Articolo metodologico

Sviluppo di un compendio per il carcinoma esofageo a cellule squamose

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DOI:

10.3791/65480

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12 aprile 2024

 , 
1Amity Centre of Nanotechnology, Amity University Haryana, 2Amity Stem Cell Institute, Amity Medical School, Amity University Haryana, 3Clinical Biosamples & Research Services (CBRS)

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive uno strumento utile per identificare cambiamenti molecolari significativi nel cancro e porta allo sviluppo di nuovi approcci diagnostici e terapeutici per il carcinoma esofageo a cellule squamose.

Abstract

Il cancro esofageo (EC) è l'8° tumoremaligno più aggressivo e il suo trattamento rimane impegnativo a causa della mancanza di biomarcatori che facilitino la diagnosi precoce. L'EC si manifesta in due forme istologiche principali - adenocarcinoma (EAD) e carcinoma a cellule squamose (ESCC) - entrambe con variazioni di incidenza tra popolazioni geograficamente distinte. Le tecnologie ad alto rendimento stanno trasformando la comprensione delle malattie, compreso il cancro. Una sfida significativa per la comunità scientifica è la gestione di dati sparsi in letteratura. Per risolvere questo problema, viene proposta una semplice pipeline per l'analisi di set di dati di microarray disponibili al pubblico e la raccolta di molecole regolate in modo differenziale tra cancro e condizioni normali. La pipeline può fungere da approccio standard per l'analisi dell'espressione genica differenziale, identificando i geni espressi in modo differenziale tra cancro e tessuti normali o tra diversi sottotipi di cancro. La pipeline prevede diverse fasi, tra cui la pre-elaborazione dei dati (che coinvolge il controllo di qualità e la normalizzazione dei dati grezzi di espressione genica per rimuovere le variazioni tecniche tra i campioni), l'analisi dell'espressione differenziale (identificazione dei geni espressi in modo differenziale tra due o più gruppi di campioni utilizzando test statistici come i t-test, ANOVA o modelli lineari), analisi funzionale (utilizzando strumenti bioinformatici per identificare percorsi e funzioni biologiche arricchite in geni differenzialmente espressi) e convalida (che comporta la convalida utilizzando set di dati indipendenti o metodi sperimentali come qPCR o immunoistochimica). Utilizzando questa pipeline, è possibile generare una raccolta di molecole differenzialmente espresse (DEM) per qualsiasi tipo di cancro, incluso il cancro esofageo. Questo compendio può essere utilizzato per identificare potenziali biomarcatori e bersagli farmacologici per il cancro e migliorare la comprensione dei meccanismi molecolari alla base della malattia. Inoltre, lo screening specifico della popolazione del cancro esofageo utilizzando questa pipeline aiuterà a identificare bersagli farmacologici specifici per popolazioni distinte, portando a trattamenti personalizzati per la malattia.

Introduzione

E' allarmante che l'EC sia l'ottavo tumore più diffuso al mondo e la sesta causa di morte in tutto il mondo. Cina, India e Iran hanno tassi di incidenza e mortalità allarmanti. Esistono due tipi principali di EC: l'adenocarcinoma esofageo (EAC o EAD) e il carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC)1. L'EAC è più comune nel mondo occidentale, mentre l'ESCC è più comune nei paesi orientali, in particolare in Cina e Iran2. Diversi fattori di rischio sono associati all'EC, tra cui l'uso di tabacco e alcol, l'obesità e la malattia da reflusso gastroesofageo (GERD). Inoltre, fattori dietetici come la mancanza di frutta e verdura e il consumo di bevande e cibi caldi sono associati al rischio ESCC nelle aree ad alto rischio. La diagnosi precoce e il trattamento sono importanti per migliorare gli esiti dei pazienti con EC 3,4. Pertanto, è importante aumentare la consapevolezza dei fattori di rischio, dei segni e dei sintomi dell'EC e incoraggiare lo screening regolare degli individui ad alto rischio. Inoltre, gli sforzi per affrontare i fattori di rischio modificabili, come l'uso di tabacco e alcol e le abitudini alimentari malsane, possono aiutare a ridurre l'incidenza della EC. L'EAD si verifica nelle cellule delle ghiandole produttrici di muco nella parte inferiore dell'esofago, vicino allo stomaco. È spesso associato a GERD, in cui l'acido e il contenuto dello stomaco ritornano nell'esofago. Al contrario, l'ESCC nasce da cellule piatte e sottili che rivestono la parte superiore dell'esofago5. È più comune nelle aree in cui l'uso di tabacco e alcol è diffuso, come la Cina e l'Iran.

Tra le varie condizioni legate all'esofago, l'esofago di Barrett (BE), una condizione in cui il rivestimento dell'esofago è sostituito da cellule ghiandolari, è un noto precursore dell'EAC6. Vale la pena notare che l'BE può svilupparsi senza GERD, ma la presenza di GERD aumenta il rischio di sviluppare BE da 3 a 5 volte. Inoltre, la presenza di BE aumenta il rischio di sviluppare EAC di 50-100 volte7. Inoltre, cibi e liquidi piccanti o piccanti sono stati collegati all'ESCC, ma non all'EAC. Comprendere i fattori di rischio per l'EC è importante per la sua prevenzione e diagnosi precoce. Gli sforzi per affrontare i fattori di rischio modificabili, come l'uso di tabacco, il consumo di alcol, l'obesità e le abitudini alimentari malsane, possono aiutare a ridurre l'incidenza della EC. Inoltre, lo screening e la sorveglianza di routine per gli individui ad alto rischio, come quelli con disfagia, o BE, possono migliorare i risultati consentendo la diagnosi precoce e il trattamento.

