Imaging del calcio a due fotoni dell'attività del prosencefalo nel comportamento del pesce zebra adulto

L'imaging a fluorescenza del calcio con indicatori geneticamente codificati o coloranti sintetici è stato un potente metodo per misurare l'attività neuronale negli animali comportamentali, inclusi primati non umani, roditori, uccelli e^insetti. L'attività di centinaia di cellule, fino a circa 800 μm sotto la superficie cerebrale, può essere misurata simultaneamente utilizzando l'imaging multi-fotone ^2,3. L'attività di specifici tipi cellulari può anche essere misurata esprimendo indicatori di calcio in popolazioni neuronali geneticamente definite. L'applicazione del metodo di imaging per modelli di piccoli vertebrati apre nuove possibilità nel campo del calcolo neuronale in tutte le regioni del cervello.

I pesci zebra sono un sistema modello ampiamente utilizzato nella ricerca neuroscientifica. Le larve di pesce zebra a circa 6 giorni dopo la fecondazione sono state utilizzate per l'imaging del calcio a causa del loro cervello in miniatura e del corpo trasparente⁴. I giovani pesci zebra (3-4 settimane di vita) sono utilizzati anche per studiare i meccanismi neurali alla base delle vie sensomotorie ^5,6. Tuttavia, il livello massimo di prestazione per i comportamenti complessi, compreso l'apprendimento associativo e i comportamenti sociali, viene raggiunto a un'età più avanzata^{di 7,8} anni. Pertanto, è necessario un protocollo affidabile per studiare molteplici funzioni cognitive nel cervello del pesce zebra adulto utilizzando metodi di imaging. Mentre la larva di zebrafish e il pesce zebra giovane possono essere incorporati nell'agarosio per l'imaging in vivo, il pesce zebra adulto di 2 mesi o più soffre di ipossia in tali condizioni e sono fisicamente troppo forti per essere trattenuti dall'agarosio. Pertanto, è necessaria una procedura chirurgica per stabilizzare il cervello e consentire all'animale di respirare liberamente attraverso le branchie.

Qui, descriviamo un protocollo di poggiatesta che prevede un nuovo design di una singola barra per la testa. Il tempo di intervento ridotto di 25 minuti è due volte più veloce rispetto al metodo^{precedente 9}. Descriviamo anche il design della camera di registrazione (serbatoio semi-esagonale), lo stadio di testa e un meccanismo di bloccaggio rapido per combinare le due parti⁹. Infine, viene anche descritta la configurazione per presentare uno stimolo visivo immersivo per studiare l'attività cerebrale e i comportamenti attivati visivamente. Nel complesso, le procedure qui descritte possono essere utilizzate per eseguire l'imaging del calcio a due fotoni in popolazioni cellulari geneticamente definite in un pesce zebra adulto con la testa trattenuta, consentendo lo studio delle attività cerebrali durante vari paradigmi comportamentali.

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate ed eseguite in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Academia Sinica. I dettagli degli strumenti di ricerca sono disponibili nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione della camera di registrazione

1. Preparare un serbatoio semiesagonale, una piastra di base e uno stadio di testa (Figura 1A; Fascicoli supplementari 1-3). Lo stadio di testa è costituito da due pali metallici fissati a una piastra circolare. La piastra circolare contiene scanalature che possono essere bloccate sulla piastra di base. Dopo essere stati bloccati insieme, lo stadio di testa e la piastra di base vengono posati sul fondo del serbatoio semiesagonale.
2. Posizionare il serbatoio semiesagonale sulla piattaforma sperimentale del microscopio. La piattaforma dovrebbe essere in grado di muoversi nelle direzioni X e Y senza raggiungere il limite della fase di traslazione.
3. Puntare la luce a infrarossi (IR) da 810 nm e la telecamera sul tavolino principale per la registrazione comportamentale. Assicurarsi che il campo visivo della fotocamera sia sufficientemente ampio da contenere un pesce zebra adulto.
   1. Per evitare che il laser a due fotoni e lo stimolo visivo interferiscano con la registrazione comportamentale, impostare rispettivamente un filtro passa-corto da 875 nm e un filtro passa-lungo da 700 nm davanti alla telecamera.
4. Per presentare lo stimolo visivo, fissare delle pellicole di retroproiezione sul lato interno delle tre pareti del serbatoio semiesagonale (Figura 1A).
5. Puntare i tre proiettori verso le tre superfici del serbatoio. Le tre immagini devono essere allineate per formare una scena visiva continua. Per evitare che le luci del proiettore contaminino il segnale di fluorescenza del calcio, posizionare un filtro a densità neutra e un filtro di colore rosso (600 nm, passa-lungo) davanti a ciascun proiettore e posizionare un filtro passa-banda (510/80 nm) davanti al tubo fotomoltiplicatore (PMT).

