Articolo metodologico

Screening analogico del fentanil mediante LC-TIMS-TOF MS/MS

DOI:

10.3791/65562

⸱

8 novembre 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Miami-Dade County Medical Examiner Department, 4Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

In questo articolo

Sommario

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Un metodo per lo screening degli analoghi del fentanil in base al loro tempo di ritenzione, mobilità e modello di frammentazione della spettrometria di massa.

Abstract

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L'uso del fentanil e l'emergere di analoghi del fentanil negli ultimi decenni è diventato una preoccupazione crescente per la comunità in generale. Il fentanil e i suoi analoghi sono i principali responsabili delle overdose fatali e non fatali negli Stati Uniti. I casi più recenti di overdose correlata al fentanil sono collegati al fentanil prodotto illecitamente e alla sua estrema potenza associata. Nel presente lavoro, descriviamo un protocollo analitico ad alto rendimento per lo screening di analoghi del fentanil. L'uso della cromatografia liquida complementare, della spettrometria di mobilità ionica intrappolata e della spettrometria di massa tandem consente la separazione e l'assegnazione di centinaia di analoghi del fentanil da un singolo campione in un'unica scansione. L'approccio descritto sfrutta il recente sviluppo dell'acquisizione dipendente dai dati e dell'acquisizione indipendente dai dati utilizzando l'accumulo parallelo nella trappola della mobilità seguita dalla frammentazione sequenziale utilizzando la dissociazione indotta dalla collisione. Gli analoghi del fentanil vengono assegnati con sicurezza in base al tempo di ritenzione, alla mobilità e al modello di frammentazione della SM.

Introduzione

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Il fentanil e i suoi analoghi sono i principali responsabili delle overdose fatali e non fatali negli Stati Uniti 1,2. Il Center for Disease Control and Prevention (CDC) ha riferito che il numero di decessi per overdose correlati agli oppioidi sintetici dal 2013 al 2021 è stato di oltre 258.000. Solo nel 2021, oltre 68.000 decessi per overdose potrebbero essere attribuiti agli oppioidi sintetici, per un totale dell'82% di tutti i decessi correlati all'overdose nella nazione3. Dal 2013 sono stati identificati centinaia di analoghi del fentanil, con potenza variabile4. Con l'emergere di analoghi del fentanil prodotti illecitamente, l'oppioide sintetico della tabella II rimane l'oppioide sintetico più popolare disponibile negli Stati Uniti3. Secondo il Center for Forensic Science Research and Education (CFSRE), l'analogo del fentanil più segnalato nel 2022 è stato il fluorofentanil, con ulteriori oppioidi sintetici non correlati al fentanil che vengono ora introdotti a un ritmo rapido nell'offerta volatile del mercato dei farmaci5.

A causa dell'enorme volume di fentanil e analoghi correlati al fentanil che circolano nel mercato della droga, la DEA ha implementato un programma di profilazione della firma del fentanil intitolato Operation Death Dragon, al fine di tracciare la metodologia utilizzata per sintetizzare questi composti con la speranza di collegare i sequestri di droga alla loro origine6. Nel 2018, il 94% dei sequestri di droga è stato identificato come sintetizzato con il metodo Janssen, mentre il restante 6% è stato sintetizzato con il metodo Siegfried6. La differenza principale tra i due metodi è la presenza dell'analogo del fentanil, il benzil fentanil, rilevato come impurità nel metodo Janssen, mentre la presenza di despropionil fentanil (4-ANPP), un metabolita/precursore del fentanil, è un'impurità rilevata durante la sintesi con il metodo Siegfried7.