È certamente vero che gli studi basati sull'omica, tra cui la genomica, la trascrittomica, la proteomica, la metilomica, la miRNAomica e la metabolomica, hanno contribuito notevolmente alla nostra comprensione delle CE, in particolare dell'ESCC 8,9,10,11,12,13. Questi studi hanno permesso l'identificazione di nuovi biomarcatori, potenziali bersagli terapeutici e nuovi percorsi coinvolti nello sviluppo e nella progressione dell'ESCC. Tuttavia, i dati generati da questi studi sono sparsi in tutta la letteratura, rendendo difficile per la comunità scientifica l'accesso e l'utilizzo di queste informazioni. Pertanto, è importante creare un repository o un database che compili i dati ottenuti da studi ad alto o basso rendimento su tumori specifici. Tale pacchetto può essere semplificato e realizzato implementando alcune linee guida di base. Queste linee guida includono la selezione degli studi pertinenti, l'estrazione e l'organizzazione dei dati da questi studi e la garanzia della qualità e della coerenza dei dati. Inoltre, il compendio dovrebbe essere aggiornato regolarmente per includere nuovi studi e dati non appena disponibili. I ricercatori possono utilizzare un'unica piattaforma per recuperare e analizzare i dati su un cancro specifico creando un compendio o un database che combina i dati di diversi studi. Ciò contribuirà ad accelerare gli sforzi di ricerca e, in ultima analisi, a portare a trattamenti più efficaci e a risultati migliori per i pazienti oncologici.

Lo sviluppo del compendio sul cancro incorpora i dati provenienti da studi sia a basso che ad alto rendimento. Questo compendio sarà una risorsa preziosa per i ricercatori che cercano di identificare potenziali bersagli diagnostici o terapeutici per il cancro. Un modo per costruire questa collezione è quello di esaminare gli studi di microarray disponibili in archivi accessibili al pubblico come il Gene Expression Omnibus (GEO). Gli studi di microarray possono fornire informazioni sui livelli di espressione genica nelle cellule tumorali e questi dati possono essere utilizzati per identificare i geni differenzialmente espressi (DEG) che possono svolgere un ruolo nello sviluppo e nella progressione del cancro.

Tuttavia, va notato che studi diversi potrebbero aver utilizzato metodi diversi per analizzare i loro dati, il che potrebbe aver portato all'identificazione di diversi DEG. Pertanto, è importante esaminare attentamente ogni studio e considerare eventuali distorsioni o limitazioni potenziali quando si mettono insieme i dati per il compendio. Una volta raccolti i dati su una piattaforma comune, i ricercatori possono utilizzarli per identificare potenziali bersagli molecolari per ulteriori studi. Questi includono l'esame dell'espressione di un particolare gene in campioni clinici o la conduzione di studi meccanicistici per capire come un particolare gene o proteina è coinvolto nello sviluppo e nella progressione del cancro. Nel complesso, la creazione di un set di dati sul cancro sarà una risorsa preziosa per i ricercatori sul cancro e aiuterà a identificare nuovi bersagli per la diagnosi e gli interventi terapeutici.

Protocollo

1. Cura manuale delle molecole differenzialmente regolate in ESCC

  1. Trovare studi rilevanti a basso rendimento utilizzando PubMed
    NOTA: È importante comprendere la differenza di base tra tecniche a bassa produttività e tecniche ad alta produttività. Nel primo, viene studiato solo un numero limitato di campioni e il processo è solitamente dispendioso in termini di tempo, il contrasto successivo è più veloce e il numero di campioni può essere analizzato in una volta sola, il che è significativamente più alto rispetto ai metodi a basso rendimento come il Northern blot e il Western blot sono tecniche a basso rendimento, mentre il microarray di cDNA e la proteomica quantitativa basata su LC-MS/MS sono tecniche ad alto rendimento14. I motori di ricerca come NCBI-PubMed (vedi Tabella dei materiali) sono una buona fonte di ricerca di studi rilevanti per qualsiasi cancro, in quanto è una risorsa pubblicamente disponibile per gli scienziati biomedici per trovare letteratura su qualsiasi malattia come l'ESCC. Per trovare studi pertinenti, è necessario seguire i seguenti passaggi.
    1. Clicca sul motore di ricerca Google (vedi Tabella dei materiali) per aprirlo. Questo viene utilizzato anche dai ricercatori, poiché ci sono riviste che non sono indicizzate in PubMed, ma sono comunque articoli di buona qualità. È sempre bene cercare più di un motore di ricerca per annullare la probabilità di perdere un articolo importante.
    2. Seleziona la barra di ricerca di PubMed e usa gli operatori booleani (AND, OR, NOT). Gli operatori booleani affinano i ricercatori in parole chiave pertinenti utilizzate dai ricercatori per trovare i risultati.

2. Trovare studi pertinenti utilizzando PubMed

  1. Digita l'indirizzo web NCBI (vedi Tabella dei materiali) e fai clic per aprirlo.
  2. Seleziona PubMed dal menu della barra laterale sinistra Scheda Tutti i database .
  3. Digita nella barra di ricerca le parole chiave pertinenti, che recupereranno gli articoli pertinenti. Le parole chiave devono essere utilizzate in combinazione con gli operatori booleani in quanto potrebbero aiutare a ottenere gli articoli che sono strettamente correlati al cancro / malattia in questione (ad esempio, carcinoma esofageo a cellule squamose).