Figura 1: Strumenti necessari per l'intervento chirurgico del poggiatesta. (A) Il meccanismo di bloccaggio rapido tra la piastra circolare del tavolino di testa e la piastra di base all'interno del serbatoio semiesagonale. I file CAD (Computer-Aided Design) delle parti personalizzate sono disponibili nei file supplementari 1-4. (B) Poggiatesta a forma di Ω per il poggiatesta. (C) Il micromanipolatore a tre assi utilizzato per posizionare la barra di testa sul sito di attacco. Riquadro: orientamento della barra di testa nell'argilla. (D) Cannone per trattenere il pesce durante l'intervento chirurgico. Riquadro: orientamento dei pesci all'interno del cannone. (E) Modulo di caricamento del pesce e micromanipolatore utilizzato per caricare il pesce sul palco di testa. Riquadro: orientamento dei pesci all'interno del modulo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Chirurgia del poggiatesta

1. Preparare una barra per la testa a forma di Ω (Figura 1B; Fascicolo supplementare 4) per il poggiatesta zebrafish. Per fare ciò, attacca un pezzo di argilla da modellare a base di olio a un micromanipolatore a tre assi. Assicurarsi che l'argilla sia abbastanza solida da sostenere la barra per la testa, ma abbastanza morbida da staccarsi dalla barra per la testa dopo il poggiatesta.
2. Inserire un braccio della barra di testa nell'argilla e orientare la barra di testa orizzontalmente (Figura 1C). Ciò garantirà che il successivo fissaggio della barra di testa sul pesce zebra sarà livellato.
   NOTA: La barra di testa può essere realizzata in titanio (24 mg) o acciaio inossidabile (43 mg) e può essere riutilizzata per più esperimenti. Il materiale della barra per la testa non influisce sul comportamento del pesce zebra adulto (il peso varia da 300 a 1.000 mg) sotto un poggiatesta.
3. Preparare il cannone, un tubo cavo per tenere in posizione il corpo del pesce durante l'intervento chirurgico (Figura 1D).
4. Preparare lo 0,03% e lo 0,01% di metansolfonato di tricaina (TMS; vedere la tabella dei materiali) nell'acqua dell'acquario. Questo verrà utilizzato per anestetizzare e mantenere il pesce in uno stato sedato durante l'intervento chirurgico.
5. Preparare quattro tamponi di tessuto per rimuovere la pelle e l'acqua in eccesso dai siti di attacco sul cranio. Per preparare ogni tampone, taglia un tovagliolo di carta in un quadrato di 3 cm e piegalo lungo la sua diagonale per produrre una struttura simile a un tubo. Attorcigliare le estremità del tubo in una punta sottile. Il sito di attacco è molto piccolo, quindi una punta fine consente un controllo più preciso del tampone.
6. Preparare un modulo di caricamento del pesce per il micromanipolatore (Figura 1E).
   NOTA: Il modulo è costituito da due pali in acciaio tenuti insieme da un morsetto per palo ad angolo retto. Un palo si attacca al micromanipolatore, mentre l'altro palo contiene un morsetto rotante che trasporta il pesce. Il modulo viene utilizzato per posizionare il pesce sul palco di testa con un controllo fine. Il morsetto rotante funge da regolatore del passo per modificare l'angolo di beccheggio del pesce.
7. Anestetizzare il pesce con lo 0,03% di TMS nell'acqua dell'acquario. Durante i passaggi seguenti, utilizzare una siringa per erogare lo 0,01% di TMS nell'acqua dell'acquario alla bocca con brevi impulsi ogni 90 secondi. Il flusso d'acqua dalla perfusione dovrebbe indurre il movimento branchiale. Ciò consentirà al pesce di sopravvivere per più di 40 minuti durante l'intervento chirurgico.
   NOTA: Tg[neuroD:GCaMP6f] viene utilizzato a causa della sua ampia espressione dell'indicatore di calcio nel prosencefalo sia allo stadio larvale che adulto¹⁰.
   NOTA: Facoltativamente, utilizzare la perfusione gravitazionale per fornire un flusso d'acqua costante alla bocca durante i periodi dell'intervento chirurgico in cui entrambe le mani sono occupate.
8. Avvolgere il pesce in una capsula (Figura 2A) che trattiene il pesce all'interno del cannone.
   1. Avvolgere il pesce anestetizzato in un pezzo di carta velina umida partendo dalla punta della coda fino a circa 1 mm caudale fino alla branchia. Assicurarsi che l'involucro sia ben stretto per evitare che il pesce scivoli fuori dal tessuto.