L'uso della gascromatografia e della cromatografia liquida in tandem con la spettrometria di massa (GC-MS e LC-MS, rispettivamente) per lo screening mirato e la quantificazione degli oppioidi sintetici viene regolarmente implementato nei laboratori di tossicologia. La GC-MS è stata considerata il gold standard per la rilevazione di droghe d'abuso in campioni biologici. L'accesso alle librerie spettrali di massa disponibili al pubblico8 e alla strumentazione commercializzata come sistemi plug and play9 sono alcuni dei motivi per cui la GC-MS è rimasta parte integrante dei laboratori sia per lo screening completo che per la quantificazione mirata 9,10. Tuttavia, gli attuali metodi di quantificazione GC-MS in letteratura tendono ad avere un ambito limitato di analiti11 e diventano rapidamente obsoleti e non applicabili ai casi attuali. Ancora più importante, i limiti di rilevamento e quantificazione non sono paragonabili ai metodi LC-MS (< 1 ng/mL)12, aumentando così il potenziale di risultati falsi negativi. Uno di questi confronti tra GC-MS e LC-MS, che ha esaminato campioni post mortem, ha rilevato che su 134 casi identificati positivamente di carfentanil, uno dei più potenti oppioidi sintetici fino ad oggi, 104 di questi casi sono risultati negativi allo screening per il carfentanil utilizzando GC-MS13. Nei laboratori di analisi dei farmaci, la GC-MS è più frequentemente utilizzata e modificabile per gli oppioidi sintetici a causa dell'elevata concentrazione dei campioni analizzati. Tuttavia, la GC-MS è ancora utilizzata in combinazione con tecniche aggiuntive come la spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier (FT-IR) e la microscopia elettronica a scansione (SEM) per la conferma di questi composti14. L'applicazione della GC-MS all'analisi di campioni biologici in tossicologia forense richiede metodi di preparazione dei campioni che includono l'estrazione di questi composti mediante estrazione liquido-liquido (LLE) o estrazione in fase solida (SPE)15. La LLE può essere condotta con una varietà di solventi, tuttavia in un laboratorio ad alta produzione, la LLE potrebbe non essere efficiente in termini di costi o tempestiva. LLE consuma grandi quantità di solventi e volume di campione, mentre l'alternativa, SPE, può essere automatizzata e richiede un volume minimo di campione16. Un recente studio GC-MS ha riportato la separazione di 20 diversi analoghi isomerici del fentanil utilizzando tre programmi termici GC separati17. Sebbene la separazione di base tra gli isomeri abbia avuto successo, l'applicabilità di questo metodo ai casi e ai flussi di lavoro forensi pertinenti è limitata.

La LC-MS ha guadagnato popolarità nei test forensi, soprattutto a causa delle limitazioni della GC-MS quando si tratta di composti non volatili e sensibili al calore18,19. Lo screening LC-MS che utilizza tripli quadrupoli (QQQ) e la strumentazione a trappola ionica hanno avuto successo nel rilevare oppioidi sintetici a basse concentrazioni (<1 ng/mL)12,20,21,22,23,24. Tipicamente, questi metodi LC-MS vengono utilizzati come metodi di conferma secondari per integrare i risultati del test immunologico e/o della GC-MS. Nel 2017, Shoff et al. presso il laboratorio di tossicologia del dipartimento di medicina legale della contea di Miami-Dade (MDME) hanno sviluppato un metodo di screening completo per 44 composti correlati agli oppioidi utilizzando la cromatografia liquida ad altissima pressione (UHPLC)-ion trap-MSn 13. Analogamente ai metodi MRM mirati, questo metodo di trappola ionica utilizzava un elenco di precursori programmati (SPL) contenente i tempi di ritenzione, gli ioni bersaglio dei precursori e gli ioni figli primari per la frammentazione spettrale MS3, quando possibile. Ciò che separa questo metodo di screening dai metodi sviluppati su tripli quadrupoli e trappole ioniche lineari a quadrupolo è il dettaglio aggiuntivo fornito nei dati spettrali. Ciò che questo metodo di screening non può fornire è l'analisi quantitativa, che raramente viene sviluppata sulla strumentazione a trappola ionica, così come l'identificazione di incognite13. I metodi LC-QQQ per gli oppioidi sintetici possono contemporaneamente selezionare e quantificare un elenco di obiettivi predefinito. L'uso di transizioni di monitoraggio a reazione multipla (MRM) per l'identificazione e la quantificazione dei composti è una tecnica di acquisizione dati affidabile ed è la tecnica più comune utilizzata in letteratura per la rilevazione di oppioidi sintetici12,20. Gli intervalli lineari riportati per la quantificazione di una serie di oppioidi sintetici vanno da 0,01 a 100 ng/mL, con oppioidi sintetici più potenti, come il carfentanil, rilevati nell'intervallo sub-ng/mL1 1,24,25,26,27.

