Le cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa (AdMSC) hanno potenti proprietà immunomodulatorie utili per il trattamento delle malattie associate all'infiammazione. Dimostriamo come isolare e coltivare le AdMSC murine e la glia mista primaria, stimolare le AdMSC a sovraregolare i geni antinfiammatori e i fattori di crescita, valutare la migrazione delle AdMSC e co-coltivare le AdMSC con glia primaria mista infettata da prioni.
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Articolo metodologico
Cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa co-coltivate con glia mista primaria per ridurre l'infiammazione indotta da prioni
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono potenti regolatori dell'infiammazione attraverso la produzione di citochine antinfiammatorie, chemochine e fattori di crescita. Queste cellule mostrano la capacità di regolare la neuroinfiammazione nel contesto di malattie neurodegenerative come la malattia da prioni e altri disturbi del misfolding proteico. Le malattie da prioni possono essere sporadiche, acquisite o genetiche; Possono derivare dal ripiegamento errato e dall'aggregazione della proteina prionica nel cervello. Queste malattie sono invariabilmente fatali, senza trattamenti disponibili.
Uno dei primi segni di malattia è l'attivazione degli astrociti e della microglia e l'infiammazione associata, che si verifica prima dell'aggregazione prionica rilevabile e della perdita neuronale; pertanto, le proprietà antinfiammatorie e regolatorie delle MSC possono essere sfruttate per trattare l'astrogliosi nella malattia da prioni. Recentemente, abbiamo dimostrato che le MSC di derivazione adiposa (AdMSCs) co-coltivate con cellule BV2 o glia mista primaria riducono l'infiammazione indotta dai prioni attraverso la segnalazione paracrina. Questo articolo descrive un trattamento affidabile che utilizza AdMSC stimolate per ridurre l'infiammazione indotta dai prioni.
Una popolazione eterozigote di AdMSC può essere facilmente isolata dal tessuto adiposo murino ed espansa in coltura. La stimolazione di queste cellule con citochine infiammatorie migliora la loro capacità sia di migrare verso l'omogenato cerebrale infetto da prioni che di produrre modulatori antinfiammatori in risposta. Insieme, queste tecniche possono essere utilizzate per studiare il potenziale terapeutico delle MSC sull'infezione da prioni e possono essere adattate per altre malattie neuroinfiammatorie e di misfolding proteico.
Introduzione
L'infiammazione gliale svolge un ruolo chiave in una varietà di malattie neurodegenerative, tra cui il Parkinson, l'Alzheimer e la malattia da prioni. Sebbene l'aggregazione proteica anomala sia attribuita a gran parte della patogenesi della malattia e della neurodegenerazione, anche le cellule gliali svolgono un ruolo nell'esacerbare questo 1,2,3. Pertanto, mirare all'infiammazione indotta dalla glia è un approccio terapeutico promettente. Nella malattia da prioni, la proteina prionica cellulare (PrPC) si ripiega erroneamente nella proteina prionica associata alla....
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Protocollo
I topi sono stati allevati e mantenuti presso il Colorado State's Lab Animal Resources, accreditato dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento di Lab Animal Care International, in conformità con il protocollo #1138, approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso la Colorado State University.
1. Isolare e infettare la glia mista corticale primaria con i prioni
- Per isolare la glia mista primaria contenente sia astrociti che microglia, ottenere cuccioli di topo C57Bl/6 di età compresa tra zero e due giorni.
NOTA: Questo protocollo è adattato dai precedenti protocolli
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Risultati
La stimolazione delle AdMSC con TNFα o interferone-gamma (IFNγ) per 24 ore induce cambiamenti nell'espressione di molecole antinfiammatorie e fattori di crescita. Il trattamento delle AdMSC con TNFα o interferone-gamma (IFNγ) aumenta l'mRNA del gene 6 stimolato dal TNF (TSG-6), mentre il TNFα, ma non l'IFNγ, provoca un aumento dell'mRNA del fattore di crescita trasformante beta-1 (TGFβ-1). La stimolazione con TNFα o IFNγ induce un aumento dell'mRNA del fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF).......
