L'analisi della funzione mitocondriale degli spermatozoi mediante respirometria ad alta risoluzione consente di misurare il consumo di ossigeno degli spermatozoi che si muovono liberamente in un sistema a camera chiusa. La tecnica può essere applicata per misurare la respirazione negli spermatozoi umani, che fornisce informazioni sulle caratteristiche e sull'integrità mitocondriale degli spermatozoi.
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Articolo metodologico
Respirometria ad alta risoluzione per valutare la funzione mitocondriale negli spermatozoi umani
In questo articolo
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Sommario
Abstract
La qualità dello sperma viene spesso studiata mediante lo spermiogramma di routine, che è descrittivo e spesso inconcludente. L'infertilità maschile è associata a un'alterata attività mitocondriale degli spermatozoi, quindi la misurazione della funzione mitocondriale degli spermatozoi è un indicatore della qualità dello sperma. La respirometria ad alta risoluzione è un metodo per misurare il consumo di ossigeno di cellule o tessuti in un sistema a camera chiusa. Questa tecnica può essere implementata per misurare la respirazione negli spermatozoi umani e fornisce informazioni sulla qualità e l'integrità dei mitocondri degli spermatozoi. La respirometria ad alta risoluzione consente alle cellule di muoversi liberamente, il che è un vantaggio a priori nel caso degli spermatozoi. Questa tecnica può essere applicata con spermatozoi intatti o permeabilizzati e consente di studiare la funzione mitocondriale degli spermatozoi intatti e l'attività dei singoli complessi della catena respiratoria. Lo strumento ossigrafo ad alta risoluzione utilizza sensori per misurare la concentrazione di ossigeno accoppiati a un software sensibile per calcolare il consumo di ossigeno. I dati vengono utilizzati per calcolare gli indici respiratori in base ai rapporti di consumo di ossigeno. Di conseguenza, gli indici sono le proporzioni di due tassi di consumo di ossigeno e sono normalizzati internamente al numero di cellule o alla massa proteica. Gli indici respiratori sono un indicatore della funzione mitocondriale e della disfunzione degli spermatozoi.
Introduzione
Si stima che l'infertilità maschile rappresenti il 40%-50% di tutti i casi di infertilità nelle coppie1. Lo spermiogramma convenzionale svolge un ruolo cruciale nel determinare la fertilità maschile; Tuttavia, circa il 15% degli uomini infertili ha parametri spermatici normali2. Inoltre, lo spermiogramma di routine fornisce informazioni limitate sulla funzione degli spermatozoi e non riflette i difetti sottili degli spermatozoi3.
I mitocondri degli spermatozoi hanno una struttura speciale, in quanto sono disposti come una guaina elicoidale attorno ai flagelli. La guaina....
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Protocollo
Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato Etico della Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.
Figura 1: Flusso di lavoro per la respirometria ad alta risoluzione per valutare la funzione mitocondriale in spermatozoi umani intatti e permeabilizzati. Il protocollo è stato suddiviso in quattro diverse fasi: 1) preparazione del campione, 2) calibrazione dell'ossigeno nello strumento Oroboros, 3....
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Risultati
Determinazione della concentrazione ottimale di digitonina negli spermatozoi
In questo protocollo, presentiamo l'uso dell'HRR per monitorare in tempo reale i cambiamenti in OXPHOS negli spermatozoi umani. Poiché il metodo può essere utilizzato per analizzare spermatozoi intatti o permeabilizzati alle digitonine, presentiamo innanzitutto la standardizzazione della concentrazione di digitonina necessaria per permeabilizzare gli spermatozoi (Figura 3).
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Discussione
L'HRR dipende in modo critico da diverse fasi: (a) la manutenzione dell'apparecchiatura, (b) la calibrazione accurata dei sensori di ossigeno, (c) la titolazione del disaccoppiatore26 e, infine, (d) l'uso adeguato degli indici che rappresentano la funzione mitocondriale. La manutenzione dell'attrezzatura è fondamentale. Si raccomanda di sostituire regolarmente le membrane del sensore polarografico di ossigeno e di correggere lo sfondo strumentale. Un lavaggio estensivo dopo il prelievo degli sperm.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo la clinica di Andrologia Fertilab, in particolare José María Montes e Andrea Torrents, per averci permesso di accedere ai donatori. Finanziamento: A.C. è sostenuto da borse di studio dell'Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Ulteriori finanziamenti sono stati ottenuti dal Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Uruguay). P.I. e R.S. sono sostenuti dall'Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 e FMV_1_2017_1_136490 ANII- Uruguay). P.I. è supportato da POS_FMV_2018_1_1007814 e CAP-UDELAR 2020. Le figure sono state illustrate utilizzando Biorender.c....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Senza acidi- Albumina sierica bovina | Sigma Aldrich | A8806 | |
| Adenosina 5'-difosfato sale monopotassico diidrato | Sigma Aldrich | A5285 | |
| Animicina A da streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | |
| Cloruro di calcio | Sigma Aldrich | C4901 | |
| cianuro di carbonile-P- trifluorometossi-fenilidrazone | Sigma Aldrich | C2920 | |
| DatLab versione software 4,2 | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
| D-glucosio | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| L acido glutammico | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L acido malico | Sigma Aldrich | M1000 | |
| Solfato di magnesio | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Siringhe da microlitro | Hamilton | 87900 o 80400 | |
| Fotocamera per microscopio | Basler | acA780-75gc | |
| Microscopio Eclipse E200 con contrasto di fase 10X Ph+ | Nikon | N/A | |
| Fosfato monopotassico | Sigma Aldrich | P5655 | |
| MOPS | Sigma Aldrich | M1254 | |
| Oligomicina A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Ossigrafo-2 K | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
| Cloruro di potassio | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potenza O2k-Respirometro | Strumenti Oroboros | 10033-01 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Lattato di sodio | Sigma Aldrich | L7022 | |
| Piruvato di sodio | Sigma Aldrich | P2256 | |
| Analizzatore di classe di spermatozoi 6.3.0.59 Evolution-SCA Research | Microptic | N/A | |
| Camera di conteggio degli spermatozoi DRM-600 | Millennium Sciences CELL-VU | N/A | |
| Sale disodico succinato | Sigma Aldrich | W327700 |
Riferimenti
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 37(2015).
- Guzick, D. S., et al. Sperm morphology, motility, and concentration in f....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa
Posted by JoVE Editors on 9/26/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. The Protocol and Representative Result sections were updated.
Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:
Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.
to:
Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.
Figure 3 in the Representative Results section was updated from:
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.