La separazione degli oppioidi sintetici isomerici è stata affrontata nei metodi LC-MS. Uno di questi metodi ha separato 174 analoghi isomerici del fentanil in un tempo di esecuzione di 16 minuti utilizzando una colonna di bifenile28. Inoltre, le fluttuazioni dei parametri LC-dipendenti come l'efficienza della colonna, il pH della fase mobile e le variazioni di pressione creano spostamenti del tempo di ritenzione che devono essere presi in considerazione in saggi mirati con monitoraggio coerente e finestre di raccolta più ampie (>0,4 min), che possono comportare una potenziale sovrapposizione di questi isomeri una volta risolti. Sono state esplorate ulteriori tecniche cromatografiche per la separazione degli isomeri, tra cui l'uso della cromatografia liquida bidimensionale (2D-LC)29; E sebbene questa tecnica abbia la capacità di fornire una separazione ortogonale dei composti, gli svantaggi superano i vantaggi, tra cui tempi di esecuzione eccessivi, costi, difficoltà nello sviluppo del metodo e utilità rispetto alle separazioni alternative30.

La spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) sta diventando sempre più affidabile per l'identificazione di oppioidi sintetici. Diverse aziende produttrici di strumentazione hanno commercializzato metodi mirati sviluppati allo scopo di identificare un'ampia gamma di oppioidi sintetici in matrici biologiche complesse 19,28,31. Questi metodi, a differenza dei metodi discussi in precedenza, possono memorizzare dati analitici per l'analisi retroattiva. Pertanto, i campioni che sono stati precedentemente analizzati con risultati indeterminati possono essere rivisitati in seguito per la scoperta di composti appena identificati. Ciò che separa HRMS da QQQ è l'accurata identificazione della massa. Sebbene entrambe le tecniche MS possano quantificare con precisione a basse concentrazioni, la HRMS si è dimostrata più efficace per lo screening iniziale e la scoperta di composti sconosciuti 32,33,34. HRMS, in particolare con gli analizzatori MS a tempo di volo (TOF), è stato in prima linea nella scoperta di NPS, consentendo ai laboratori di analisi forensi di fornire dati sensibili al tempo su nuovi composti sia alle forze dell'ordine che alla comunità scientifica per scalare la diffusione di alcuni di questi composti, aumentando al contempo la consapevolezza e l'educazione33. L'uso del TOF per la rilevazione di droghe d'abuso è diventato estremamente completo, con metodi contenenti oltre 600 composti separati in un programma cromatografico di 10 minuti. Studi precedenti hanno riportato i vantaggi della spettroscopia di mobilità ionica intrappolata (TIMS) accoppiata a TOF per la rilevazione e la separazione di oppioidi isomerici35.

Sfruttando l'ortogonalità tra cromatografia liquida, spettrometria di mobilità ionica intrappolata e spettrometria di massa, il metodo presentato fornisce un'ampia caratterizzazione degli analoghi del fentanil in base al tempo di ritenzione, al modello isotopico, alla mobilità e al modello di frammentazione.

Protocollo

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1. Preparazione del campione

  1. Conservare il kit di screening analogico del fentanil a -20 °C una volta ricevuto. Risospendere ciascun campione a una concentrazione finale di 400 μg/mL mediante l'aggiunta di 500 μL di metanolo puro di grado LC/MS.
  2. Impastare con un miscelatore a piastre o un vortex a 400 giri/min per 1 ora o a vortice a velocità media per 15 minuti. Dopo la risospensione, conservare i flaconcini a -20 °C.
  3. Diluire ogni standard a una concentrazione finale di 1 ng/mL utilizzando metanolo puro di grado LC/MS.
  4. Raggruppare gli standard in gruppi, in modo che ogni gruppo non contenga standard isomerici. Si veda la Tabella supplementare 1 per la ripartizione dei 14 gruppi di standard sul fentanil.

2. Preparazione delle fasi mobili HPLC

  1. Preparare la fase mobile A (MPA) utilizzando 5 mM/L di formiato di ammonio (NH4HCO2) in H2O con acido formico allo 0,05% (85%).
    1. Pesare 0,078 g di NH4HCO2, versare in un matraccio tarato da 250 ml e riempire d'acqua fino a circa 2/3di ora. Agitare per amalgamare bene.
    2. Una volta completamente sciolto, aggiungere 0,125 ml di acido formico (85%). Riempire con acqua fino alla linea di riempimento (250 mL) e mescolare.
  2. Preparare la fase B mobile (MPB) utilizzando acido formico allo 0,05% in una miscela di metanolo acetonitrile 1:1.
    1. Versare 125 mL di acetonitrile in un matraccio tarato e aggiungere metanolo fino a raggiungere la linea di riempimento.
    2. Agitare per amalgamare bene. Aggiungere 0,125 mL di acido formico allo 0,05% al pallone e mescolare per omogeneizzare.

