Identificazione di peptidi di piccole vescicole extracellulari da macrofagi derivati dal midollo osseo

Summary

Questo protocollo descrive una procedura per isolare piccole vescicole extracellulari dai macrofagi mediante ultracentrifugazione differenziale ed estrarre il peptidoma per l'identificazione mediante spettrometria di massa.

Abstract

Piccole vescicole extracellulari (sEV) sono tipicamente secrete dall'esocitosi dei corpi multivescicolari (MVB). Queste nanovescicole con un diametro di <200 nm sono presenti in vari fluidi corporei. Queste sEV regolano vari processi biologici come la trascrizione e la traduzione genica, la proliferazione e la sopravvivenza cellulare, l'immunità e l'infiammazione attraverso i loro carichi, come proteine, DNA, RNA e metaboliti. Attualmente, sono state sviluppate varie tecniche per l'isolamento delle sEV. Tra questi, il metodo basato sull'ultracentrifugazione è considerato il gold standard ed è ampiamente utilizzato per l'isolamento delle sEV. I peptidi sono naturalmente biomacromolecole con meno di 50 amminoacidi di lunghezza. Questi peptidi partecipano a una varietà di processi biologici con attività biologica, come ormoni, neurotrasmettitori e fattori di crescita cellulare. Il peptidome ha lo scopo di analizzare sistematicamente peptidi endogeni in specifici campioni biologici mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). Qui, abbiamo introdotto un protocollo per isolare le sEV mediante ultracentrifugazione differenziale e abbiamo estratto il peptidoma per l'identificazione mediante LC-MS/MS. Questo metodo ha identificato centinaia di peptidi derivati da sEVs da macrofagi derivati dal midollo osseo.

Introduction

Piccole vescicole extracellulari (sEV) con un diametro inferiore a 200 nm sono presenti in quasi tutti i tipi di fluidi corporei e secrete da tutti i tipi di cellule, tra cui urina, sudore, lacrime, liquido cerebrospinale e liquido amniotico¹. Inizialmente, le sEV erano considerate come contenitori per lo smaltimento dei rifiuti cellulari, il che ha portato a una ricerca minima nel decennio successivo². Recentemente, prove crescenti indicano che le sEV contengono proteine, lipidi, acidi nucleici e altri metaboliti specifici. Queste molecole vengono trasportate alle cellule bersaglio³, contribuendo....

Protocol

1. Isolamento di piccole vescicole extracellulari

NOTA: Eseguire tutta la centrifugazione nei passaggi 1.1-1.11 a 4 °C.

1. Preparazione di siero fetale bovino privo di sEV (FBS): centrifugare FBS per una notte a 110.000 × g a 4 °C attraverso un'ultracentrifuga (vedere la tabella dei materiali) per rimuovere le sEV endogene. Raccogliere il surnatante, sterilizzarlo con un filtro con una membrana di ultrafiltrazione da 0,2 μm e conservarlo a -20 °C.
2. Placcare circa 3 x 10⁷ macrofagi derivati dal midollo osseo immortalizzato (iBMDM) su una piastra di coltura da 150 mm e aggi....

Results

Per le sEV isolate mediante ultracentrifugazione differenziale (Figura 1), ne abbiamo valutato la morfologia, la distribuzione granulometrica e i marcatori proteici secondo l'International Society for Extracellular Vesicles (ISEV)¹⁷.

In primo luogo, la morfologia delle sEV è stata osservata mediante TEM, mostrando una tipica struttura a coppa (Figura 2A). L'NTA ha mostrato che le sEV isolate erano per lo più co.......

Discussion

Quando si studia la funzione delle sEV, è imperativo ottenere sEV ad alta purezza da campioni biologici complessi per evitare potenziali contaminazioni. È stata sviluppata una varietà di metodi per l'isolamento delle sEV¹³ e, tra questi metodi, i metodi basati sull'ultracentrifugazione differenziale hanno mostrato una purezza relativamente elevata delle sEV. In questo studio, sono stati raccolti 200 mL di surnatante cellulare per 6 ore e circa 200-300 μg di sEV sono stati ottenuti mediante ultrace.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit per il dosaggio delle proteine BCA	Beyotime Technology	P0012
CD9	Beyotime Technology	AF1192
Tubo filtrante centrifugo	Millipore	UFC5010BK
Flaconi per centrifuga polipropilene	Beckman Coulter	357003	Substrato
chemiluminescente	Thermo Fisher Scientific	34580
Ditiotreitolo	Solarbio	D8220	100 g
Terreno di coltura DMEM	Cell World	N? A
GRP94	Cell Signaling Technology	20292
Centrifuga ad alta velocità	Beckman Coulter	Avanti JXN-26	Rotore centrifugo (JA-25.50)
Macrofagi immortalizzati derivati dal midollo osseo (iBMDM)	Istituto nazionale di scienze biologiche, Cina		Fornito dal Dr. Feng Shao (Istituto nazionale di scienze biologiche, Cina)
Iodoacetamide	Sigma	l1149	5 g
Provetta Microfuge polipropilene	Beckman Coulter	357448	1,5 mL, Ultracentrifuga da tavolo
sistema LC nano-ad alte prestazioni	Thermo Fisher Scientific	EASY-nLC 1000
Analisi del tracciamento delle nanoparticelle	Malvern Panalytical	NanoSight LM10	NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Spettrometro di massa HF-X esattivo	Thermo Fisher Scientific	N/A
Soluzione salina tamponata con fosfato	Solarbio	P1020
Provette per centrifuga in poliallomero	Beckman Coulter	326823	Ultracentrifuga
Inibitore della proteasi	Bimake	B14002
Concentratore a vuoto SpeedVac	Eppendorf	Concentrator plus
Ultracentrifuga da tavolo	Beckman Coulter	Optima MAX-XP	Ultracentrifuga rotore (TLA 55)
Microscopio elettronico a trasmissione	HITACHI	H-7650B
TSG101	Sigma	AF8258
Ultracentrifuga	Beckman Coulter	Optima XPN-100	Rotore per ultracentrifuga (SW32 Ti)
Disgregatore cellulare ad ultrasuoni	Scientz	SCIENTZ-IID
Western Blot imager	Bio-Rad	ChemiDocXRs	Image lab 4.0 (beta 7)
β-actina	Sigma	A3853