   2. Avvolgere un tubo di plastica morbida con una fessura longitudinale (ad esempio, una guaina termorestringente di medie dimensioni tagliata aperta) attorno al fazzoletto di carta per coprire il pesce dall'estremità della coda fino a circa 2 mm caudalmente fino alla branchia. Il tubo assicura che il corpo del pesce rimanga dritto per tutta la durata dell'intervento.
   3. Avvolgi un tovagliolo di carta attorno al tubo a un diametro approssimativamente simile al diametro del cannone.
   4. Avvolgere un tubo di plastica morbida tagliato dal bulbo di una pipetta di trasferimento di plastica attorno al tovagliolo di carta. Ciò garantisce che la capsula possa essere caricata senza problemi nel cannone.
   5. Carica il pesce nel cannone.
9. Utilizzare un bisturi per rimuovere la pelle che copre i siti di attacco, due aree triangolari del cranio rostrolaterali al cervelletto e sopra le branchie (Figura 2B), quindi rimuovere la pelle che copre la regione tra i siti di attacco. Utilizzare tamponi di tessuto per asciugare i siti di attacco e rimuovere la pelle rimanente.
   1. Utilizzare una piattaforma regolabile per sostenere la testa durante la rimozione della pelle, ma la piattaforma non deve entrare in contatto con gli occhi per evitare lesioni agli occhi durante l'operazione.
      NOTA: La rimozione accurata della pelle nei siti di attacco è fondamentale per ridurre gli artefatti da movimento durante l'imaging.
10. Applicare una goccia di colla per tessuti (vedere la tabella dei materiali) al centro di ciascun sito di attacco utilizzando un puntale per pipette da 10 μL.
    NOTA: La colla per tessuti copre i siti di fissaggio e si asciuga rapidamente. La colla tissutale fornisce un'interfaccia di legame tra il cranio e il cemento dentale utilizzato per incollare la barra della testa e impedisce all'acqua delle branchie di raggiungere il sito di attacco.
11. Mettere il corpo del pesce in posizione verticale e posizionare la barra di testa leggermente al di sopra e caudale rispetto ai siti di attacco in preparazione per l'incollaggio della barra di testa.
12. Preparare il cemento dentale (vedere la tabella dei materiali) e utilizzarlo immediatamente per incollare la barra della testa al cranio (Figura 2C). La procedura è urgente e deve essere eseguita entro 45 s.
    1. Mescolare un cucchiaino di polimero con quattro gocce di monomero rapido e una goccia di catalizzatore V. Mescolare uniformemente la miscela per 15 s.
    2. Utilizzare una micropipetta e un puntale da 10 μL per applicare la miscela sui siti di attacco e sulla regione tra i siti. Evitare di coprire le branchie e gli occhi.
    3. Premere delicatamente la barra di testa sul cemento utilizzando il micromanipolatore. Coprire la barra di testa con il cemento rimanente.
    4. Attendere 12 minuti per consentire l'indurimento del cemento dentale. Evitare il contatto dell'acqua con il cemento.
13. Per migliorare l'accesso ottico al prosencefalo per l'imaging del calcio, rimuovere la pelle sopra il telencefalo. La rimozione della pelle può essere eseguita in 3 minuti con cinque tagli utilizzando un bisturi (Figura 2D). Assicurarsi che le goccioline lipidiche che aderiscono alla superficie dei crani vengano rimosse.
14. Dopo l'indurimento, rimuovere l'argilla dalla barra di testa.
15. Trasferire l'intera capsula dal cannone al regolatore di beccheggio nel modulo di caricamento del pesce del micromanipolatore.
16. Usa il micromanipolatore per posizionare il pesce. La barra di testa deve essere posizionata sopra i montanti metallici del palco di testa. Aumentare leggermente l'angolo di beccheggio del pesce in modo che la superficie del prosencefalo possa essere meglio allineata al piano ottico durante l'imaging a due fotoni.
17. Incolla la barra di testa ai montanti metallici con colla polimerizzabile a raggi ultravioletti (UV). Un'esposizione ai raggi UV di 15 s è sufficiente per l'indurimento.
18. Estrarre il pesce dalla capsula e bloccare lo stadio di testa sulla piastra di base all'interno della vasca semiesagonale.
19. Immergi l'animale nell'acqua dell'acquario. Il pesce dovrebbe iniziare a respirare e riprendersi dall'anestesia entro 1-2 minuti.
    NOTA: Facoltativamente, utilizzare la perfusione della siringa per erogare acqua fresca alla bocca.

