Osservazione della funzione sistolica degli atri destri isolati da porcellini d'India

Sommario

Il presente protocollo descrive un metodo efficace per lo screening di farmaci che aumentano la contrattilità miocardica utilizzando atri destri isolati da cavie.

Abstract

L'insufficienza cardiaca cronica comune (CHF) è caratterizzata da una compromissione della funzione di riempimento e/o eiezione ventricolare, che porta a un'insaziabile gittata cardiaca e ad un aumento dell'incidenza. Il declino della funzione sistolica cardiaca è un fattore chiave nella patogenesi della CHF. La funzione sistolica è semplicemente il riempimento di sangue ossigenato nel ventricolo sinistro, seguito dal sangue che viene pompato in tutto il corpo durante un battito cardiaco. Un cuore debole e l'incapacità del ventricolo sinistro di contrarsi in modo appropriato al ritmo del battito cardiaco indicano una scarsa funzione sistolica. Molte erbe tradizionali sono state suggerite per rafforzare la funzione sistolica del cuore nei pazienti. Tuttavia, nel processo di ricerca sulla medicina etnica mancano ancora metodi sperimentali stabili ed efficienti per lo screening di composti che aumentano la contrattilità miocardica. Qui, prendendo come esempio la digossina, viene fornito un protocollo sistematico e standardizzato per lo screening di composti che aumentano la contrattilità miocardica utilizzando atri destri isolati da cavie. I risultati hanno mostrato che la digossina potrebbe migliorare notevolmente la contrattilità dell'atrio destro. Questo protocollo sistematico e standardizzato vuole fungere da riferimento metodologico per lo screening dei principi attivi dei farmaci etnici nel trattamento della CHF.

Introduzione

L'insufficienza cardiaca è causata da infarto del miocardio, miocardiopatia, sovraccarico emodinamico, infiammazione e altre cause di lesioni miocardiche, che modificano l'anatomia e l'attività del miocardio e, in ultima analisi, portano al fallimento del pompaggio o del riempimento ventricolare. Palpitazioni, stanchezza e ritenzione idrica sono i principali sintomi clinici primari¹. La CHF è una condizione cronica di insufficienza cardiaca che può essere mantenuta, deteriorarsi o mostrare scompenso nel tempo e la sua incidenza e prevalenza aumentano con l'età^{di 2} anni. Il declino della funzione sistolica cardiaca è un fattore chiave nella patogenesi di CHF³. L'attuale trattamento medico per la malattia prevede principalmente l'uso di farmaci antipertensivi come gli inibitori dell'enzima di conversione dell'angiotensina, i β-adrenergici (che inibiscono l'eccessiva attivazione del sistema neuroormonale, ovvero il sistema simpatico e il sistema renina-angiotensina-aldosterone), o i diuretici (che riducono la congestione)⁴. Tuttavia, i segni clinici dell'insufficienza cardiaca causata dalla ridotta gittata cardiaca e dalla riserva non sono spesso affrontati negli studi che esaminano l'impatto di questi trattamenti medici⁵.

I farmaci inotropi positivi sono progettati per aumentare la contrattilità miocardica. I glicosidi cardiaci, gli inibitori della fosfodiesterasi e gli agonisti del recettore β-adrenergico sono usati come farmaci inotropi positivi per il trattamento dell'insufficienza cardiaca. I glicosidi cardiaci sono principalmente derivati della digitale ; un esempio è la digossina, che è il derivato della digitale più utilizzato ed è derivato dalla Digitalis lanata (digitale bianca)⁶. Si legano selettivamente alla Na⁺/K⁺-ATPasi sulla membrana cellulare per aumentare la concentrazione intracellulare di calcio e, quindi, migliorare la contrattilità cardiaca e la gittata sistolica senza aumentare l'assunzione di ossigeno, migliorando così l'efficienza cardiaca⁷. Oltre ai glicosidi cardiaci, la maggior parte dei farmaci inotropi positivi, come gli inibitori della fosfodiesterasi e gli agonisti del recettore β-adrenergico, aumentano la frequenza cardiaca e il consumo di ossigeno del miocardio, aumentando al contempo il carico di calcio nelle cellule miocardiche per migliorare la contrattilità miocardica, che può provocare aritmie e ipotensione clinicamente gravi e, quindi, un aumento della mortalità⁸. Pertanto, l'applicazione clinica di questi farmaci inotropi è limitata. Al fine di evitare complicazioni causate da elevati livelli intracellulari di calcio, è necessario sviluppare modulatori inotropi più sicuri e altamente efficaci per il trattamento della CHF (Figura 1).