3. Sviluppo del metodo HPLC

  1. Aprire il software LC nella schermata iniziale. Nella tabella di esempio, situata al centro della finestra, creare un nuovo protocollo.
    1. Annotare la colonna della fiala con la posizione del campione. Annotare la colonna ID campione utilizzando il formato YYYYMMDD_NAME (descrittore rappresentativo). Annotare la colonna del volume con il volume di iniezione desiderato (15 μL).
  2. Annotare la colonna del percorso dei dati con la posizione in cui verranno salvati i dati.
  3. Input del metodo HPLC
    1. Selezionare Nuovo dalla barra nella tabella di esempio situata al centro dello schermo. Sotto il metodo di separazione, seleziona la freccia a discesa e fai clic su Nuovo metodo nella finestra pop-up.
    2. Apparirà una nuova finestra con l'etichetta metodo di separazione, qui modificare il tempo di acquisizione o il metodo del sistema ICF (Instrument Control Framework).
    3. Fare doppio clic sul pulsante Modifica metodo per il sistema ICF per aprire il popup per modificare il gradiente binario, come mostrato nella Figura 1.
    4. Nella scheda del gradiente binario, una rappresentazione visiva del gradiente si trova a sinistra e la suddivisione del gradiente è a destra, impostare i timestamp, la portata e le concentrazioni di MPA e MPB.
    5. Assicurarsi che il tempo di arresto sia impostato su 18 min, la portata a 0.400 mL/min e il limite di pressione min e max a 0 psi e 6000 psi.
    6. Impostare le concentrazioni del timestamp come segue:
      A 0,00 min, impostare la concentrazione B su 20,0.
      A 1,50 min, impostare la concentrazione B su 25,0.
      A 3.00 min, impostare la concentrazione B a 27.0.
      Alle 6.00 min, impostare la concentrazione B su 27.0.
      A 6.50 min, impostare la concentrazione B a 30.0.
      Alle 7.00 min, impostare la concentrazione B a 95.0.
      Alle 16:00 min, impostare la concentrazione B a 95,0.
      Alle 16.50 min, impostare la concentrazione B a 20.0.

4. Inizializzazione dell'HPLC

  1. Nella sezione della colonna HPLC, inserire la colonna LC (colonna HPLC monolitica C18 100 mm x 4,6 mm) e le protezioni della colonna (colonna di protezione 5 mm x 4,6 mm). Prestare attenzione alla pressione minima e massima della colonna.
  2. Eseguire un campione vuoto (stessa soluzione tampone) per verificare la presenza di eventuali perdite e creare una linea di base. Cerca perdite. Le perdite potevano essere osservate dalle fluttuazioni di pressione della colonna. Se ci sono perdite, determinare da dove potrebbero provenire e stringere i collegamenti.
  3. Eseguire un campione bianco (stessa soluzione tampone) utilizzando il programma LC desiderato per precondizionare la colonna.