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Discussione
Qui dimostriamo un protocollo affidabile e relativamente poco costoso per valutare gli effetti delle cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa (AdMSC) nel ridurre l'infiammazione indotta da prioni in un modello di cellule gliali. Le AdMSC possono essere facilmente isolate ed espanse in coltura per l'uso in appena 1 settimana. Questo protocollo produce costantemente una popolazione eterologa di cellule che esprimono marcatori coerenti con quelli delle cellule stromali mesenchimali mediante immunofluorescenza e .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Lab Animal Resources per la loro zootecnia. Le nostre fonti di finanziamento per questo manoscritto includono il Boettcher Fund, il Murphy Turner Fund, il CSU College of Veterinary Medicine e il Biomedical Sciences College Research Council. La Figura 2A, la Figura 2C e la Figura 3A sono state create con BioRender.com.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina | Cytiva | SH30042,01 | |
| pipette sierologiche da 5 mL | Celltreat | 229005B | |
| Piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti | Celltreat | 229106 | |
| Piastre per colture cellulari da 10 cm | Peak Serum | PS-4002 | |
| Pipette sierologiche da 10 ml | Celltreat | 229210 | |
| Provette | coniche da 15 mLCelltreat | 667015B | |
| Provette coniche da 50 mL | Celltreat | 667050B | |
| BV2 linea cellulare per microglia | AcceGen Biotech | ABC-TC212S | |
| Cell lifter | Biologix Research Company | 70-2180 | |
| Microscopia elettronica cristallovioletto | Sciences | 12785 | |
| Dispase | Thermo Scientific | 17105041 | |
| DMEM/F12 | Caisson Labs | DFL14-500ML | |
| DNase-I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| Aminoacidi essenziali | Thermo Scientific | 11130051 | |
| Etanolo (100%) | EMD Millipore | EX0276-1 | |
| Siero fetale bovino (calore inattivato) | Peak Serum | PS-FB4 | Può essere acquistato come inattivato a caldo o inattivato in laboratorio |
| Formaldeide | EMD Millipore | 1.04003.1000 | |
| Pipetta sierologica in vetro da 10 ml | Corning | 7077-10N | |
| Hank' s Bilancia la soluzione salina | Sigma Aldrich | H8264-500ML | |
| Emocitometro/Neubauer | Camera Daigger | HU-3100 | |
| DMEM ad alto contenuto di glucosio | Cytiva | SH30022.01 | |
| a basso contenuto di glucosio DMEM contenente L-glutammina | Cytiva | SH30021.01 | |
| MEM/EBSS | Cytiva | SH30024. | |
| aminoacidi non essenziali | Sigma-Aldrich | M7145-100M | |
| Paraformaldeide (16%) | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Penicillina/streptomicina/neomicina | Sigma-Aldrich | P4083-100ML | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Cytiva | SH30256.01 | |
| Proteina IFN-gamma ricombinante | topo D Systems | 485-MI | |
| Proteina ricombinante di TNF-alfa (aa 80-235) di topo, FC | R& D Systems | 410-MT | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Rivestire l'interno di pipette di vetro aspirando su e giù due volte in Sigmacote e lasciando asciugare completamente. Avvolgere in un foglio di alluminio e sterilizzare in autoclave le pipette 24 ore dopo. |
| Stemxyme | Worthington Biochemical Corporation | LS004106 | Miscela di collagenasi / dispasi |
| Sterile, tampone di cotone confezionato singolarmente | Puritan Medical | 25-8061WC | |
| Inserti per colture tissutali Thincert, 24 pozzetti, dimensione dei pori = 8 & micro; m | Greiner Bio-One | 662638 | |
| Inserti per colture tissutali Thincert, 6 pozzetti, dimensione dei pori = 0,4 & micro; m | Greiner Bio-One | 657641 |
Riferimenti
- Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
- Smith, H. L., et al. Astrocyte unfolded protein response induces a specific reactivity state t....
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Ristampe e permessi