Negli ultimi decenni, sono stati condotti molti studi per generare e analizzare composti in grado di supportare le proprietà inotrope positive dell'emodinamica cardiaca. Molte medicine tradizionali cinesi (MTC), come Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth., Apocynum venetum L. e Sophora alopecuroides L., tra gli altri, possono migliorare la contrattilità miocardica ^9,10,11. Gli studi hanno dimostrato che la MTC e i suoi monomeri attivi possono esercitare effetti inotropi positivi attraverso meccanismi diversi rispetto ai farmaci inotropi. Ad esempio, il liguzinolo, una forma di ligustrazina metilata a C₂ e C₅ (uno dei principi attivi del rizoma di levistico di Szechwan), che migliora significativamente la contrattilità dei cuori di ratto isolati aumentando i transitori di calcio del reticolo sarcoplasmatico senza aumentare la frequenza cardiaca, può avere meno effetti collaterali ed essere un trattamento migliore per CHF¹². Inoltre, la matrina è un alcaloide estratto dalla pianta MTC Sophora flavescens Ait. La matrina può inibire l'upregolazione dell'espressione della proteina_3-AR β e diminuire l'espressione di eNOS nei ratti modello di insufficienza cardiaca, aumentando così la loro contrattilità miocardica¹³. Tuttavia, nella ricerca in medicina etnica, mancano metodi sperimentali stabili ed efficienti per lo screening di composti in grado di migliorare la contrattilità miocardica.

È comunemente noto che, rispetto ad altri roditori, i porcellini d'India hanno caratteristiche di elettrofisiologia e di manipolazione del calcio più simili a quelle dell'uomo¹⁴. Da un lato, l'elettrocardiogramma dei porcellini d'India è sufficientemente simile a quello degli esseri umani e la loro manipolazione del Ca²⁺ battito per battito è più simile alla fisiologia umana rispetto a quella dei ratti o dei topi^15,16. D'altra parte, i modelli computazionali dei cardiomiociti di cavia sono stati oggetto di ricerche approfondite e includono sottosistemi cellulari cruciali, tra cui l'energia e il metabolismo delle specie reattive dell'ossigeno¹⁷. Pertanto, gli atri destri isolati dalle cavie sono ampiamente utilizzati per lo screening di composti che migliorano la contrattilità miocardica. Qui, prendiamo la digossina come esempio per fornire un protocollo sistematico e standardizzato per lo screening di composti che migliorano la contrattilità miocardica utilizzando atri destri isolati da cavie. Pertanto, questo lavoro fornisce un riferimento metodologico per lo screening dei principi attivi dei farmaci etnici nel trattamento della CHF.

Protocollo

Il protocollo sperimentale è stato condotto in conformità con i requisiti del Comitato per l'uso e l'uso degli animali da laboratorio e del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso la Ningxia Medical University. Per il presente studio sono stati utilizzati porcellini d'India maschi di Dunkin-Hartley del peso di 300-450 g. L'effetto della digossina sulla contrattilità è stato osservato negli atri destri isolati delle cavie (Figura 2).