3. Trovare studi pertinenti utilizzando l'espressione genica omnibus (GEO)

NOTA: Gene expression omnibus (GEO) è un repository disponibile gratuitamente per l'archiviazione di dati su microarray di DNA. La pletora di dati disponibili in GEO è una buona risorsa per il data mining per identificare molecole regolate in modo differenziale tra cancro/malattie rispetto a condizioni normali.

  1. Digitare l'indirizzo Web GEO (vedere Tabella dei materiali) e fare clic per aprirlo.
  2. Digita Carcinoma esofageo a cellule squamose E Homo sapiens e premi Invio.
    NOTA: Per fare un compendio di geni regolati in modo differenziale per il cancro, è importante selezionare gli studi pertinenti da cui i ricercatori selezioneranno le molecole che sono regolate in modo differenziale tra il cancro e le condizioni normali. L'aspetto principale è quello di stabilire i criteri per la selezione delle molecole in base al fold-change. Il fold-change indicherà se un gene/proteina è sovraregolato o sottoregolato. La variazione del fold e i valori di cut-off del valore p possono alterare significativamente il significato dei dati in un dato esperimento, inclusi gli studi di microarray RNAseq o proteomica15.

4. Analisi di microarray con GEO2R

NOTA: La prima cosa da fare è trovare studi pertinenti utilizzando gli operatori booleani (AND, OR, NOT). Questi saranno utilizzati in combinazione con le parole chiave "carcinoma esofageo a cellule squamose", "ESCC" o "carcinoma esofageo a cellule squamose". GEO2R (vedi Tabella dei materiali) è un pacchetto in linguaggio R disponibile gratuitamente integrato con GEO, che consente agli utenti di analizzare i dati provenienti da studi di microarray in modo intuitivo. Interagisce con gli ID di ingresso GEO e fornisce un'interfaccia per l'esecuzione di analisi complesse basate su R per identificare i DEG utilizzando i pacchetti R di Bioconductor per il back-end. Questo pacchetto non solo trasforma i dati GEO, ma presenta anche il suo output sotto forma di tabelle .txt, che possono essere ulteriormente modificate in base alle esigenze degli utenti16. Il pacchetto GEO2R presenta i geni in un ordine di significatività statistica basato sul valore p, ma l'ordine può essere ordinato in base alla variazione logaritmica di2 volte. Inoltre, gli utenti possono visualizzare i profili di espressione genica come immagini del profilo GEO. A differenza di altri strumenti di analisi, GEO2R è indipendente dai record di set di dati selezionati e può interrogare i dati effettivi inviati direttamente dagli investigatori. Più del 90% degli studi GEO può essere analizzato utilizzando questo metodo17. Il flusso di lavoro di GEO2R con le fasi coinvolte nell'analisi dei dati di microarray utilizzando GEO2R è mostrato nella Figura 1.

  1. Apri il sito web di GEO2R.
  2. Inserire l'adesione al GSE utilizzando il GEO nello spazio di ricerca denominato "Adesione GEO" e cliccare sul pulsante Imposta. Crea etichette cancro e poi normale.
  3. Assegna i campioni in base al tipo assegnando prima il cancro seguito da quello normale.
  4. Fare clic su Analizza senza modificare i parametri predefiniti.
  5. Clicca sull'elenco completo dei geni e scarica i dati in formato file .tsv. .tsv deve essere convertito in .xlsx prima di elaborare ulteriormente i dati.
  6. Converti il cambio di2 pieghe logaritmico in cambio di piega utilizzando la formula [=(2)^(Nx), dove N è la posizione della cella] in Excel.
  7. Inoltre, sottoporre i dati ottenuti nel passaggio 4.6 per ottenere i DEG applicando un tasso di false scoperte (FDR) del 5% o un valore p aggiustato (valore p regolabile) <0,05 e un cambiamento di >2,0 volte per i geni sovraregolati e di <0,5 volte per i geni sottoregolati.
    NOTA: FDR è una correzione applicata ai valori p per tenere conto di più test e questi due non possono essere trattati come sinonimi l'uno dell'altro. L'aggiustamento FDR è fondamentale per controllare il tasso di false scoperte quando si esegue un gran numero di test di ipotesi.
  8. Identificare l'elenco dei geni unici rispetto allo studio precedentemente pubblicato sottoponendo i DEG utilizzando uno strumento generatore di diagrammi di Venn disponibile gratuitamente online (Pangloss) per generare il diagramma di Venn per la segregazione di DEG comuni e unici (vedi Tabella dei materiali).
  9. Inoltre, sottoponi l'elenco dei geni unici per identificare l'ontologia genetica.
    NOTA: Diverse funzioni GO come l'Ontologia Genica: Funzione Molecolare (GO: MF), l'Ontologia Genica: Processi Biologici (GO: BP) e l'Ontologia Genica: Componente Cellulare (GO: CC) possono essere generate utilizzando g: Profiler (vedi Tabella dei Materiali) o PANTHER (vedi Tabella dei Materiali), entrambe sono programmi online disponibili gratuitamente. L'analisi basata su GO eseguita utilizzando g: Profiler.
  10. Per ottenere la distribuzione dei DEG nel genoma sui singoli cromosomi, utilizzare ShinyGO (vedi Tabella dei materiali).
  11. Incolla l'intero elenco di geni unici ottenuti da GEO2R nella scheda di ricerca ShinyGO e la specie più corrispondente selezionata è stata l'Homo sapiens. Il cutoff FDR utilizzato era del 5%.
  12. Eseguire la selezione dei DEG ottenuti da GEO2R per ulteriori studi di validazione a livello proteico. Il flusso di lavoro per l'estrazione delle informazioni aggiuntive ma cruciali sui DEG è stato mostrato nella Figura 2.