5. Sviluppo del metodo TIMSTOF MS/MS

  1. Aprire l'applicazione timsControl. Sul lato sinistro della finestra ci sono le impostazioni MS e TIMS.
    1. In Impostazioni MS, impostare l'inizio e la fine della scansione rispettivamente su 50 m/z e 1800 m/z. Selezionare la modalità positiva per la polarità ionica e selezionare l'accumulo parallelo-frammentazione seriale per la modalità di scansione.
    2. In Impostazioni TIMS impostare la modalità su personalizzata, l'inizio 1/K0 su 0.40 Vs/cm2, l'estremità 1/K0 su 1.85 Vs/cm2, il tempo di rampa impostato su 150.0 ms e la media MS impostata su 1.
  2. Nella selezione inferiore delle schede, in Sorgente, eseguire le seguenti modifiche nelle due caselle di impostazione.
    1. Nella sorgente, impostare l'offset della piastra terminale a 500 V, il capillare a 4500 V, il nebulizzatore a 3,0 bar, il gas secco a 10,0 L/min e la temperatura secca a 200 °C.
    2. Nelle impostazioni della pompa a siringa, assicurarsi che la siringa sia Hamilton da 1 mL, che sia attiva e che la portata sia impostata su 80,0 μL/h.
  3. Nella scheda Sintonizzazione, eseguire le seguenti modifiche nelle schede delle impostazioni per Generale, Elaborazione e TIMS.
    1. Nella scheda delle impostazioni generali, impostare le seguenti sezioni: trasferimento, cella di collisione, quadrupolo, messa a fuoco pre TOF e rilevamento.
      1. Nelle impostazioni di trasferimento, impostare la deflessione 1 delta a 70,0 V, l'imbuto 1 RF a 341,0 Vpp, l'energia CID a 0,0 eV, l'imbuto 2 RF a 300,0 Vpp, RF multipolare a 300,0 Vpp.
      2. Nelle impostazioni della cella di collisione, assicurarsi che l'energia di collisione sia impostata su 6,0 eV e la RF di collisione su 1200,0 Vpp.
      3. Con le impostazioni del quadrupolo, assicurarsi che l'energia ionica sia impostata su 6,0 eV e che la massa ridotta sia impostata su 250,00 m/z.
      4. Con le impostazioni pre TOF di messa a fuoco, impostare il tempo di trasferimento su 75,0 μs e la memorizzazione pre-impulso su 5,0 μs.
    2. Nella scheda delle impostazioni di elaborazione, impostare le seguenti sezioni: rilevamento dei picchi degli spettri di massa e rilevamento dei picchi di mobilità.
      1. Nelle impostazioni del picco degli spettri di massa, deselezionare la somma delle intensità (area) e impostare la soglia assoluta su 667.
    3. Nella scheda TIMS, impostare le seguenti sezioni: offset, controllo del cambiamento ionico e parametri avanzati.
      1. Con l'impostazione degli offset, impostare Δt1 su -20,0 V, Δt2 su -100,0 V, Δt3 su 40,0 V, Δt4 su 80,0 V, Δt5 su 0,0 V, Δt6 su 120,0 e la cella di collisione su 250,0 V.
      2. Nelle impostazioni di controllo della carica ionica, fare clic sulla casella per abilitare e impostare l'intensità target su 5,00 M.
      3. Nei parametri avanzati, abilitare l'accumulo di blocco al raggio di mobilità.
  4. Nella scheda MS/MS impostare la modalità di scansione su accumulazione parallela-frammentazione seriale e impostare le seguenti sezioni: ioni precursori, programmazione, esclusione attiva, impostazioni dell'energia di collisione, impostazioni della larghezza di isolamento e passo TIMS.
    1. Sotto gli ioni precursori, impostare il numero di rampe parallele di accumulazione-frammentazione seriale a 8, la carica minima a 1 e la carica massima a 5.
    2. Nelle impostazioni di pianificazione, abilitare le ripetizioni precursori. In Esclusione attiva, seleziona la casella per abilitare e imposta la versione su 0.40 min dopo.
    3. Non regolare le impostazioni dell'energia di collisione e le impostazioni della larghezza di isolamento. Fare clic sulla casella di passaggio TIMS per abilitare.

6. Mobilità e calibrazione della massa

  1. Eseguire la calibrazione sia per i domini m/z che per quelli di mobilità. Nelle impostazioni di calibrazione m/z, selezionare uno dei profili di mix di sintonizzazione precaricati nella casella di riepilogo dei riferimenti che appare nel menu a discesa.
  2. Per calibrare, caricare la siringa per il TOF con una soluzione di miscela di accordatura. Sul lato destro della finestra, utilizzare le impostazioni denominate modalità di calibrazione per i vari tipi di calibrazione da impostare per ottenere il punteggio più alto.
  3. Assicurati che il punteggio sia il più vicino possibile al 100%. Passa da lineare, quadradico e quadratico avanzato per ottenere il miglior punteggio.
  4. Calibrare per la mobilità seguendo i passaggi 6.1-6.3 utilizzati per la calibrazione di m/z.
  5. Una volta calibrato, salva il metodo MS selezionando la scheda Metodo nella barra in alto. Nel menu a discesa, seleziona Salva con nome per generare un nuovo file del metodo MS.

