Questo protocollo presenta un metodo per valutare la formazione e la riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA attraverso la rilevazione simultanea di focolai di γH2AX e 53BP1 nei nuclei interfase dei linfociti periferici umani trattati con bleomicina.
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Articolo metodologico
Doppia immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 nei linfociti periferici umani
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le rotture del doppio filamento (DSB) sono una delle lesioni più gravi che possono verificarsi nei nuclei cellulari e, se non riparate, possono portare a esiti gravi, incluso il cancro. La cellula è quindi dotata di meccanismi complessi per riparare le DSB, e queste vie coinvolgono l'istone H2AX nella sua forma fosforilata a Ser-139 (cioè γH2AX) e p53 binding protein 1 (53BP1). Poiché entrambe le proteine possono formare focolai nei siti delle DSB, l'identificazione di questi marcatori è considerata un metodo adatto per studiare sia le DSB che la loro cinetica di riparazione. Secondo i processi molecolari che portano alla formazione di focolai di γH2AX e 53BP1, potrebbe essere più utile indagare la loro co-localizzazione vicino alle DSB al fine di impostare un approccio alternativo che consenta di quantificare le DSB mediante la rilevazione simultanea di due marcatori di danno al DNA. Pertanto, questo protocollo mira a valutare il danno genomico indotto nei linfociti umani dall'agente radiomimetico bleomicina attraverso la presenza di focolai di γH2AX e 53BP1 in una doppia immunofluorescenza. Utilizzando questa metodologia, abbiamo anche delineato la variazione del numero di focolai di γH2AX e 53BP1 nel tempo, come tentativo preliminare di studiare la cinetica di riparazione dei DSB indotti da bleomicina.
Introduzione
Il danno al DNA è continuamente indotto da agenti che possono essere endogeni, come i ROS generati dal metabolismo ossidativo cellulare, o esogeni, sia chimici che fisici1. Tra le lesioni più dannose, le rotture a doppio filamento (DSB) svolgono un ruolo fondamentale nel contribuire all'instabilità genomica, poiché causano aberrazioni cromosomiche che a loro volta possono avviare il processo di carcinogenesi. Pertanto, le cellule sono dotate di meccanismi complessi ed efficienti di riparazione dei DSB2.
Quando si verifica un DSB, la cellula innesca la risposta al danno del DNA (DDR) dove, insi....
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Protocollo
Lo studio è stato approvato dal comitato etico dell'Università di Pisa e il consenso informato e firmato è stato ottenuto da ciascun donatore.
1. Formazione di focolai γH2AX e 53BP1
- Preparazione dei campioni e trattamento mutageno
- Raccogliere campioni di sangue intero mediante venipuntura da individui adulti sani in provette di raccolta del sangue (ad esempio, Vacutainer) contenenti eparina di litio come anticoagulante.
- Al fine di garantire una corretta conservazione del campione di sangue, avviare la procedura entro 24 ore dal prelievo.
- Aggiungere 300 μL del campione in una p....
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Risultati
I dati ottenuti dall'analisi al microscopio a fluorescenza dei linfociti periferici ci permettono di valutare tre aspetti principali: l'efficacia del trattamento con bleomicina nell'aumentare il numero di focolai di γH2AX e 53BP1 (e quindi di DSB) a causa del suo effetto mutageno, in che misura entrambi i focolai sono co-localizzati nel sito delle DSB e il decorso temporale dei focolai di γH2AX e 53BP1 per delineare la cinetica di riparazione dei DSB indotti da bleomicina. Come previsto, è stata osservata una frequenza m.......
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Discussione
L'analisi di immunofluorescenza dei focolai di γH2AX e 53BP1 è un metodo adatto per valutare il danno genomico nei nuclei interfase di un sistema cellulare. Questa procedura presenta diversi punti critici che possono influenzare l'esito degli esperimenti, principalmente gli agenti utilizzati nella fissazione e permeabilizzazione, il tipo di anticorpi e i loro fattori di diluizione e la concentrazione del mutageno.
Il mantenimento dell'integrità proteica è fondamentale poiché il metodo dell'imm.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati a tutti i donatori di sangue e a tutto il personale sanitario che ha prelevato i campioni di sangue.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AlexaFluor 568 capra anti-topo IgG (γ 1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 anticorpo secondario |
| Bleoprim | Sanofi | bleomicina solfato (mutageno) | |
| Penicillina-streptomicina soluzione 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotici per terreno di coltura |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Soluzione salina tamponata con fosfato |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Siero fetale bovino per immunofluorescenza |
| IgG (H+L) anti-coniglio di capra DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γ Anticorpo secondario H2AX |
| Anticorpo monoclonale di topo anti-53BP1 | Merck | MAB 3802 | 53BP1 anticorpo primario |
| Labophot 2 | Microscopio a fluorescenza | Nikon | |
| P-istone H2AX (Ser139) anticorpo di coniglio | Segnalazione cellulare | #2577 | γ Anticorpo primario H2AX |
| Fitoemoagglutinina | Termofisher | R30852801 | componente del terreno di coltura |
| Reagente antisbiadimento Long Gold con DAPI | Cell Signaling | #8961 | Soluzione antisbiadimento con DAPI per controcolorazione |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Terreno di coltura |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Detergente non ionico per permeabilizzazione |
Riferimenti
- Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
- Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair.
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Ristampe e permessi
