Qui, descriviamo un metodo per alterare selettivamente le espressioni geniche nel plesso coroideo evitando qualsiasi impatto in altre aree cerebrali.
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Articolo metodologico
Knockdown mirato dei geni nel plesso coroideo
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il plesso coroideo (ChP) funge da porta d'accesso critica per l'infiltrazione delle cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale (SNC) sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Recenti ricerche hanno dimostrato che la regolazione dell'attività di ChP può offrire protezione contro i disturbi del SNC. Tuttavia, studiare la funzione biologica del ChP senza influenzare altre regioni del cervello è impegnativo a causa della sua delicata struttura. Questo studio presenta un nuovo metodo per il knockdown genico nel tessuto ChP utilizzando virus adeno-associati (AAV) o proteina ricombinasi dell'enzima di ricombinazione della ciclizzazione (Cre) costituita dalla sequenza TAT (CRE-TAT). I risultati dimostrano che dopo l'iniezione di AAV o CRE-TAT nel ventricolo laterale, la fluorescenza è stata concentrata esclusivamente nel ChP. Utilizzando questo approccio, lo studio ha abbattuto con successo il recettore dell'adenosina A2A (A 2AR) nel ChP utilizzando l'interferenza dell'RNA (RNAi) o Cre/locus dei sistemi X-overP1 (Cre/LoxP) e ha dimostrato che questo knockdown potrebbe alleviare la patologia dell'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Questa tecnica può avere importanti implicazioni per la ricerca futura sul ruolo della ChP nei disturbi del SNC.
Introduzione
Si è spesso pensato che il plesso coroideo (ChP) aiutasse a mantenere l'omeostasi funzionale del cervello secernendo liquido cerebrospinale (CSF) e fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)1,2. L'aumento della ricerca negli ultimi tre decenni ha rivelato che il ChP rappresenta un percorso distinto per l'infiltrazione delle cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale (SNC).
Le giunzioni strette (TJ) del ChP, composte da un epitelio ChP monostrato, mantengono l'omeostasi immunologica impedendo alle macromolecole e alle cellule immunitarie di entrare nel cervello
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Protocollo
Tutte le procedure sugli animali descritte in questo studio sono state condotte in conformità con le linee guida delineate nella Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università di Medicina di Wenzhou.
1. Animali
- Acquista topi maschi C57BL/6 di età compresa tra 8 e 12 settimane e del peso di 20-22 g.
- Ottenere la linea murina transgenica Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) e topi maschi A2ARflox/flox .
- Assegnare in modo casuale i topi a due gruppi e alloggiarli in gabbi....
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Risultati
Knockdown di A2AR specifico per ChP mediante iniezione ICV di AAV2/5-shRNA o CRE-TAT
Il ruolo di A2AR nel ChP come potente regolatore dell'informazione neurale nella patogenesi dell'EAE rimane poco chiaro. Abbattere l'espressione di A 2ARspecifica per ChP potrebbe far luce sugli effetti regolatori di A2AR sul sistema immunitario centrale nell'EAE e in altre infiammazioni del sistema nervoso. Questo studio ha utilizzato l'iniezione ICV di CRE-TAT per ridurre .......
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Discussione
La ricerca ha presentato due approcci distinti per il knockdown mirato dei geni ChP. Il primo approccio prevedeva l'iniezione ICV di CRE-TAT, che contiene Cre ricombinasi, in topi flox A2AR/flox. Il secondo approccio ha comportato l'iniezione ICV di AAV2/5 trasportatore di shRNA di A2AR. Utilizzando queste due strategie, il lavoro ha ottenuto il knockdown selettivo di A 2A R all'interno del ChP ed è stato in grado di dimostrare gli effetti protettivi dell'inibizione della segnalazione di .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o altre divulgazioni da dichiarare.
Ringraziamenti
Riconosciamo con gratitudine il sostegno della National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31800903, assegnato a W. Zheng) e del Wenzhou Science and Technology Project (n. Y2020426, assegnato a Y. Y. Weng) per questo lavoro.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Topi A2ARflox/flox | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| mezzo di montaggio antisbiadimento | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| capillare in vetro borosilicato | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
| apparato stereotassico cerebrale | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 topi | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT ricombinasi | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| affettatrice congelata | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson e compagnia | 231141 | |
| Hamilton siringa | Hamilton, americana | P/N: 86259 | |
| Coadiuvante di Freunds incompleto | Sigma | F5506 | |
| Microscopio confocale laser | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| Colla OCT | Epredia | 6502p | |
| paraformaldeide | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodico | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pistola per pipette | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
| Sistema di PCR in tempo reale | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato topi | Jackson Laboratory | ||
| saccarosio | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| omogeneizzatore ad altissima velocità | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| soluzione | di xileneChengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
Riferimenti
- Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.....
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Ristampe e permessi