Figura 2: Passaggi chiave durante l'intervento chirurgico di poggiatesta . (A) Composizione della capsula all'interno del cannone. (B) Siti di attacco sul cranio (rosso). Le frecce rosse specificano i siti dei vasi sanguigni. (C) In alto: barra della testa attaccata al teschio del pesce. Fondo: pesce caricato sul palco di testa. (D) Tagli necessari per rimuovere la pelle sopra il prosencefalo. I numeri indicano la sequenza di taglio. Evitare la rimozione della pelle nel sito contrassegnato (punta di freccia) per evitare il sanguinamento dell'animale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Imaging a due fotoni

1. Accendere il laser e attendere 30 minuti affinché l'alimentazione si stabilizzi. Impostare la lunghezza d'onda a 920 nm e la potenza a circa 50 mW sul campione.
   NOTA: Il raggio laser controllato dallo scanner risonante si muove lentamente nei punti di inversione del percorso di scansione. Per prevenire danni ai tessuti, viene utilizzata una cella di Pockels per ridurre la potenza del laser nei punti di turnaround.
2. Posizionare la camera di registrazione contenente il pesce zebra trattenuto dalla testa sulla piattaforma sperimentale (Figura 3A). La piattaforma dovrebbe essere in grado di muoversi nelle direzioni X e Y senza raggiungere il limite della fase di traslazione.
3. Posizionare la lente dell'obiettivo il più vicino possibile alla superficie del prosencefalo. La lente dell'obiettivo deve essere puntata verso il bordo anteriore della pupilla (Figura 3B).
4. Aprire l'otturatore laser e abilitare il PMT. Sollevare gradualmente la lente dell'obiettivo (~1 mm) fino a rivelare il prosencefalo dorsale nell'immagine a fluorescenza (Figura 3C).
5. Per aumentare il numero di neuroni registrati, utilizzare un attuatore piezoelettrico per acquisire immagini a più profondità (sei piani dell'immagine, a 15 μm di distanza). Ciò aumenterà la resa dei dati a scapito della frequenza dei fotogrammi. Abilita la scansione rapida dell'asse Z per controllare l'attuatore piezoelettrico (modalità uniforme, numero di fette = 6, dimensione del passo = 15 μm, forma d'onda = dente di sega, tempo di flyback = 4 ms, ritardo dell'attuatore = 8 ms).
6. Per la registrazione del comportamento, accendere le luci a infrarossi (IR) da 810 nm su entrambi i lati del serbatoio. Regolare l'angolazione per illuminare l'intero corpo, che dovrebbe essere chiaramente visibile nella fotocamera.
7. Accendere i proiettori.
8. Avviare la registrazione dei dati.