5. Trovare un alias per un gene/proteina

  1. Apri la pagina HPRD (vedi Tabella dei materiali) e fai clic sul pulsante Query .
  2. Inserisci il nome della proteina o l'identificatore HPRD nella rispettiva scheda di ricerca, premi il pulsante Cerca in basso
    NOTA: Si aprirà una pagina con una scheda etichettata come "NOMI ALTERNATIVI", fai clic su di essa e apparirà l'alias per questo gene o proteina.

6. Trovare il simbolo genetico ufficiale per i DEG

  1. Per trovare il simbolo ufficiale del gene, apri il Comitato per la nomenclatura genetica HUGO (HGNC) (vedi Tabella dei materiali).
  2. Digita il nome ottenuto nell'analisi GEO2R nella barra di ricerca della pagina HGNC e clicca sul simbolo di ricerca . I risultati della ricerca mostreranno a quale simbolo genetico ufficiale corrisponde esattamente il termine.
  3. Clicca su quel link e scopri il "simbolo genetico" ufficiale menzionato lì.

7. Trovare il locus genico dei DEG

  1. Apri la pagina del gene visitando il link su NCBI.
  2. Digita il simbolo del gene ufficiale del gene e fai clic su cerca.
  3. Nel risultato controlla attentamente il gene e l'organismo a cui appartiene. Una volta accertato che la corrispondenza sia corretta, fai clic sul link e procedi ulteriormente.
    NOTA: In sintesi, sotto la voce "Contesto genomico" ci sarà la posizione che è in realtà il locus del gene.

8. Trovare informazioni sui DEG su OMIM Pagegene locus dei DEG

  1. Aprire la pagina OMIM (vedi Tabella dei Materiali).
  2. Inserire il nome o il simbolo del gene dell'informazione genetica, in particolare "gene-fenotipo".
  3. Fai clic sul pulsante di ricerca e appariranno i risultati per il gene di interesse. Il display fornisce informazioni sulla "Relazione gene-fenotipo".

9. Trovare la localizzazione, il dominio e il motivo della proteina e la natura secretoria della proteina codificata dal gene

  1. Aprire la pagina HPRD (vedere Tabella dei materiali).
  2. Una volta aperto, inserisci il nome della proteina o l'indicatore HPRD nella rispettiva scheda di ricerca e premi il pulsante Cerca in basso.
  3. Si aprirà una pagina con una scheda etichettata come "Riepilogo". Scendete fino in fondo alla pagina e controllate la scheda di localizzazione per conoscere la localizzazione primaria e quella "secondaria" alternativa.
    NOTA: Nella stessa pagina, sotto "localizzazione" c'è una scheda "Domini e motivi" dove sono elencati i domini e i motivi per la proteina di interesse (se presenti). Sempre nella stessa pagina, adiacente alla scheda "Domini e motivi" c'è una scheda "Espressione" con sottoscheda "sito di espressione". Qualsiasi proteina che è stata segnalata per essere detettata in qualsiasi fluido biologico può essere considerata di natura "secretoria". Se la proteina di interesse è stata segnalata in uno qualsiasi dei fluidi biologici come plasma, siero, sperma, lacrime extra, sarà elencata lì.

10. Selezione della proteina per la convalida e ulteriore valutazione per la diagnosi o la prognosi del tumore maligno di interesse

NOTA: Una volta identificate le molecole uniche, la sfida più grande è come convalidarle. Di solito, lo studio dei microarray fornisce l'espressione a livello di mRNA, ma per la diagnosi o la prognosi della malattia, la lettura dei livelli proteici è fondamentale. Per lo stesso, i campioni o le linee cellulari dello stesso cancro derivati da pazienti o pazienti devono essere sottoposti a screening per sapere se la molecola è effettivamente espressa lì e se è in grado di discriminare tra cancro e prognosi normale, o buona e cattiva, o distinguere tra stadi precoci e tardivi della malattia. Per convalidare la molecola candidata, il Western blot, i saggi di immunoassorbimento enzimatico, ad esempio ELISA, immunoprecipitazione, immunoistochimica, immunocitochimica o saggi sono tecniche utili 18,19,20. Allo stesso tempo, tutti questi test richiedono anticorpi per rilevare l'antigene presente nei campioni. Gli anticorpi sono articoli costosi, quindi è sempre meglio selezionare gli anticorpi in base ai seguenti punti:

  1. Verificare se l'anticorpo ha già riportato articoli di ricerca precedentemente pubblicati in altre neoplasie.
  2. In caso contrario, controlla l'azienda fornitrice di anticorpi e verifica se fornisce una scheda tecnica con un'immagine del blot, o immunocitochimica o immunoistochimica.
    NOTA: Se si desidera eseguire l'immunoistochimica, ma l'anticorpo è disponibile solo per il test ELISA, l'uso dell'anticorpo può essere rischioso, soprattutto se la molecola bersaglio è una molecola portatrice di dominio transmembrana ma non il peptide segnale. Inoltre, se l'anticorpo è monoclonale o policlonale, meglio preferire un anticorpo monoclonale.

