Strategie di quantificazione, valutazione della vitalità e visualizzazione per biofilm di Acinetobacter

Summary

Questo protocollo descrive la preparazione dell'inoculo, la quantificazione del biofilm su piastre per microtitolazione utilizzando un colorante crystal violet, la conta vitale nei biofilm e la visualizzazione dei biofilm di Acinetobacter.

Abstract

L'Acinetobacter provoca infezioni nosocomiali e la sua formazione di biofilm può contribuire alla sopravvivenza su superfici asciutte come gli ambienti ospedalieri. Pertanto, la quantificazione e la visualizzazione del biofilm sono metodi importanti per valutare il potenziale dei ceppi di Acinetobacter di causare infezioni nosocomiali. I biofilm che si formano sulla superficie della micropiastra possono essere quantificati in termini di volume e numero di cellule. I volumi del biofilm possono essere quantificati mediante colorazione con crystal violet, lavaggio, decolorazione con etanolo, quindi misurazione del colorante solubilizzato con un lettore di micropiastre. Per quantificare il numero di cellule incorporate nei biofilm, i biofilm vengono raschiati utilizzando raschietti cellulari, raccolti nella soluzione salina, agitati vigorosamente in presenza di perle di vetro e sparsi su Acinetobacter agar. Successivamente, le piastre vengono incubate a 30 °C per 24-42 ore. Dopo l'incubazione, le colonie rosse vengono enumerate per stimare il numero di cellule nei biofilm. Questo metodo di conteggio può essere utile anche per contare le cellule di Acinetobacter nei biofilm di specie miste. I biofilm di Acinetobacter possono essere visualizzati utilizzando coloranti fluorescenti. Una micropiastra disponibile in commercio progettata per l'analisi microscopica viene impiegata per formare biofilm. Quindi, i biofilm attaccati alla superficie inferiore vengono colorati con SYTO9 e coloranti allo ioduro di propidio, lavati, quindi visualizzati con microscopia a scansione laser confocale.

Introduction

È noto che l'Acinetobacter causa infezioni nosocomiali e la sua infezione umana, soprattutto nelle strutture sanitarie, è sempre più segnalata¹. È diffuso negli ospedali, nelle strutture sanitarie e negli ambienti associati al cibo ^2,3,4. Può sopravvivere per un lungo periodo in ambienti come le superfici ospedaliere come le sponde dei letti, i comodini, la superficie dei ventilatori e i lavandini⁴. Tale persistenza sulle superfici ambientali può essere uno dei fattori significativi che contribuiscono alle infezioni nos....

Protocol

1. Preparazione dell'inoculo batterico

1. Rimuovere il flaconcino di glicerolo conservato a -80 °C.
2. Rimuovere il ceppo batterico (2-10 μL) dal flaconcino utilizzando un puntale sterile per pipetta.
   NOTA: In questo protocollo vengono utilizzati ceppi di Acinetobacter, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) e A. ursingii (24-1).
3. Inoculare una piastra di agar di sangue disponibile in commercio (agar di soia triptica integrato con il 5% di sangue di pecora, vedere Tabella dei materiali....

Results

Seguendo il protocollo, i biofilm di isolati di Acinetobacter, originariamente isolati dalle superfici delle cucine, sono stati formati su una piastra di polistirene a 96 pozzetti, colorata con crystal violet, e i coloranti sono stati solubilizzati in etanolo e misurati per la massa del biofilm (Figura 1). Il numero di biofilm variava notevolmente a seconda dei ceppi che variavano da OD 0,04 a 1,69 (Figura 1). Sulla base dei criteri stabiliti da Stepano.......

Discussion

Utilizzando il protocollo descritto, è stata misurata, visualizzata la formazione di biofilm di isolati di Acinetobacter con vari gradi e sono state stimate le cellule vitali nei biofilm (Figura 1, Figura 2 e Figura 3).

In questo protocollo sono state utilizzate due diverse temperature, 30 °C per la crescita e 25 °C per la formazione del biofilm di Acinetobacter. È stata utilizzata una t.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
per coltura cellulare a 96 pozzetti	SPL	30096	Polistirene Piastra a 96 pozzetti
BHI (Brain Heart Infusion) brodo	Merck KGaA	1.10493.0500
Blood Agar Base Plate	KisanBio	MB-B1005-P50	Terreni di crescita per Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Piastra selettiva per Acinetobacter
Crystal violet soluzione	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer Kit di vitalità del biofilm LIVE/DEAD	Invitrogen	L10316	SYTO9 e ioduro di propidio
Lettore di micropiastre	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Misurazione del biofilm
RBC Perle di vetro	RBC	RG001	Perle di vetro
μ-Piastra a 96 pozzetti Nero	ibidi	89621	Micropiastra destinata alla CLSM