1. Preparazione all'ossigenazione degli atri destri isolati dei porcellini d'India

1. Preparare gli strumenti sperimentali, tra cui un sistema di acquisizione ed elaborazione del segnale biologico, un trasduttore di forza muscolare JH-2, un bagno Magnus, un gancio di ventilazione a forma di L, forbici spesse, una capsula di Petri, paraffina, ecc. (vedi Tabella dei materiali).
2. Preparare 1.000 mL di soluzione di Krebs-Henseleit (soluzione K-H) aggiungendo 7,02 g di NaCl (120,0 mM), 2,10 g di NaHCO₃ (25,0 mM), 0,30 g di KCl (4,0 mM), 0,07 g di MgSO₄ (0,6 mM), 0,07 g di NaH₂PO₄ (0,6 mM), 0,28 g di CaCl₂ (2,5 mM) e 1,98 g di glucosio (11,0 mM) in 1.000 mL di acqua bidistillata, e risciacquare il bagno Magnus due o tre volte (vedi Tabella 1 e Tabella dei materiali).
   NOTA: Mantenere la temperatura della soluzione K-H a 37 °C ± 1 °C.
3. Preparare 100 mL di soluzione K-H a basso contenuto di calcio aggiungendo 0,70 g di NaCl (120,0 mM), 0,21 g di NaHCO₃ (25,0 mM), 0,03 g di KCl (4,0 mM), 0,01 g di MgSO₄ (0,6 mM), 0,01 g di NaH₂PO₄ (0,6 mM), 0,01 g di CaCl₂ (0,8 mM) e 0,20 g di glucosio (11,0 mM) in 100 mL di acqua bidistillata (vedere Tabella 1 e Tabella dei materiali).
4. Collocare circa 20 mL della soluzione K-H a 37 °C nella bacinella operativa (vedere la Tabella dei Materiali).
5. Distribuire 5 mm di paraffina densa sul fondo della capsula di Petri, quindi riempire la piastra di Petri con la soluzione K-H a 37 °C (vedi Tabella dei materiali).
6. Installare il gancio di ventilazione a forma di L sull'estremità del tubo di lattice della vescica, inserirlo nella capsula di Petri e regolare a 1-2 bolle/s (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: Regolare lentamente le bolle; Se l'azione è troppo rapida, l'ossigeno potrebbe presto esaurirsi.

2. Preparazione di atri destri isolati da porcellini d'India

1. Pesare i porcellini d'India su una bilancia (vedi Tabella dei materiali).
2. Indurre l'anestesia utilizzando una scatola di induzione con isoflurano al 5% in ossigeno al 100%, quindi passare a un cono nasale con isoflurano all'1,5%-3% per la manutenzione (vedere la Tabella dei materiali).
3. Tagliare l'arteria carotide con delle forbici ruvide e indurre il dissanguamento prima di metterlo su un piatto. Quindi, usando le forbici, apri il torace (iniziando con il processo xifoideo e separando completamente i lati per esporre il cuore) e stacca il pericardio.
   1. Tenere il cuore sollevato con la mano sinistra, usare la mano destra per tagliare il cuore dalla radice dell'aorta e posizionarlo rapidamente nella bacinella operatoria con la soluzione K-H. Infine, premere delicatamente il ventricolo con la mano due o tre volte, spremere il sangue ventricolare e posizionare il cuore nella capsula di Petri.
      NOTA: L'azione deve essere rapida e completata in 2-5 minuti e la temperatura deve essere controllata a 35 °C. La temperatura della soluzione K-H deve essere controllata a 37 °C.
4. Fissare la punta del cuore alla capsula di Petri rivestita di paraffina con un ago fornendo ossigeno (60 bolle/min).
5. Identifica l'atrio destro.
   NOTA: Nelle cavie, gli atri sono separati sulla loro superficie ventrale dall'arteria polmonare e dorsalmente dall'aorta. Sia l'atrio sinistro che quello destro sono attaccati ai ventricoli come un "triangolo rovesciato", e l'atrio destro è leggermente più piccolo dell'atrio sinistro e ha bordi irregolari. Il miocardio del ventricolo destro è sottile e l'estremità superiore del collasso è l'atrio destro; il ventricolo sinistro è più gonfio e la distribuzione dei vasi coronarici è ricca¹⁸ (Figura 3).
6. Sollevare delicatamente il bordo dell'atrio destro con una pinza oftalmica e tagliare lungo la giunzione atrioventricolare (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: Evitare di danneggiare il nodo seno-atriale e cercare di tagliare più vicino al ventricolo mentre si taglia lungo la giunzione atrioventricolare. In questo passaggio si può osservare una contrazione ritmica automatica dell'atrio destro.
7. Utilizzare suture chirurgiche 4-0 (vedi Tabella dei materiali) per legare rispettivamente la parte superiore e inferiore dell'atrio destro (entrambe le estremità della "linea diagonale"), con un'estremità ad anello e l'altra estremità a sinistra con un'estremità a filo lungo anch'essa ad anello.
   NOTA: Cercare di legare il minor numero possibile di tessuti quando si legano entrambe le estremità della "linea diagonale" degli atri.