Risultati

Ad esempio, il GSE161533 di adesione GEO è stato utilizzato per studiare i geni esplorati in modo differenziale nell'ESCC. I risultati rappresentativi dell'analisi sono stati mostrati nella Figura 3. GEO2R genera un grafico del vulcano utile per identificare eventi che differiscono in modo significativo tra due gruppi di soggetti sperimentali. Il grafico del vulcano presenta la distribuzione genica complessiva con la significatività trasformata di -log 10 (p-value) sull'asse y e le variazioni di piegatura (con la variazione di piegatura trasformata log2 ) sull'asse x (Figura 3A), ed è utile per visualizzare i geni che sono espressi in modo differenziale. I geni evidenziati sono espressi in modo significativamente differenziale a un cut-off del valore p di 0,05 (blu = sottoregolato, rosso = sovraregolato).

Un grafico della differenza media (MD) mostra la variazione di2 volte logaritmica rispetto a. valori medi di espressione log2 ed è utile per visualizzare i geni che sono espressi in modo differenziale. Nel grafico MD, i geni in cui il log2 ha trasformato la piega cambia sull'asse y e registra l'espressione del valore medio sull'asse x (Figura 3B). I geni evidenziati sono espressi in modo significativamente differenziale a un valore p predefinito di 0,05 (blu = sottoregolato, rosso = sovraregolato). I grafici dei vulcani incontrano gli stessi problemi dei grafici MA in termini di visualizzazione delle informazioni provenienti da due soli trattamenti contemporaneamente21.

Inoltre, è stata utilizzata l'approssimazione e la proiezione uniforme del collettore (UMAP)22 per valutare la correlazione tra ESCC e campioni normali (Figura 3C). Sebbene la maggior parte dei campioni appartenesse alle rispettive categorie, due campioni ESCC sono stati trovati nei campioni normali.

GEO2R ha presentato un grafico interattivo 2D della densità di espressione (Figura 3D), che ha dimostrato efficacemente la densità di espressione nel set di dati. Questo grafico è utile per determinare se la normalizzazione è necessaria per i DEG. In questo grafico, l'asse y indica la densità, mentre l'asse x denota l'intensità sia per l'ESCC (colore verde) che per il normale (colore viola).

La distribuzione dei valori tra i diversi campioni, tra cui ESCC e normale, è stata mostrata nel box plot. Queste distribuzioni suggeriscono se i campioni sono effettivamente adatti per l'analisi dell'espressione differenziale. I valori mediani-centrici indicano chiaramente che i dati sono normalizzati e comparabili in modo incrociato (Figura 3E).

I geni identificati vengono filtrati in base a p < 0,05 e criteri di fold-change. I geni invariati (con fold-change tra <2,0 e >0,50) sono stati rimossi dall'analisi. Inoltre, se confrontati con uno studio pubblicato in precedenza, i geni comuni trovati sono solo 514, ma il numero unico di geni ottenuti è 1193. È importante notare che l'identificazione di geni unici utilizzando GEO2R può aiutare non solo a ridurre la ridondanza, ma anche ad arricchire il compendio.

Un elenco parziale dei DEG è stato menzionato nella Tabella 1, mentre un elenco completo dei DEG è fornito nel File supplementare 1. Alcuni dei geni sovraregolati appartengono alla matrice extracellulare, come MMP1 8,23,24, MMP12 23,25, SPP1 8,26, POSTN9 e VCAN 8,27. Tra gli altri geni elencati nella Tabella 1 ci sono CMPK2, AURKA28,29, CHEK127 e CDK130 sono sovraregolati e EMP127, PTK631,32, GPX327, DPT33, FHL134,35 e CRNN 8,36 sono sottoregolati nell'ESCC rispetto agli epiteli normali. POSTN (periostina) è stato sovraregolato nell'ESCC ed è stato riportato anche nel caso dell'adenocarcinoma esofageo. Un precedente studio sull'ESCC ha riportato che l'espressione della proteina POSTN non è stata osservata solo nella regione stromale ma anche nelle cellule tumorali, suggerendo che esiste un'interazione tra tumore-microambiente9. La periostina è una proteina che viene secreta principalmente dalle cellule mesenchimali e svolge un ruolo cruciale nella regolazione, nell'adesione e nella differenziazione degli osteoblasti, nonché nella riparazione delle ferite. Inoltre, la periostina è stata implicata nella progressione del tumore e nelle metastasi in vari tumori, tra cui l'ESCC. Gli studi hanno dimostrato che la periostina è coinvolta nella transizione da epiteliale a mesenchimale (EMT) nei tumori e nell'angiogenesi tumorale, promuovendo la migrazione cellulare, la motilità, l'adesione e la crescita cellulare metastatica dei tumori. Nell'esofago di Barrett, una condizione precancerosa dell'esofago, c'è una significativa sovraregolazione di POSTN, il gene che codifica per la periostina, rispetto al normale tessuto esofageo37. Nell'esofagite eosinofila, una malattia infiammatoria dell'esofago, sia l'mRNA del periostina che i livelli di espressione proteica sono sovraregolati rispetto al normale epitelio esofageo. Allo stesso modo, nell'ESCC, è stato riscontrato che POSTN è sovraregolato di 11 volte nell'analisi dell'espressione genica9. Questi risultati suggeriscono che POSTN può fungere da potenziale biomarcatore per l'ESCC e altri tumori. Inoltre, l'aumento dei livelli sierici di POSTN è riportato in pazienti con carcinoma mammario diagonalizzato con metastasi ossee, riflettendo che POSTN potrebbe anche essere ulteriormente studiato come potenziale biomarcatore metastatico nel siero di pazienti con ESCC. Nel complesso, i POSTN sembrano svolgere un ruolo importante nella progressione tumorale e possono avere potenziali implicazioni cliniche per la diagnosi, la prognosi e il trattamento del cancro.

