Questo articolo riporta la costruzione di cellule knockout della proteina E associata al centromero (CENP-E) utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 e tre strategie di screening basate sul fenotipo. Abbiamo utilizzato la linea cellulare knockout CENP-E per stabilire un nuovo approccio per convalidare la specificità e la tossicità degli inibitori CENP-E, utile per lo sviluppo di farmaci e la ricerca biologica.
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Articolo metodologico
Generazione di linee cellulari knockout CENP-E-/- associate al centromero della proteina E utilizzando il sistema CRISPR/Cas9
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sistema CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 è emerso come un potente strumento per l'editing genetico preciso ed efficiente in una varietà di organismi. La proteina-E ASSOCIATA AL CENTROMERO (CENP-E) è una chinesina diretta all'estremità positiva necessaria per la cattura del cinetocoro-microtubuli, l'allineamento cromosomico e il checkpoint dell'assemblaggio del fuso. Sebbene le funzioni cellulari delle proteine CENP-E siano state ben studiate, è stato difficile studiare le funzioni dirette delle proteine CENP-E utilizzando i protocolli tradizionali perché l'ablazione di CENP-E di solito porta all'attivazione del checkpoint dell'assemblaggio del fuso, all'arresto del ciclo cellulare e alla morte cellulare. In questo studio, abbiamo completamente eliminato il gene CENP-E nelle cellule HeLa umane e generato con successo le cellule CENP-E-/- HeLa utilizzando il sistema CRISPR/Cas9.
Sono state stabilite tre strategie di screening ottimizzate basate sul fenotipo, tra cui lo screening delle colonie cellulari, i fenotipi di allineamento cromosomico e le intensità fluorescenti delle proteine CENP-E, che migliorano efficacemente l'efficienza dello screening e il tasso di successo sperimentale delle cellule knockout CENP-E . È importante sottolineare che la delezione di CENP-E provoca il disallineamento cromosomico, la posizione anomala delle proteine serina/treonina chinasi B (BubR1) del checkpoint mitotico BUB1 e difetti mitotici. Inoltre, abbiamo utilizzato il modello di cellula HeLa knockout di CENP-E per sviluppare un metodo di identificazione per inibitori specifici di CENP-E.
In questo studio è stato stabilito un approccio utile per convalidare la specificità e la tossicità degli inibitori di CENP-E. Inoltre, questo articolo presenta i protocolli di editing genetico CENP-E utilizzando il sistema CRISPR/Cas9, che potrebbe essere un potente strumento per studiare i meccanismi di CENP-E nella divisione cellulare. Inoltre, la linea cellulare knockout di CENP-E contribuirebbe alla scoperta e alla convalida degli inibitori di CENP-E, che hanno importanti implicazioni per lo sviluppo di farmaci antitumorali, studi sui meccanismi di divisione cellulare nella biologia cellulare e applicazioni cliniche.
Introduzione
L'editing genomico ingegnerizzato media le modificazioni mirate dei geni in una varietà di cellule e organismi. Negli eucarioti, la mutagenesi sito-specifica può essere introdotta dall'applicazione di nucleasi sequenza-specifiche che stimolano la ricombinazione omologa del DNAbersaglio 1. Negli ultimi anni, diverse tecnologie di editing del genoma, tra cui le nucleasi a dita di zinco (ZFNs)2,3, le nucleasi effettrici simili all'attivatore di trascrizione (TALEN)4,5 e le meganucleasi homing 6,7<....
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Protocollo
1. Costruzione dei vettori di knockout del gene CRISPR/Cas9
- Selezionare la sequenza di DNA genomico bersaglio sul gene umano CENP-E (GenBank Accession No. NM_001286734.2) e progettare l'sgRNA utilizzando uno strumento di progettazione CRISPR online (http://crispor.tefor.net/).
- Inserire una singola sequenza genomica, selezionare il genoma di "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs): dbSNP148", e selezionare il motivo adiacente al protospaziatore "20 bp-NGG-spCas9". Scegliere due sequenze guida, tra cui sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' e sgRNA-2 5'-TTCTTTAGA....
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Risultati
Le cellule CENP-E-/- HeLa sono state generate con successo utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 (Figura 1). La tempistica e le fasi sperimentali critiche di questo metodo sono mostrate nella Figura 1. In primo luogo, abbiamo progettato e sintetizzato gli sgRNA specifici per CENP-E, ricotto e legato gli sgRNA nel plasmide pX458, trasfettato il plasmide in cellule HeLa e coltivate per 48 ore. Le cellule trasfettate sono state dissociate .......