3. Misurazione e registrazione della funzione sistolica di atri destri isolati da cavie

1. Accendere il computer ed entrare nel sistema di acquisizione ed elaborazione del segnale biologico (vedi Tabella dei materiali). Regolare il guadagno (50 mV), la costante di tempo (CC), il filtro (20 Hz) e la velocità di scansione (1,00 s/div) dopo aver determinato il canale di connessione (primo canale, tensione).
2. Appendere un'estremità del campione al gancio di ventilazione a forma di L con la capsula di Petri e l'ossigeno accanto al bagno Magnus. Appendere l'altra estremità del campione al trasduttore di forza muscolare JH-2 (vedi Tabella dei materiali).
3. Osservare la curva sistolica atriale, regolare il precarico a 0,5-1,0 g e attendere che si stabilizzi (circa 30 minuti).
   NOTA: Cambiare la soluzione K-H ogni 20 minuti. Quando è normale, prendere la curva osservata come standard e contrassegnare "normale". Se lo schermo viene scansionato un po' velocemente, questo deve essere rallentato.
4. Somministrare 0,2 mL di soluzione K-H a basso contenuto di calcio e osservare per 5 minuti fino a quando la curva non diminuisce più.
5. Somministrare 0,2 mL di digossina al 5% (vedere Tabella dei materiali), osservare per 5 minuti, lavare tre volte e poi tornare alla normalità.
   NOTA: Contrassegnare l'amministrazione. Quando l'effetto è evidente, scansiona lo schermo più velocemente. Quando la curva non sale più, cioè quando l'ampiezza di contrazione non aumenta più, lavare tre volte velocemente; In caso contrario, si verificherà un'aritmia, che influenzerà i risultati dei successivi esperimenti farmacologici.
6. Raccogliere i dati e salvarli su un disco floppy.

Risultati

Una diminuzione della contrattilità miocardica provoca una gittata cardiaca insufficiente, che porta alla CHF (Figura 1). Questo protocollo ha permesso la registrazione degli effetti di diversi farmaci sulla funzione sistolica di atri destri isolati da cavie e quindi lo screening rapido di composti da farmaci etnici che aumentano la contrattilità miocardica. Dopo aver collegato l'atrio destro, il trasduttore di forza muscolare JH-2 e il sistema di acquisizione ed elaborazione del segnale bio...

Discussione

La normale attività ritmica del cuore richiede un ambiente fisico e chimico adeguato, così come l'attività degli atri destri isolati. Gli atri destri isolati sono isolati dall'innervazione del corpo e dall'influenza diretta di fattori umorali sistemici, il che significa che si possono osservare cambiamenti nell'attività degli atri destri quando si cambiano i farmaci a cui sono esposti. Le cause fondamentali dell'attività bioelettrica nelle cellule eccitabili sono i cambiamenti nella perm...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sutura chirurgica 4-0	Yangzhou Fuda  Medico  Dispositivi Co.,
5% Digossina (solubile in dimetilsolfossido)	TCI Shanghai	D1828	CAS: 20830-75-5; Purezza: >96,0%
BL-420N sistema di acquisizione ed elaborazione del segnale biologico	Chengdu Tai Meng Software Co., Ltd	1700142S
CaCl2	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24110	CAS: 10043-52-4; Purezza: 96%
di glucosio	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S11022	CAS: 50-99-7; Purezza: 99%
isoflurano	RWD Life Science Co., Ltd	R510-22-16
JH-2	Istituto di ingegneria medica aerospaziale, Pechino, Cina
KCl	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24120	CAS: 7447-40-7; Purezza: 99,5%
Bagno Magnus	Shanghai Future Experimental Equipment Co., Ltd	L046525
MgSO4	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24253	CAS: 7487-88-9; Purezza: 98%
NaCl	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24119	CAS: 7647-14-5; Purezza: 99,5%
NaH2PO4	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24161	CAS: 7558-80-7; Purezza: 99%
NaHCO3	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24153	CAS: 144-55-8; Purezza: 99,8%
Bacino operatorio	Guangzhou Telekuan Medical Instrument Co., Ltd		305 mm x 230 mm
Pinza oftalmica	Suzhou Shuanglu Medico  Strumento Co.,
Forbice operativa oftalmica	Suzhou Shuanglu Medico  Strumento Co.,
Paraffina	Leica Biosystems
Piastra di Petri	Corning	430167	100 mm x 20 mm
Macchina per anestesia per roditori	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd		Tipo ABS (canale singolo)
Scala	Shanghai Yueping Scientific Instrument Co., Ltd	YP1002
Piastra chirurgica	Zhengzhou Ketai  Esperimento  Attrezzature Co.,		21 cm x 31 cm
Forbice per tessuti	Suzhou  Shuanglu Medico  Strumento Co.,  Ltd	SL0023