La distribuzione cromosomica dei DEG sui singoli cromosomi mostra che il numero massimo di geni proveniva dai cromosomi 1-6 e X (Figura 4). L'analisi del percorso basata su ShinyGO ha mostrato che una serie di percorsi cruciali emergono quando l'analisi DEG. Alcuni di questi erano la via di segnalazione IL-17, la digestione e l'assorbimento delle proteine, l'interazione ECM-recettore, la via di segnalazione TNF, la via di segnalazione del recettore Toll-like, la via di segnalazione delle chemochine, l'interazione citochina-recettore delle citochine, la malattia epatica alcolica, i microRNA nel cancro, la disregolazione trascrizionale nel cancro, il ciclo cellulare e la via di segnalazione del recettore NONO-like nell'ESCC. Inoltre, l'arricchimento dei termini GO nei DEG è stato effettuato utilizzando l'analisi del profiler g:. Sono stati arricchiti diversi termini OB per la funzione molecolare (GO: MF), i componenti cellulari (GO: CC) e i processi biologici (GO: BP) (Figura 5). L'elenco di questi termini GO è stato fornito nella Tabella 2.

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Figura 1: Rappresentazione schematica per l'elaborazione degli studi sul carcinoma esofageo a cellule squamose disponibile in omnibus di espressione genica utilizzando il programma GEO2R. Nello schema sono stati mostrati diversi passaggi coinvolti nell'identificazione di geni regolati in modo differenziale (DEG) o molecole regolate in modo differenziale (DEM), inclusi criteri di selezione per i DEG basati sulla variazione di piega >2,0 volte e p < 0,05 per sovraregolati e <0,5 e valore p <0,05 per sottoregolati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Rappresentazione schematica per trovare ulteriori informazioni sui geni regolati in modo differenziale nel carcinoma esofageo a cellule squamose disponibili utilizzando altre risorse disponibili pubblicamente. Inoltre, le informazioni DEG sono cruciali per decidere se devono essere selezionate per un'ulteriore convalida e valutazione in ambito clinico. Informazioni come l'estrazione dell'alias, il simbolo ufficiale del gene, la posizione cromosomica/locus genico, l'OMIM, il dominio/motivo, la natura secretoria della proteina e la disponibilità di anticorpi adatti per la convalida a livelli proteici possono essere ottenute da diverse risorse online. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Distribuzione dello studio con GSE161533 di adesione GEO utilizzando il programma GEO2R per l'identificazione dei DEG tra ESCC e normale. Il programma GEO2R è stato utilizzato con parametri predefiniti che danno origine a (A) Volcano plot che rappresenta la distribuzione genica con -log10 di significato trasformato (p-value) sull'asse y e variazioni di piega (con log2 di variazione di piega trasformata) sull'asse x, (B) MD-plot plot che mostra la variazione di log2 rispetto ai valori medi di espressione log2 per la visualizzazione di geni differenzialmente espressi, (C) UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) mostra la segregazione dei campioni in base ai loro tipi, (D) Complementi del grafico della densità di espressione in quanto controlla la normalizzazione dei dati prima dell'analisi dell'espressione differenziale, (E) Box plot che mostra i valori mediani centrati tra i campioni per indicare che la normalizzazione dei dati è confrontabile in modo incrociato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Distribuzione dei DEG su diversi loci cromosomici utilizzando lo strumento di arricchimento ShinyGO. (A) I geni unici sono stati identificati generando un diagramma di Venn per confrontare gli studi attuali con quelli pubblicati in precedenza. (B) La distribuzione dei DEG sui diversi cromosomi del genoma. (C) Arricchimento del percorso per i DEG utilizzando l'analisi dell'arricchimento basata su ShinyGO. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Grafici di Manhattan per illustrare l'arricchimento dei geni bersaglio con i termini GO utilizzando il Profiler g:. I geni differenzialmente espressi sono stati analizzati mediante g: Profiler e l'arricchimento in termini di OB (MF: funzione molecolare; BP: processo biologico; CC: componente cellulare) e KEGG attraverso le vie Reactome (REAC), WiKi-Pathways (WP), fattore di trascrizione (TF) e base bersaglio di microRNA (MIRNA) sono state rappresentate graficamente nel grafico di Manhattan dove l'asse x è il termine funzionale GO colorato per categoria. Ogni punto colorato rappresenta un termine GO. L'asse y mostra i valori p -log10regolati. I termini GO che sono statisticamente significativi per l'ESCC sono mostrati sull'asse x. MF: Funzione molecolare; BP: Processo biologico; CC: Componente cellulare; MIRNA: MicroRNA; HP: Fenotipo umano. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Elenco parziale dei geni differenzialmente espressi nell'ESCC. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Arricchimento dei termini GO nell'ESCC utilizzando g: Profiler. Clicca qui per scaricare questa tabella.

File supplementare 1: Elenco completo dei geni differenzialmente espressi nell'ESCC. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Da quando sono state coinvolte le tecniche OMICS ad alto rendimento nella biologia del cancro, il tasso di generazione dei dati è stato significativamente aumentato. Ciò rappresenta una sfida per i ricercatori, in particolare per quelli che non hanno una natura esperta di computer. Per superare nel corso degli anni i bioinformatici hanno avuto l'idea di sviluppare un database per fornire dati in modo organizzato. Ciò ha generato una risposta positiva da parte dei ricercatori, in particolare di quelli che non sono interessati alla tecnologia. Inoltre, i dati OMICS sparsi qua e là in letteratura non sono di alcuna utilità per nessuno. Pertanto, per farne un uso corretto, c'è sempre stato bisogno di una piattaforma comune in cui i ricercatori con interessi specializzati possano accedere ai dati. Esiste un certo numero di database su diversi tipi di cancro, tra cui ONCOMINE38, ESCC ATLAS39, database del cancro al pancreas (PCD)40 e DDEC41.