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Discussione
Kinesin-7 CENP-E è un regolatore chiave nell'allineamento cromosomico e nel checkpoint dell'assemblaggio del fuso durante la divisione cellulare 17,19,20. La delezione genetica di CENP-E di solito provoca l'attivazione del checkpoint dell'assemblaggio del fuso, l'arresto del ciclo cellulare e la morte cellulare 27,29,51,52.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo tutti i membri del Laboratorio di Citoscheletro dell'Università di Medicina del Fujian per le utili discussioni. Ringraziamo Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin e Min-Xia Wu del Public Technology Service Center, Fujian Medical University per la loro assistenza tecnica. Ringraziamo Si-Yi Zheng, Ying Lin e Qi Ke del Centro di Insegnamento Sperimentale di Scienze Mediche di Base presso l'Università di Medicina del Fujian per il loro supporto. Questo studio è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni: National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzione 82001608 e 82101678), Natural Science Foundation della ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| provetta da centrifuga da 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| Corning | 3524 | ||
| 4S Gelred, 10.000x in acqua | Sangon Biotech (Shanghai) | A616697 | |
| provetta da centrifuga da 50 mL | Corning | 430828 | |
| piastra Petri da 6 cm | Corning | Reagente | |
| chimico Sinopharm | 95% di etanolo | 10009164 | |
| piastra a 96 pozzetti | Corning | 3599 | |
| Acido acetico | Sinopharm 10000218 | sciogliere in H2O per preparare una soluzione di lavoro al 10%. | |
| Agarose | Sangon Biotech (Shanghai) | A620014 | |
| Alexa Fluor 488-marcato Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Beyotime | A0428 | Per immunofluorescenza. Sciogliere all'1% BSA/PBST. Diluizione 1:500. |
| Alexa Fluor 488-marcato capra anti-coniglio IgG(H+L) | Beyotime | A0423 | per immunofluorescenza. Sciogliere all'1% BSA/PBST. Diluizione 1:500. |
| Alexa Fluor 555-marcato Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) | Beyotime | A0460 | Per immunofluorescenza. Sciogliere all'1% BSA/PBST. Diluizione 1:500. |
| Etanolo anidro | Sinopharm Reagente chimico | 100092690 | |
| Anticorpo monoclonale di coniglio anti-BubR1 | Abcam | ab254326 | Per immunofluorescenza. Sciogliere all'1% BSA/PBST. Diluizione 1:100 |
| Anticorpo monoclonale di topo anti-CENP-B | Santa Cruz Biotechnology | sc-376392 | per immunofluorescenza. Sciogliere all'1% BSA/PBST. Diluizione 1:50. |
| Anticorpo monoclonale di coniglio anti-CENP-E | Abcam | ab133583 | per immunofluorescenza. Sciogliere all'1% BSA/PBST. Diluizione 1:100. |
| Mezzo di montaggio anti-sbiadimento | Beyotime | P0131 | Rallentamento del quenching dei segnali fluorescenti. |
| Anticorpo monoclonale di topo anti-&alfa;-tubulina | Abcam | ab7291 | per immunofluorescenza. Sciogliere all'1% BSA/PBST. Diluizione 1:100. |
| Biotek Epoch Spettrofotometro per micropiastre | Biotek Instruments | Biotek Epoch | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sinopharm Chemical | Reagent 69003435 | |
| BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | |
| CellTiter 96 acquoso una soluzione saggio di proliferazione cellulare | Promega | G3580 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Colchicina | Sinopharm Reagente chimico | 61001563 | |
| Microscopio a scansione confocale | Leica | TCS SP8 | |
| Vetrino coprioggetti | CITOTEST | 80344-1220 | |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| DH5α cellule competenti | Sangon Biotech (Shanghai) | B528413 | |
| Marcatore DNA DL2000 | TaKaRa | 3427A | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Mini | ||
 | Kit | ||
| purificazione del DNA genomico animale a colonna Ezup | Ezup Sangon Biotech (Shanghai) | B518251 | |
| Siero bovino fetale | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 11011-8611 | |
| Violetta di genziana | Sinopharm Reagente chimico | 71019944 | Sciogliere in PBS per preparare violetta di genziana allo 0,1% / PBS. |
| Soluzione colorante Giemsa | Reagente chimico Sinopharm | , 71020260 | |
| software GraphPad Prism, versione 8.0 | GraphPad | www.graphpad.com | Analisi statistica. |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Linea cellulare HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| Incubatore umidificato | Heal Force | HF90/HF240 | |
| Software Image J | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Elaborazione e analisi delle immagini. |
| Microscopio invertito | Nanjing Jiangnan Novel Optics | XD-202 | |
| LB polvere di agar | Sangon Biotech (Shanghai) | A507003 | |
| Reagente di trasfezione Lipo6000 | Beyotime | C0526 | |
| Nikon Ti-S2 microscopio | Nikon | Ti-S2 | |
| Opti-MEM ridotto siero medio | Gibco | 31985070 | |
| Paraformaldeide | Sinopharm Reagente Chimico | 80096618 | Sciogliere in PBS per preparare il 4% di paraformaldeide/PBS. |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | HyClone | SV30010 | |
| kit di estrazione del gel di DNA della colonna SanPrep | Sangon Biotech (Shanghai) | B518131 | |
| SanPrep colonna plasmide mini-preparazioni kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B518191 | |
| T4 DNA ligasi | TaKaRa | 2011A | |
| T4 polinucleotide chinasi | TaKaRa | 2021A | |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | |
| Triton X-100 | Sinopharm Reagente | chimico 30188928 | Sciogliere in PBS per preparare 0,25% Triton X-100/PBS. |
| reagente | Tween 20 | Sinopharm | sciogliere in PBS per preparare lo 0,1% Tween 20/PBS. |
Riferimenti
- Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
- Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases.<....
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Ristampe e permessi
