra X | Lumencor | Motore di illuminazione multi-LED a 6 linee | |
| Corning - DMEM | Thermo Fischer | MT10013CMEA | |
| Corning - Siero fetale bovino regolare | Thermo Fischer | MT35011CV | |
| Occhiali di copertura: cerchi | Thermo Fischer | 12545102P | |
| GBX-2 filtro di sicurezza rosso scuro 5,5" | Lampada di sicurezza Kodak | 1416827 | rossa |
| Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) 10x | Thermo Fischer | 14185052 | Diluito a 1x, pH regolato |
| LDI-7 | 89 North | ||
| L-Glutammina | Thermo Fischer | BW17605E | |
| Lipofectamina 3000 | Kit di trasfezione | Thermo Fischer | L3000001 |
| Olympus IX83 motorizzata a due piani microscopio | Microscopio motorizzato a due ponti | Olympus | |
| Opti-MEM, senza rosso fenolo | Thermo Fischer | 11058021 | |
| fotocamera CMOS digitale a fusione ORCA | Hamamatsu | C14440-20UP | |
| Penicillina-streptomicina (10.000 U/mL) | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Soluzione tamponata con fosfato (1x) | Lonza | 17516F | |
| Ruota portafiltri per emissioni precedenti e set di filtri | Prior Scientific, Inc. | Ruota portafiltri emissione | |
| Priore Proscan XY stage | Prior Scientific, Inc. | Stadio XY | |
| Slidebook 6 | Innovazioni di imaging intelligente Software | microscopia digitale | |
| Software SysCon | Software | Software fornito dal sistema di stimolazione | |
| UGA-42 Geo | Rapp OptoElectronic | ||
| UPlanSApo 100x | Olympus | 100x/1.4 NA obiettivo olio (∞/0.17/FN26.5) | |
| ZT458rdc dicroico | Chroma Technology Corp | BS, Lunghezza d'onda (CWL): 498 nm |
Riferimenti
- Naim, N., et al. Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).
- Naim, N., Reece, J. M., Zhang, X., Altschuler, D. L. Dual activation of cAMP production through photostimulation or chemical stimulation. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2173, 201-216 (2020).
- Stierl, M., et al. Light modulation of cellular cAMP by a small bacterial photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, of the soil bacterium Beggiatoa. The Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1181-1188 (2011).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
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- Groschner, K., Graier, W. F., Romanin, C. Store-operated ca(2)+ entry (SOCE) pathways. , Springer, Vienna. (2017).
- Ross, E. M., Howlett, A. C., Ferguson, K. M., Gilman, A. G. Reconstitution of hormone-sensitive adenylate cyclase activity with resolved components of the enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6401-6412 (1978).
- Insel, P. A., Maguire, M. E., Gilman, A. G., Bourne, H. R., Coffino, P., Melmon, K. L. Beta adrenergic receptors and adenylate cyclase: products of separate genes. Molecular Pharmacology. 12, 1062-1069 (1976).
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- Keravis, T., Lugnier, C. Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) isozymes as targets of the intracellular signalling network: benefits of PDE inhibitors in various diseases and perspectives for future therapeutic developments. British Journal of Pharmacology. 165 (5), 1288-1305 (2012).
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