Il concetto di geni differenzialmente espressi (DEG) nasce dall'analisi dei dati di sequenziamento dell'RNA, in cui vengono identificati i geni che hanno cambiamenti significativi nei livelli di espressione in due o più condizioni (come il cancro rispetto alla normalità o il trattamento rispetto al controllo). Sono stati sviluppati diversi strumenti per determinare i DEG, che eseguono test statistici basati su quantificazioni dei geni espressi valutati dalle analisi computazionali delle letture di RNA-seq grezzo o dei rapporti di intensità generati tra la sonda e la sequenza target nel gruppo cancro rispetto al gruppo normale. Questi strumenti forniscono informazioni relative al livello di espressione e all'entità della differenza a coppie per ciascun gene. Le analisi di espressione genica differenziale (DGE) sono utili per comprendere i meccanismi genetici che contribuiscono alle differenze fenotipiche negli organismi. Le analisi DGE sono state applicate per studiare una varietà di processi biologici, tra cui il rilevamento dell'origine tumorale e/o l'analisi del microbioma. Identificando i DEG, queste analisi possono fornire informazioni sui fattori genetici sottostanti che contribuiscono a questi processi biologici coinvolti nella tumorigenesi ESCC21.

Il metodo dello strumento GEO2R, che è disponibile al pubblico ed è il metodo preferito perché la maggior parte degli studi disponibili in letteratura sono stati analizzati utilizzando algoritmi diversi, il che ha portato a enormi differenze nell'analisi dei dati; Pertanto, per evitare queste differenze, è stata utilizzata questa piattaforma user-friendly perché è gratuita e facile da usare. Ciò consente di confrontare condizioni come "Cancro vs. Normale" o "Trattamento vs. Nessun trattamento".

In questo caso, l'ESCC è stato scelto perché è un cancro emergente del tratto gastrointestinale (GI) in India e Cina. Abbiamo scelto GSE161533 di adesione GEO per analizzare utilizzando GEO2R per identificare i DEG tra ESCC e ESCC normale. Lo studio è stato scelto perché non includeva pazienti con ESCC che avevano precedentemente ricevuto un trattamento chemioterapico o radioterapico. Si preferisce utilizzare campioni accoppiati, se disponibili (ESCC e normale adiacente dello stesso paziente) per qualsiasi analisi. Questo perché ci si aspetta che il genoma dell'ESCC e dei tessuti normali dello stesso paziente sia molto simile poiché provengono dallo stesso background genetico e perché i tessuti si trovano nello stesso ambiente. L'utilizzo di campioni accoppiati aiuta a evitare distorsioni nell'analisi che potrebbero essere introdotte se si dovessero confrontare ESCC e tessuti normali di pazienti diversi con background genetici diversi. L'utilizzo di campioni accoppiati consente un'identificazione più accurata delle differenze nell'espressione genica tra ESCC e tessuti normali all'interno dello stesso paziente, il che può aiutare a migliorare la specificità dei risultati. Questo approccio è spesso utilizzato negli studi di espressione genica per controllare la variabilità individuale e migliorare la potenza analitica.

Abbiamo preso tutti i dati campione dai soggetti coinvolti nello studio e abbiamo utilizzato la piattaforma GEO2R per analizzare i dati di espressione genica. In primo luogo, abbiamo assegnato campioni di cancro, seguiti da campioni normali. Dopo aver assegnato questi campioni, i parametri predefiniti disponibili nel database GEO2R sono stati utilizzati per identificare i campioni di cancro o di trattamento e i campioni normali o di controllo. Per differenziare tra campioni tumorali e campioni normali, è stata impostata una soglia del valore p aggiustato (agg. P Val) inferiore a 0,05 e una soglia di variazione della piega di >2,0 per i geni sovraregolati e una soglia del valore p aggiustato (agg. P Val) inferiore a 0,05 e una soglia di variazione della piega di <0,5 per i geni sottoregolati. Queste soglie sono state comunemente utilizzate negli studi di espressione genica per identificare i geni differenzialmente espressi tra cancro e normale. È importante notare che la scelta delle soglie di significatività può influenzare il numero e l'identità dei geni identificati come espressi in modo differenziale. Inoltre, è importante valutare attentamente la rilevanza biologica dei geni identificati ed eseguire ulteriori studi di convalida per confermare i risultati.