7. Creazione del metodo di frammentazione seriale ad accumulazione parallela di acquisizione indipendente dai dati (dia)

  1. Una volta che un set di dati è stato raccolto in acquisizione dipendente dai dati (dda) parallela accumulazione-frammentazione seriale, eseguire gli esperimenti in dia. Aprire l'applicazione software per la mobilità ionica e caricare il metodo dda salvato nel passaggio 6.5.
  2. Lasciare tutte le impostazioni invariate ad eccezione dell'impostazione MS, modificare questa impostazione da accumulazione parallela-frammentazione seriale a dia- accumulazione parallela-frammentazione seriale.
  3. Nella parte inferiore del pannello, selezionare la scheda MSMS e quindi fare clic su Window Editor per aprire il popup della finestra dia mostrato nella Figura 2.
  4. Caricare il set di dati dda salvato in precedenza (file .m) utilizzando il pulsante Apri analisi situato nella parte superiore della finestra popup.
  5. In basso a sinistra viene visualizzata una mappa di calore che mostra le finestre con un poligono di finestre che corrono diagonalmente attraverso il grafico. Fare clic e trascinare per ridimensionare il poligono in modo che si adatti ai dati nella mappa di calore (gli angoli sono selezionabili facendo doppio clic sulle linee laterali, apparirà un punto che può essere trascinato e ridimensionato).
  6. A destra delle finestre ci sono le impostazioni della finestra. Impostare la larghezza della massa (50 è andare a) e impostare la sovrapposizione orizzontale, entrambi in Da.
  7. Impostare il numero di finestre di mobilità per larghezza di massa e la sovrapposizione verticale.
  8. Fai clic su Calcola finestre in basso a destra nel popup per vedere le finestre visualizzate con le nuove impostazioni. Una volta adatto, fare clic su Applica finestre dia-PASEF al metodo. Questo chiuderà il popup riportandolo alla schermata principale.

8. Elaborazione dei dati TOF con mobilità ionica HPLC

  1. Aprire il software di analisi dei dati. Nell'angolo in alto a sinistra, fai clic sulla scheda File e seleziona Apri dal menu a discesa. Nella finestra dei nuovi file, selezionare i file desiderati e fare clic su Apri.
  2. Controllare la calibrazione. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul nome del file sotto la casella di analisi e selezionare Proprietà. Apparirà una finestra con l'etichetta file name_analysis proprietà. Selezionare Stato calibrazione.
  3. Dalla casella a discesa, selezionare Calibrazione dello strumento per lo spettrometro di massa. Verificare che l'errore non sia superiore a 1 μg/mL. Selezionare Calibrazione iniziale della mobilità e verificare che l'errore non sia superiore a 1 μg/mL.
  4. Preparare un cromatogramma nel software di analisi dei dati come descritto di seguito.
    1. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Cromatogramma sotto il nome del file, selezionare Modifica cromatogramma. In Tipo, fare clic sulla casella a discesa e selezionare Cromatogramma ionico estratto.
    2. In filtro, selezionare Tutti i MS e con la modalità di scansione selezionare Tutti. Questo serve a visualizzare i picchi della molecola di interesse piuttosto che solo i suoi frammenti.
    3. Al di sotto, cerca le due opzioni di filtro per la selezione delle molecole: masse o formula evidenziate in blu.
    4. Se si utilizzano masse per estrarre uno ione, inserire il m/z teorico della molecola di interesse. In questo caso, selezionare (massa per un risultato rappresentativo) m/z.
    5. Se si utilizza la formula per estrarre uno ione, inserire la formula per la molecola e le forme ioniche di interesse per il cromatogramma. In questo caso, selezionare lo ione protonato, [M+H]+.
    6. Impostare la polarità in modalità positiva.
  5. Spettro di massa
    1. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla linea di base del picco del composto e trascinare fino all'altro bordo del picco. Questo creerà uno spettro di massa di frammenti entro quel tempo di ritenzione.
  6. Generazione di Mobilogram
    1. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla scheda di sinistra intitolata Mobilogram e selezionare Modifica Mobilogram. Apparirà una finestra intitolata modifica tracce del mobilogramma. Seguire i passaggi 8.4.2-8.4.7 per modificare il cromatogramma.
    2. Nell'input del tempo di conservazione, aggiungere l'intervallo di tempo di conservazione del picco di interesse.
    3. Una volta selezionati i parametri, fare clic su Aggiungi seguito da Ok in alto a destra nella finestra di modifica delle tracce del mobilogramma.
    4. Dopo un breve periodo di tempo, il software elaborerà le selezioni desiderate e produrrà un cromatogramma. Ripetere i passaggi 8.6.1-8.6.3 per tutti gli ioni nella miscela.
    5. Generazione degli spettri composti
      1. Nella parte inferiore della finestra della vista dello spettro, selezionare Profilo MS e Frammento MS. Ciò consentirà di includere gli ioni provenienti dalla scansione completa e dal PASEF.
      2. Nella vista spettro, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Copia spettri composti. Con i dati dello spettro che appaiono a destra, trova ulteriori informazioni sul composto come la risoluzione della risoluzione, la potenza, l'intensità e il rapporto segnale/rumore (S/N).
    6. Elaborazione dati
      1. Per elaborare i dati, è necessario integrare manualmente il cromatogramma e i picchi di mobilità per ottenere informazioni importanti sulla molecola di interesse.
      2. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Trova e selezionare Integra solo cromatogramma o mobilogramma. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinare per evidenziare il picco desiderato. Verranno visualizzate le informazioni che includono il tempo di conservazione, l'area, il numero di serie e la mobilità.