Figura 3: Configurazione per eseguire l'imaging del calcio, la registrazione del comportamento e la visualizzazione dello stimolo visivo. (A) Tre proiettori presentano uno stimolo visivo sulle pareti della vasca semiesagonale. Le luci IR laterali vengono utilizzate per illuminare il corpo del pesce zebra. (B) Posizionamento della lente dell'obiettivo. A sinistra: vista frontale. A destra: vista laterale. La distanza tra l'obiettivo 16x e la regione cerebrale bersaglio è di circa 2,5 mm. (C) Esempio di immagine a due fotoni. A sinistra: massima proiezione dell'intero prosencefalo dorsale in Tg[neuroD:GCaMP6f]. A destra: immagine ingrandita per rivelare i neuroni in più regioni del cervello. Riquadro: un ingrandimento maggiore da una diversa regione del cervello. Le immagini sono medie di 10 s di dati registrati a 5Hz. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il protocollo si compone di due parti: l'intervento chirurgico del poggiatesta e l'imaging a due fotoni delle attività neuronali nel prosencefalo. Il successo dell'intervento chirurgico è definito dalla sopravvivenza dell'animale e dalla stabilità del poggiatesta. Il tasso di sopravvivenza può essere notevolmente migliorato dalla frequente perfusione della soluzione TMS allo 0,01% attraverso la bocca durante l'intervento chirurgico. I pesci dovrebbero riprendersi dall'anestesia e respirare attivamente entro 1-2 minuti dopo essere stati immersi nell'acqua dell'acquario. L'imaging del calcio a due fotoni consente la registrazione dell'attività dei singoli neuroni nel prosencefalo dorsale a una profondità fino a 200 μm dalla superficie cerebrale attraverso crani intatti (~40 μm di spessore). Questo intervallo di imaging copre più zone del telencefalo dorsale (D), tra cui la zona mediale (Dm), la parte rostrale della zona centrale (rDc), la parte caudale della zona centrale (cDc) e la zona laterale (Dl). Insieme costituiscono il 30% del telencefalo nel pesce zebra adulto (Fig. 3C). Con l'imaging volumetrico che utilizza l'attuatore piezoelettrico, in genere registriamo l'attività di 150 neuroni in Dl o cDc e 300 neuroni in Dm e rDc in Tg[neuroD:GCaMP6f]10. La registrazione comportamentale simultanea viene eseguita durante l'imaging cerebrale, che consente l'identificazione dei correlati neuronali degli output motori (Figura 4).

Durante l'imaging a due fotoni, i movimenti della coda non dovrebbero indurre un artefatto di movimento visibile nell'immagine. Un movimento piccolo (<1 μm) e transitorio può essere osservato durante le difficoltà estreme. Questi movimenti sono in genere reversibili, quindi l'imaging può essere continuato in seguito. Osserviamo anche una lenta deriva (<1 μm min-1) nelle direzioni laterale e assiale9. Per prevenire la perdita di neuroni dovuta alla deriva assiale del campione, in genere limitiamo la nostra sessione di imaging a 10 minuti. Il fotosbiancamento dell'indicatore di calcio non deve essere osservato dopo una sessione di imaging di 10 minuti con la potenza laser specificata.

Figura 4: Tracciamento del comportamento e modello di attività neurale nel pesce zebra adulto. (A) Un fotogramma di esempio di registrazione del comportamento da parte della telecamera (vista ventrale). (B) Attività dei neuroni del prosencefalo (ΔF/F, nero) e intensità del movimento della coda (blu). L'intensità del movimento della coda è stata quantificata dalla media della differenza assoluta in termini di pixel tra fotogrammi video successivi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Disegno della piastra di base. Fare clic qui per scaricare il file.

Fascicolo supplementare 2: Disegno della piastra circolare. Fare clic qui per scaricare il file.

Fascicolo supplementare 3: Progettazione del serbatoio semiesagonale. Fare clic qui per scaricare il file.

File supplementare 4: Progettazione della barra di testa. Fare clic qui per scaricare il file.

Tabella supplementare 1: Dettagli sulla risoluzione dei problemi. Fare clic qui per scaricare il file.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.