In letteratura, c'è stata una tendenza a riportare solo i geni con una variazione di almeno 2 volte per i geni sovraregolati e di <0,5 volte per i geni sottoregolati, specialmente negli studi di microarray e proteomica42. In studi precedenti, un cambiamento di fold di >1,5 volte è stato considerato come sovraregolato e un cambiamento di <0,67 volte per i geni sottoregolati43,44, ma le tendenze della letteratura nell'ultimo decennio mostrano chiaramente che un cambiamento di ripiegamento più elevato è preferito in gran parte perché quando gli esperimenti di convalida vengono eseguiti su candidati con un basso valore di ripiegamento, questi sono deboli o non è stata trovata alcuna correlazione tra i dati dell'mRNA e dei livelli proteici45. C'è un lato oscuro nella scelta di un cambiamento di piega più alto è che a volte si perdono alcune molecole che sono biologicamente rilevanti nella malattia o nel cancro, ma semplicemente omesse a causa del cutoff preferito per fare l'elenco di DEG/DEM. Inoltre, la letteratura è orientata a riportare che i DEG preferiscono in particolare le molecole sovraregolate o sovraespresse piuttosto che quelle sottoespresse. Inoltre, se l'espressione delle molecole è conforme agli stessi modelli di sovraregolazione o sovraespressione in più studi, indipendentemente dal fatto che siano per lo stesso cancro o malattia, è un approccio preferito tra gli scienziati. Inoltre, se lo stesso modello di sovraespressione viene osservato in più malattie e riportato in letteratura, è di nuovo ampiamente accettato nella comunità scientifica.

Inoltre, la somiglianza delle malattie dipende dal fatto che vengano utilizzati dati di microarray o letteratura per il confronto. Infine, le descrizioni vagamente definite delle grandezze di espressione differenziale in letteratura mostrano solo una correlazione limitata con i dati di variazione di piegatura dei microarray46.

Inoltre, un compendio può fornire informazioni aggiuntive da database come NCBI Entrez gene47, HGNC48, OMIM49, HPRD50,51, Ensemble52, KEGG53, WikiPathways54, GO55, miRBase56 e DGV57. Durante l'utilizzo di GEO2R, una valutazione di UMAP mostra come i campioni sono correlati. Nell'analisi attuale, due campioni ESCC si popolano con campioni normali, suggerendo che c'è un errore di campionamento o che i campioni ESCC sono abbastanza eterogenei da apparire nel gruppo dei campioni normali.

Lo strumento GEO2R è facile da usare e facilmente accessibile, ma presenta alcune limitazioni. GEO2R non è in grado di generare grafici PCA e mappe di calore o di filtrare campioni dopo il controllo di qualità. Fornisce un solo diagramma di Venn per i confronti di campioni all'interno della stessa serie. GEO2R è limitato ai file Series Matrix, impedendo confronti tra serie. Inoltre, GEO2R analizza solo i dati dei microarray e non dispone di controlli di qualità per la normalità dei campioni o la comparabilità incrociata. GEO2R non consente un numero illimitato di risultati di ricerca e visualizza solo i primi 250 geni per ogni dato confronto a coppie all'interno di un set di dati. Analizza anche i set di dati con repliche campionarie insufficienti per una solida analisi statistica. GEO2R fornisce dati nel log fold change, che richiedeva la conversione in fold-change utilizzando r o in un foglio excel. Inoltre, per rappresentare i geni up- e downregolati è necessario utilizzare un altro software o strumento online per creare heatmap 58,59,60.

In sintesi, in questo articolo viene fornita una semplice pipeline, che può essere utilizzata per creare un compendio per qualsiasi tipo di tumore maligno con piccole modifiche. I compendi sono necessari per supportare gli scienziati biomedici, in particolare per la scoperta di biomarcatori, fornendo le molecole candidate per la convalida in ambito clinico per il loro utilizzo sia per la prognosi che per la diagnosi.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

MKK è beneficiario della borsa di studio TARE (Grant # TAR/2018/001054) extramurale grant (Grant # 5/13/55/2020/NCD-III) rispettivamente dal Science and Engineering Research Board (SERB), Dipartimento di Scienza e Tecnologia e dall'Indian Council of Medical Research (ICMR), Governo dell'India, Nuova Delhi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
NCBI-PUBMEDNCBIFacendo riferimento alla sezione 1. necessario per la ricerca della letteratura
Un laptop/macbook o personal computer con connessione internet e un browser web.
g:ProfilerELIXIR infrastructurehttps://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gostFacendo riferimento alla sezione 4.10. necessario per l'arricchimento di GO:MF, GO:BP e GO:CC
Espressione genica omnibusNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/Facendo riferimento alla sezione 3.1. necessario per la ricerca nel database di studi di microarray
GEO2RNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/Facendo riferimento alla sezione 3.2. necessaria per l'analisi dei dati utilizzando lo strumento GEO2R
GoogleGooglehttps://www.google.comFacendo riferimento alla sezione 1.1. richiesta per la ricerca nella letteratura
HGNCHGNC è un comitato dell'Organizzazione per il genoma umano (HUGO)https://www.genenames.orgFacendo riferimento alla sezione 6.1 richiesta per conoscere il simbolo genetico ufficiale dei DEG 
Istituto diBioinformatica HPRD, Bangluru http://hprd.orgFacendo riferimento alla sezione 5.1 necessaria per informazioni sull'architettura delle proteine 
OMIM  Johns Hopkins University, Baltimorahttp://www.omim.org/entryFacendo riferimento alla sezione 8.1 necessaria per conoscere l'ID OMIM di un particolare gene /
DEG Programma PanglossSviluppato da Chris Seidelhttp://www.pangloss.com/seidel/Protocols/venn.cgiFacendo riferimento alla sezione 4.9. necessario per generare il diagramma di Venn
PANTHERThomas lab presso la University of Southern Californiahttp://www.pantherdb.org/geneListAnalysis.doFacendo riferimento alla sezione 4.10. richiesta per l'arricchimento di GO:MF, GO:BP e GO:CC
ShinyGO South Dakota State Universityhttp://bioinformatics.sdstate.edu/goFacendo riferimento alla sezione 4.10. richiesta per l'assegnazione dei DEG sui cromosomi
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