Risultati

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Il kit di screening analogico del fentanyl di 250 standard analogici è stato diviso in 14 gruppi: 12 gruppi di 17 analoghi e 2 gruppi di 16 analoghi, per evitare interferenze m/z. Ogni analogo è ulteriormente caratterizzato dal loro m/z, tempo di ritenzione (RT), mobilità (K) e modello di frammentazione MS/MS.

Esempi di separazioni isomeriche sono mostrati nella Figura 3 e nella Figura 4 per la formula chimica C22H28N2O2 e C21H28N2OS rispettivamente.

Il kit di screening analogico del fentanil contiene quattro isomeri con la formula chimica C22H28N2O2 (vedi Figura 3). L'ispezione della Figura 4 mostra il cromatogramma ionico estratto [M+H]+ , i mobilogrammi, il pattern isotopico e il pattern di frammentazione MS/MS. Il metossiacetil fentanil e il fentanil carbammato si separano bene nei domini LC e mobilità dal para-metossi acetil fentanil e dal B-idrossilfentanil. Tuttavia, una chiara separazione tra il para-metossi acetil fentanil e il B-idrossilfentanil è ottenuta dai loro modelli di frammentazione.

Il kit di screening analogico del fentanil contiene tre isomeri con la formula chimica C21H28N2OS. L'ispezione della Figura 4 mostra il cromatogramma ionico estratto [M+H]+ , i mobilogrammi, il pattern isotopico e il pattern di frammentazione MS/MS. L'a-metiltiofentanil e il (±)-trans-3-metiltiofentanil si separano nel dominio LC ma non nel dominio della mobilità. Inoltre, il (±)-trans-3-metil tiofentanile e il (±)-cis-3-metiltiofentanil si separano nel dominio della mobilità e non nel dominio LC. Ciò dimostra la complementarità della LC e la separazione della mobilità, migliorando l'identificazione delle specie isomeriche attraverso l'ortogonalità dei domini. La Figura 4D riassume questo risultato fornito dalla LC e dalla mobilità.

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Figura 1: Rampa di pendenza nel software. Gradiente di dialogo del metodo del sistema ICF: punti temporali applicati durante la separazione in base alla percentuale di concentrazione di B. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: impostazioni della finestra dia-PASEF. Con i metodi dia-PASEF MS le impostazioni MS/MS sono univoche. Il grafico a sinistra mostra i poligoni della finestra regolati dai dati registrati nel metodo dda-PASEF. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Cromatogramma ionico estratto tipico, mobilogramma estratto e proiezione MS amplificata per oppioidi isomeri. (A) Strutture di metossiacetil fentanil, para-metossi acetil fentanil, β-idrossi fentanil, fentanil carbammato e i rispettivi (B) tempo di ritenzione tipico, (C) mobilità tipica, (D) segnale isomerico, (E) frammenti principali e (F) rappresentazione della frammentazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Cromatogrammi ionici estratti tipici e mobilogrammi estratti per oppioidi isomeri. (A) Strutture di α-metiltiofentanyl, (±)-trans-3-metil tiofentanil e (±)-cis-3-metil tiofentanyl. Per i rispettivi isomeri (B) tempo di ritenzione tipico, (C) mobilità tipica, (D) ortogonalità tra il tempo di ritenzione e la mobilità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1: Gruppi di miscelazione. Questa tabella delinea quali oppioidi sono presenti in ciascuna delle 14 miscele create per questa procedura. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

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La separazione analitica di campioni biologici ad alto contenuto isomerico può essere difficile dal punto di vista analitico. In questo articolo, il metodo descritto mira a caratterizzare 29 set di isomeri, per un totale di 185 analoghi da un kit standard di 250 oppioidi. Durante la preparazione del gruppo di test, è importante assicurarsi che non ci siano due analoghi con m/z che non possano essere distinti sperimentalmente. I dati qui descritti utilizzano standard non provenienti da una matrice umana, se questo metodo deve essere utilizzato in un esperimento sul campo; Sono necessari ulteriori studi che utilizzano la matrice di interesse per garantire l'applicabilità del metodo. La matrice potrebbe causare la ionizzazione degli analiti in modo diverso rispetto a un esperimento senza matrice, rendendo imperativo determinare quali forme ioniche prevalenti verranno osservate. Nell'analisi, l'identificazione si basa sui pattern isotopici delle forme più abbondanti (ad esempio, [M+H]+1 e [M+Na]+1).

La scelta del programma LC è fondamentale nei casi in cui gli isomeri non sono separati nel dominio della mobilità. La diminuzione della pendenza del gradiente può aumentare la specificità del metodo aumentando la differenza tra i picchi cromatografici.

Durante l'analisi dei dati è importante che i segnali non rilevanti vengano ignorati quando si determina il tempo di conservazione e la mobilità. I vantaggi di HRMS consentono finestre m/z strette (risoluzione di massa tipica di ~50.000) con un ulteriore filtraggio della mobilità, riducendo così il rumore chimico.

Il metodo qui descritto fornisce una libreria di riferimento per lo screening degli analoghi del fentanil da un campione sconosciuto. I pattern di frammentazione RT, K, isotopica e MS riportati vengono utilizzati come qualificatori durante l'elaborazione dei dati e l'assegnazione sconosciuta. Rispetto all'analisi MRM LC-QQQ tradizionale, mentre LOD simili sono raggiungibili 13,19,27, il vantaggio unico è quello di eseguire lo screening per oppioidi alternativi non inclusi nel database generato utilizzando il kit FID. Ogni nuovo oppioide richiederà l'analisi utilizzando uno standard sintetico per la sua convalida finale.

Dichiarazioni

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Matthew Willetts e Melvin A. Park sono dipendenti della Bruker Daltonics Inc, il produttore dello strumento commerciale timsTOF Pro2. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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L'autore desidera ringraziare il supporto iniziale del Dr. Cesar Ramirez durante gli sviluppi iniziali del metodo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Formiato di ammonio per HPLCFluka17843-50G
Eppendorf Provette Safe-Lock per microcentrifuga con tappo a scattoFisher05-402-25
ESI-L Miscela di sintonizzazione a bassa concentrazioneAgilentG1969-85000
Kit di screening analogico del fentanil (FAS) Cayman Chemical9003237, 9003286, 9003380, 9003381kit di 250 oppioidi snthetic, 210 analoghi del fentanil, suddivisi in un unico kit e versioni di pannelli emergenti 1-4
Acido formico Optima LC/MSFisherA117-50
Colonna di protezione in onice (5 x 4,6 mm) Colonna di protezione PhenomenexCHO-7649per colonne C18
Colonna HPLC C18 monolitica Onyx (100 x 4,6 mm)Colonna PhenomenexCHO-7643Colonna LC C18 a fase inversa
Acetonitrile di grado Optima FisherA996-4
Metanolo di grado OptimaFisherA454-4
Acqua di grado OptimaFisherW7-4
PipettaFisher05-719-510kit di 1-10 & micro; L, 10-100 & micro; L, e 100-1000 µ L pipetta
Puntali per pipette 10µ LFisher94060100
Puntali per pipette 1000µ LFisher 94056710
Puntali per pipette 200µ LFisher 94060310
Impastatrice a piastreIKA MS 3 D S1IKA MS 3 digtital
Prominence LC-20 CE cromatografo liquido ultraveloceShimadzu, Giapponeequipaggiato con DGU-20A5, LC-20AD, SIL-20AC, CTO-20A, SPD-M20A, CBM-20A, SPD-20A
timsTOF ProBruker Daltonics Inc., Billerica, MAstrumento timsTOF con PASEF 

Riferimenti

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